普洱茶及其原料不同溶剂提取物体外抗氧化活性的评价.docx

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普洱茶及其原料不同溶剂提取物体外抗氧化活性的评价

科类工科编号（学号）20041048

本科生毕业论文（设计）

普洱茶及其原料不同溶剂提取物体外抗氧化活性的评价

AntioxidantactivityassessmentoftheextractionsfromYunnanpu-erhteausingdifferentsolvents

何享

指导教师：

龚加顺职称：

教授

云南农业大学昆明黑龙潭650201

学院：

食品科学技术学院

专业：

食品质量与安全年级：

2004

论文（设计）提交日期：

2008年6月答辩日期：

2008年6月

答辩委员会主任：

袁唯

云南农业大学

2008年6月

普洱茶及其原料不同溶剂提取物体外抗氧化活性的评价

何享

（云南农业大学食品科学技术学院，昆明650201）

摘要

本文以云南普洱茶及其原料为研究对象，评价普洱茶原料提取物与普洱茶提取物的体外抗氧化活性。

采用不同溶剂（乙醇、乙酸乙酯、氯仿、正丁醇等）对晒青毛茶与普洱茶进行提取，得到不同的溶剂提取物，以标准芦丁或Vc为对照，对不同溶剂提取物清除DPPH自由基、羟基自由基（·OH）、超氧阴离子自由基（O2-·）、亚硝酸根离子（NO2-）及还原力进行系统评价。

结果表明，在试验浓度范围内，除超氧阴离子和亚硝酸根离子外，普洱茶原料提取物与普洱茶提取物对其他自由基的清除率与浓度均呈现较好的线性关系。

还原力与浓度呈现良好的线性关系。

普洱茶及其原料均具有一定的清除或抑制自由基的能力。

但是普洱茶的不同溶剂提取物在一定程度上的体外抗氧化能力略低于晒青毛茶。

普洱茶提取物对DPPH自由基的清除能力大于晒青毛茶提取物。

在还原力及清除羟基自由基、超氧阴离子自由基方面，晒青毛茶提取物清除能力大于普洱茶提取物。

其中，晒青毛茶的乙酸乙酯提取部分对羟自由基（·OH）和NO2-离子的清除效果很明显。

普洱茶的醇沉部分和正丁醇提取部分对DPPH·自由基具有较强的清除作用。

晒青毛茶的水提物和醇沉部分对超氧阴离子自由基（O2-·）的抑制作用较明显。

本试验证明普洱茶及其原料提取物具有较好的体外抗氧化活性。

关键词：

普洱茶；晒青毛茶；体外抗氧化活性

AntioxidantactivityassessmentoftheextractionsfromYunnanpu-erhteausingdifferentsolvents

HeXiang

（FacultyofFoodscienceandtechnology,YunnanAgriculturalUniversity，Kunming650201）

ABSTRACT

Inthispaper,YunnanPu-erhteaandsundriedgreenteaforresearch.EvaluationoftheantioxidativeactivityofdifferentextractsofPu-erhteaandsundriedgreentea,usingdifferentsolventssuchasethanol,ethylacetate,chloroformandalcoholwerestudied.TheeffectsdifferentextracesonthescavengingeffectsofO2-,·OH,DPPH·,NO2-freeradicalsusingrutinorVcasstandardwereallconducted.Theresultsshowedthatattheconcentrationofthetrial,withtheexceptionofsuperoxideandNO2-,extractsofsundriedgreenteaandPu-erhteashowedlinearrelationshipontheotherradicalconcentrationandclearancerate.Reductionofextractsshowedgoodlinearrelationship.Thedifferentpartsextractedbydifferentsolventsofpu-erhteaandsundriedgreenteahaveacertainabilitytoscavengeorinhibitfreeradicals.However,pu-erhteaextractsfromthedifferentsolventstoacertainextent,theinvitroantioxidantcapacityandlowersundriedgreentea.Extractsofpu-erhteaofthecapacityofscavengingDPPH·betterthansundriedgreentea.Butextracesofsundriedgreenteaofthecapacityofscavenging·OH,O2-betterthanpu-erhtea.Theresultsshowedthatthecapacityofscavenging·OHandNO2-freeradicalofextracesofsundriedgreenteabyethylacetatewasverywell.thestrongscavengingeffectofthealcoholbyPu-erhteaextracton[DPPH•]radicalswasobserved.Effectofscavengingthesuperoxideradical（O2-）ofextracesofsundriedgreenteabywaterandalcohol-partmorepronounced.ProvedthatextractsofPu-erhteaandsundriedgreenteahadgoodantioxidantactivity.

