荧光定量PCR.docx

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荧光定量PCR

一、样品RNA的抽提

1.匀浆将-80℃冻结的RNA提取样品迅速转移至用液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状，向研钵中加入与样品匀浆量匹配的适量的RNAisoPlus，并将组织样粉末覆盖。

2.抽提室温放置5min，使核蛋白复合物完全溶解后转移至1.5mL无酶离心管中，室温静置5min，12000r/min，4℃离心15min；小心吸取上清液移入新离心管，加上清液的1/5体积量的氯仿，静置10min；12000r/min，4℃离心10min。

（此时分三层：

无色上清液、白色蛋白层、带颜色的下层有机相）；

3.RNA沉淀吸取上清液移至新离心管，切勿吸入中间蛋白层，向上清液中加入与上清液等量体积的异丙醇。

颠倒混匀后室温静置10min，12000r/min，4℃离心5min（此时底部会出现沉淀）；

4.RNA洗涤移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入1ml的75%乙醇（用DEPC水或无酶无菌水配制，超净台中配制），清洗RNA沉淀。

混匀后，4℃下12000r/min离心5分钟。

5.RNA溶解吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。

加入无RNA酶的水20-40μL用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。

二、RNA浓度和质量的测定

1.1%-1.2%琼脂糖电泳检测RNA的完整性：

将从肌肉中提取的总RNA吸取5μＬ，加入1μL6XLoadingBuffer,混匀，点入1%琼脂糖凝胶点样孔中，120V电压电泳，经凝胶成像系统检测条带。

2.核酸蛋白分析仪检测OD；吸取2μL的RNA检测OD260/OD280检测含量与纯度，A260／A280在1.9-2.1之间，说明提取的总ＲＮＡ质量很好，记录稀释后RNA的Conc值（浓度）。

三、实时定量引物

实时定量引物根据NCBI公布的基因序列，依据实时定量引物设计原则，使用软件Primer5.0设计，管家基因引物引用参考文献所列，引物由上海生工有限公司合成。

四、反转录

宝生物（大连）工程有限公司TaKaRaPrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser（PerfectRealTime）进行反转录，体系及步骤如下；

1.反转录制备cDNA第一链

采用SYBRGreenqPCR法反转录，体系如表。

试剂

添加量（μL）

步骤１的反应液

10.0

PrimeScriptRTEnzymeMixⅠ

1.0

RTPrimerMix*4

1.0

5XPrimeScriptBuffer（forRealTime）

4.0

RNaseFreedH2O

4.0

Total

20

按表成分在冰上配制反应液。

为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，应先按反应数+2的量配制MasterMix，然后再分装10μＬ到每个PCR反应管中。

轻柔混匀后立即进行反转录反应。

反转录条件；37℃15min；85℃５sec；4℃24ｈ。

经过反转录反应得到的cDNA浓度为50ng/μL，将反转录产物于４℃冰箱中保存。

2.实时定量PCR扩增

本试验应用CFX96TMPCRDetectionSystem扩増仪的操作方法。

使用TaKaRaSYBR⑧PremixExTaqTMⅡ（TLiRNaseHPlus）进行实时定量PCR扩增。

（1）实时定量PCR反应体系

以上一步反转录获得的cDNA为模板，按表组份配制ＰＣＲ反应液（反应液配制在冰上进行）。

以GAPDH基因作为参照基因，对样品中MyHCⅠ、MyHCⅡａ、MyHCⅡｂ、MyHCⅡｘ基因在RNA水平进行相对定量分析。

目的基因与管家基因分别做３-４个平行样，每个岁龄的羊做10只平行，４次重复。

PCR反应体系如表：

（2）将配置好的反应体系装入12排八联管中，放入实时定量PCR仪中进行扩増。

设置ＰＣＲ反应条件为：

（3）经ＰＣＲ扩増反应后，将产物于４℃冰箱中保存。

3.PCR反应产物检验

吸取2μL的PCR反应产物，加入6XLoadingBuffer混匀，点入1.0%琼脂糖凝胶点样孔中，120V电压电泳，用凝胶成像系统检测PCR反应产物的质量。

五、数据统计分析

实时定量PCR数据分析方法：

本试验采用２-△△Ｃｔ法，计算公式：

（１）相对表达量（foldchange）＝２-△△Ｃt；（２）△△Ｃｔ＝（Ｃｔ目的基因-Ｃt内参基因）处理组-（Ｃt目的基因-Ｃt内参基因）未处理组。

1. 紫外吸收法测定

先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。

然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:

100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。

（1）浓度测定

A260下读值为1表示40μgRNA/ml。

样品RNA浓度（μg/ml）计算公式为：

A260 ×稀释倍数×40μg/ml。

具体计算如下：

RNA溶于40μlDEPC水中，取5μl，1:

100稀释至495μl的TE中，测得A260 =0.21RNA浓度=0.21×100×40μg/ml=840μg/ml或0.84μg/μl取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35μl，剩余RNA总量为：

35μl×0.84μg/μl=29.4μg 

（2）纯度检测 

RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。

2. 变性琼脂糖凝胶电泳测定

（1）制胶

1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10ml的10×MOPS电泳缓冲液和18ml的37%甲醛溶液（12.3M）

10×MOPS电泳缓冲液

浓度 成分

0.4M MOPS，pH7.0

0.1M 乙酸