Keywords:

pu-erhtea;sundriedgreentea;antioxidantactivity

普洱茶及其原料不同溶剂提取物体外抗氧化活性的评价

1引言

本文通过不同溶剂提取分离得到不同的云南普洱茶提取物，并制备出不同浓度的提取物，对超氧阴离子自由基（O2-·）、羟自由基（OH·）、DPPH·自由基、及NO2-的清除效果进行抗氧化作用的研究，为云南普洱茶成分抗氧化作用的进一步开发利用提供一定的理论基础。

近十几年来，活性氧和自由基研究成为现代生命科学的热点，评价和筛选具有强抗氧化活性的天然资源已成为生物学、医学和食品科学研究的新趋势。

目前所公认的生物抗氧化剂主要是指可以清除自由基，抑制脂质过氧化的生物活性物质。

这些物质主要包括酚类物质、叶绿素、胡萝卜素及维生素等。

自由基是指能够独立存在的，含有一个或多个未成对电子的分子或分子的一部分。

由于自由基中含有未成对电子，因此大多数自由基都很活泼，具有高度的化学活性。

在正常情况下，人体内的自由基是处于不断产生与清除的动态平衡之中，确保机体有效、正常的生命活动。

自由基产生过多或清除过慢，它便会通过攻击生命大分子物质及各种细胞，造成机体在分子水平、细胞水平及组织器官水平的各种损伤，加速机体的衰老进程并诱发各种疾病，包括人体免疫功能的降低、衰老、癌症、肺气肿、老年性眼睛衰老（特别是白内障）以及炎症等。

羟基自由基是最活泼的自由基，也是毒性最大的自由基，它可与活细胞中的任何分子发生反应而造成损害，且反应速度快。

羟基自由基的半衰期很短，然而，由它引起的自由基链反应却可在较大范围内造成生物体的损害。

其中，生物体内氧化还原反应中，大致有2％～5％的氧会产生超氧自由基，超氧自由基的毒性是机体发生氧中毒的主要原因，表现在使核酸链断裂、多糖解聚和不饱和脂肪酸过氧化作用，进而造成遗传突变、膜损伤、酶系失灵、线粒体氧化磷酸化作用改变等一系列变化。

羟自由基为高反应性自由基。

攻击力强，对细胞等组织毒性强，毒害大。

它可以通过电子转移、加成以及脱氢等方式与生物体内的多种分子作用，造成糖类、氨基酸、蛋白质、核酸和脂类等物质的氧化性损伤，使细胞坏死或突变。

羟自由基还与衰老、肿瘤、辐射损伤和细胞吞噬等有关，羟自由基抑制率是反映药物抗氧化作用的重要指标。

追溯历史，国人饮茶已经数千年。

茶叶具有特殊的解除百毒的功能，神农时代（公元前大约2737年）“神农尝百草，日遇七十二毒，得茶而解之”。

《本草纲目》、《滇南新语》、《滇南闻见录》均记载有“普洱茶具有消食弃毒，理气去胀，清热化痰，利肠通泄，驱风醒酒”的功效。

现代研究表明：

普洱茶具有一定的保健功能。

目前国内外有关绿茶和红茶的抗氧化作用及机理研究报道很多。

近年来，普洱茶的抗氧化等生物活性已开始受到人们的重视。

普洱茶主要产于云南省澜沧江下游的思茅和西双版纳等地州，其特殊的加工工艺使茶叶中对人体有益的物质充分转化，形成了普洱茶优异的品质基础，使得它的保健功效得以体现。

普洱茶系采用大叶种茶鲜叶制成的晒青毛茶为原料，经渥堆后发酵、陈化等特殊工序加工而成，具有干茶色泽褐红、条索粗壮、耐贮耐泡，茶汤红浓明亮、陈香显著、滋味浓厚回甘，叶底红褐柔软的特点。

普洱茶性温和，有解渴提神、帮助消化、清胃生津、醒酒减肥、刮肠通泄、利尿解毒、降脂健身、降压抗癌等功效。

古往今来，深受人们喜爱。

普洱茶是一种后发酵茶，茶叶中的黑曲菌和酵母菌等微生物在一定的温度、湿度条件下，会不断生长、发酵，逐渐变成茶红素和茶褐素，产生一些对人体有益的成分。

普洱茶通过其独特的生产方式—渥堆发酵以及在贮藏陈化过程中，晒青毛茶原料中丰富的多酚类、糖类、蛋白质等多种化合物在多种好氧和厌氧微生物以及水热作用下发生一系列转化。

其中，以多酚类氧化产物为主的水溶性色素茶褐素是普洱茶汤中的最主要成分，是形成普洱茶独特风味的重要成分。

茶叶中的色素化合物有存在于茶鲜叶中的天然色素以及加工过程中形成的色素，这些色素是茶叶色泽、汤色及叶底色泽的基础[1-2]。

目前的研究报道表明普洱茶抗氧化机制大致通过以下三个途径:

①抑制或直接清除自由基的产生。

Lin,Y.S等报道了普洱茶浸提物具有很强的清除轻自由基能力和抑制氧化氮自由基（nitricoxideradicals）生成的能力[3]。

Lin,L.c.等研究表明普洱茶提取物可有效地在Fenton反应体系中发挥自由基清除作用，保护DNA超螺旋结构，防止链断裂[4]。

揭国良等研究表明普洱茶水提物中的乙酸乙酯萃取层组分和正丁醇萃取层组分对DPPH和羟自由基均有较强的清除能力[5]。

②抑制脂质过氧化。

普洱茶属后发酵茶，绿茶属不发酵茶。

普洱茶渥堆的实质是以晒青毛茶（绿茶）的内含成分为底物，在微生物分泌的胞外酶的酶促作用、微生物呼吸代谢产生的热量和茶叶水分的湿热协同下，发生的茶多酚氧化、缩合、蛋白质和氨基酸的分解、降解，碳水化合物的分解以及各产物之间的湿热、缩合等一系列反应，因此普洱茶与绿茶组成成分及抗氧化作用方面有较大差异。

大量的研究报道证实绿茶中的多酚类物质具有较强的清除自由基和抗氧化活性.尽管普洱茶中多酚的含量比绿茶类少，但用超滤分离法得到的普洱水提物经分析后得出高分子量物质（MW>300oDaltons）多于50%（w/W），且普洱茶中没食子酸的含量高于绿茶[6-7]。

普洱茶与红茶相比,普洱茶在水相中的抗氧化能力无论在总体或单个组分上均略低于红茶；两类茶水提物对某些油脂具有较好抗氧化性；乙酸乙酯萃取组分对两类茶在水相中的抗氧化性起主导作用，且红茶略高于普洱茶，在油相中均无表现明显抗氧化性[8]。

开发和研制天然植物抗氧化剂，消除氧自由基对机体的损害作用，是目前医药和食品研究中的一个重点。

目前，国内主要是对普洱茶药理作用、保健功效以及普洱茶品质与化学成分关系进行了大量研究，而在普洱茶的抗氧化性方面，国内外鲜有研究报道。

本试验内容：

提取云南普洱茶及晒青毛茶不同溶剂提取物；制备不同浓度梯度的提取物待测样；根据试验条件选择合适的清除自由基评价方法，明确评价云南普洱茶不同溶剂提取物体外抗氧化活性。

2材料与方法

2.1试验时间、地点

本试验于2007年10月-2008年3月期间，在食品质量与安全系食品分析室完成。

2.2实验材料

云南普洱茶、晒青毛茶（来自勐海国艳茶厂）

2.3主要试剂

本试验中主要用到的药品和试剂见表1。

表1主要药品和试剂

Table1Maindrugsandreagants

药品和试剂

出厂厂家

无水乙醇

天津市化学试剂三厂，分析纯

乙酸乙酯

天津市北方天医化学试剂厂

氯仿

天津市化学试剂三厂

正丁醇

天津市标准科技有限公司

浓盐酸

上海吉象化学试剂有限公司，分析纯

邻苯三酚即焦性没食子酸

国药集团化学试剂有限公司

Tris即三（羟甲基）胺基甲烷

国药集团化学试剂有限公司

FeSO4·7H2O

国药集团化学试剂有限公司

水杨酸

天津市化学试剂三厂

30%过氧化氢

天津市化学试剂三厂

亚硝酸钠

天津市风船化学试剂科技有限公司

对氨基苯磺酸

中国医药集团上海化学试剂公司

N-1-萘乙二胺盐酸盐

天津市化学试剂研究所

三氯乙酸

中国前进化学试剂厂

铁氰化钾

中国成都化学试剂厂

三氯化铁

天津市风船化学试剂科技有限公司

磷酸二氢钠

中国医药集团上海化学试剂公司

Na2HPO4·12H2O

天津市瑞金特化学品有限公司

芦丁

成都思科华生物技术有限公司

Vc

南化化学试剂厂

甲苯

天津市化学试剂三厂，分析纯

DPPH

美国Sigma-Aldrich公司

2.4试验仪器

试验中用到的主要仪器见表2。

表2主要仪器

Table2Mainequipents

仪器名称及规格

出厂厂家

722型分光光度计

上海精密科学仪器有限公司

电子天平（感量为0.0001g）

沈阳龙腾电子有限公司

HH-60水浴锅

常州市普达教学仪器有限公司

移液枪（0.01-0.1mL）

大龙医疗设备有限公司

SH10A水分快速测定仪

上海恒平科学仪器有限公司

101-3ABS恒温电热干燥箱

北京市永光明医疗仪器厂

RE-52A旋转蒸发仪

上海亚荣仪器厂

BCD-208K/A海尔冰箱

海尔集团（青岛）

2.5研究方法

2.5.1待测样的提取及水分含量的测定

2.5.1.1不同溶剂提取物的提取工艺

普洱茶及其原料经打碎过筛（40-80目）→无水乙醇浸泡（2-3次，每次一天，温度为45℃）→收集乙醇浸泡液→把茶叶晾干，挥去乙醇→加入蒸馏水（分三次浸泡，每次3小时，温度为50℃，体积比为1：

5）→合并滤液，过滤，除去杂质，75℃减压浓缩→取适量的水提物乙酸乙酯萃取3次（残留水层）→三氯甲烷萃取2-3次（残留水层）→正丁醇萃取（残留水层）→水层加无水乙醇沉淀，静置1天，过滤得到沉淀和醇溶液。

不同溶剂提取物均进行减压浓缩（回收温度一般为：

乙醇提取物，65℃；水提物，75℃；乙酸乙酯提取物，50℃；氯仿提取物，50℃；正丁醇提取物，70℃），经浓缩的样液置于55℃烘箱中烘干备用。

2.5.1.2待测样水分含量的测定

采用传统水分测定方法或采用SH10A水分快速测定仪测定待测样品水分。

传统水分测定方法：

称量皿置于105℃干燥箱中加热4小时冷却至室温称量→取样移入已知称量皿中→将称量皿置于105℃烘4小时,加盖取出,冷却后称量→再加热半小时,冷却称量（两次连续称量之差＜绝对值＞不超过0.002ｇ,即为恒重,以最小一次为准）。

SH10A水分快速测定仪测定方法：

根据SH10A水分快速测定仪的测定原理测定。

因部分样品提取的量相对较少而采用此方法。

2.5.2普洱茶及其原料不同溶剂提取物的总抗氧化能力（还原力）的测定

2.5.2.1配制试剂

0.2mol／L，pH6．6磷酸缓冲溶液的配制：

准确称取磷酸二氢钠23.996g，加水溶解并定容到1L；准确称取Na2HPO4·12H2O35.814g，加水溶解并定容到500mL；量取磷酸二氢钠溶液624mL及Na2HPO4·12H2O溶液376mL，混合定容即可。

1％铁氰化钾溶液的配制：

准确称取铁氰化钾2.5g，加水溶解并定容到250mL即可。

10％三氯乙酸溶液的配制：

准确称取三氯乙酸50g，加水溶解并定容到500mL即可。

0.1％FeC13溶液的配制：

准确称取三氯化铁0.25g，加水溶解并定容到250mL即可。

2.5.2.2具体操作

分别取0.9mL、0.7mL0.5mL0.3mL0.1mL（或0.2mL、0.1mL、0.08mL、0.06mL、0.04mL）的待测样液加水至2.5mL，加入0．2mol／L，pH6．6磷酸缓冲溶液2．5mL及1％铁氰化钾2．5mL，50℃水浴20min后急速冷却，加入10％三氯乙酸溶液2．5mL，加蒸馏水6mL，及0．1％FeC131.5mL，混匀后10min于700nm处测定吸光值，吸光值越大则还原力越强[9]。

2.5.3普洱茶及其原料不同溶剂提取物对·OH的抑制率的测定

2.5.3.1配制试剂

0.15mol/LFeSO4的配制：

准确称取4.1703gFeSO4，用蒸馏水溶解定容至100mL。

6mmol/LH2O2的配制：

准确吸取30%H2O20.3mL，用蒸馏水定容到500mL,则为6mmol/LH2O2。

2mmol/L水杨酸的配制：

准确称取0.0276g水杨酸，用无水乙醇溶解定容至100mL。

2.5.3.2实验原理

按Smirnoff方法改进，用FeSO4+H2O2产生·OH。

以·OH氧化水杨酸所得产物的吸光值表示·OH的多少，吸光度越大则·OH越多。

2.5.3.3具体操作

分别取0.15mol/LFeSO41mL，2mmol/L水杨酸1mL，不同浓度的提取物1mL（取待测液0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL加水至1mL），最后加入6mmol/LH2O21mL启动反应。

37℃反应1h，测定510nm处的吸光值。

吸光值越大，则清除·OH效果越好[9]。

按下式计算抑制率：

抑制率（％）＝[A0-（Ai-A0i）]/A0×100%

式中：

A0——用蒸馏水代替样品的对照值；

Ai——加样后的吸光度；

A0i——样品本身的本底值

2.5.4普洱茶及其原料不同溶剂提取物对[DPPH·]自由基清除能力的测定[10]

2.5.4.1实验原理

二苯代苦味肼基自由基[DPPH·]是一种稳定的以氮为中心的自由基，在517nm波长处有最大吸收。

[DPPH·]乙醇溶液呈紫色，其浓度与吸光度呈线性关。

在[DPPH·]乙醇溶液中加入待测样液后，待测样液可以与[DPPH·]自由基结合或发生替代，使[DPPH·]自由基数量减少，溶液颜色变浅，表现为：

其在517nm波长处的吸光度不断减小，直至达到稳定。

因此，可以通过在517nm波长处检测普洱茶对[DPPH·]自由基的清除效果，计算其抗氧化能力。

2.5.4.2[DPPH·]贮备液的配制

准确称取4mg[DPPH·]，先用少量甲苯助溶，再用50%乙醇溶解，并定量转入100mL容量瓶中，用50%乙醇定容，摇匀得浓度为0.04mg/mL[DPPH·]贮备液，现配现用。

2.5.4.3具体操作

分别取0.1mL、0.08mL、0.06mL、0.04mL、0.02mL待测溶液于试管中，分别加入0mL、0.02mL、0.04mL、0.06mL、0.08mL蒸馏水，再依次加入3.9mL[DPPH·]试剂，总体积为4.0mL，摇匀，静置30min，测吸光度A。

用1cm比色皿在517nm波长处测吸光值A值，记为As;将0.04mg/mL[DPPH·]溶液用1cm比色皿在517nm波长处测吸光值A值，记为Ao，按以下公式计算自由基清除率[11-12]。

清除率（%）=（1-As/Ao）×100%

2.5.5普洱茶及其原料不同溶剂提取物对超氧阴离子自由基（02-）的抑制率的测定

2.5.5.1配制试剂

50mmol/LpH8.2Tris-HCl缓冲液的配制：

准确称取6.057gTris样品，用蒸馏水定容于500mL容量瓶中，即为0.1mol/LTris溶液，取250mL此Tris溶液，再取114.5mL0.01mol/LHCl溶液混合，调pH值至8.2并定容至500mL即可。

3mmol/L邻苯三酚溶液的配制：

准确称取0.0378g邻苯三酚，用0.01mol/LHCl溶液溶解定容至100mL即可。

2.5.5.2实验原理

利用某些体系在氧化过程中有超氧阴离子自由基（02-）的生成，02-与某些化合物的作用，产生具有特定吸收的有色物质，利用分光光度计进行测定。

受试物若能清除02-，则吸光度发生变化，可间接判断受试物对02-的抑制作用。

邻苯三酚在碱性条件下迅速自氧化，自氧化过程中产生02-，02-又加速邻苯三酚自氧化速率，同时产生有色中间物质，有色中间产物的积累在滞后30-45s与时间成良好的线性关系，一般维持4min左右，随后减慢。

有色中间产物在322nm有强烈的光吸收。

由于自氧化的速率依赖于02-的浓度，消除02-则抑制自氧化反应，阻止中间产物的积累，从而评价受试物抑制02-的能力[13]。

2.5.5.3具体操作

邻苯三酚自氧化速率的测定：

取4.5mL50mmol/LTris-HCl缓冲溶液（pH8.2），4.2mL蒸馏水混匀后在25℃水浴中保温20min，取出后立即加入在25℃预热过的3mmol/L邻苯三酚0.3mL，迅速摇匀后倒入比色杯，420nm下每隔30s测定吸光度[14]，计算线性范围内每分钟内吸光度的增加，以10mmol/LHCl溶液配制空白管作为对照，记录结果。

加入不同溶剂提取物后邻苯三酚自氧化速率的测定：

按照上述步骤在加入邻苯三酚前先分别加入0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL不同的待测液，蒸馏水减少。

同样以10mmol/LHCl溶液配制空白管作为对照。

测定吸光度。

2.5.5.4计算抑制率

抑制率（％）＝（△A1/△t-△A2/△t）/△A1/△t×100%

式中：

△A1/△t——邻苯三酚自氧化时反应速率;

A2/△t——加入样品液后邻苯三酚自氧化时反应速率

2.5.6普洱茶及其原料不同溶剂提取物对N02-离子清除作用的测定

2.5.6.1实验原理

N02-在酸性条件下，与对氨基苯磺酸发生重氮化反应生成重氮盐，此重氮盐与显色剂盐酸萘乙二胺盐发生偶合反应．生成紫红色的偶氮化合物，故可用比色法测定N02-含量。

2.5.6.2具体操作

分别量取不同浓度梯度的不同溶剂提取物水溶液、Vc水溶液放于25mL具塞试管中，加入5ug/mL的亚硝酸钠溶液lmL然后置于37℃水浴锅中反应30min，各加入0.4％对氨基苯磺酸lmL摇匀静置5min；再加入0.2％盐酸萘乙二胺显色剂0.5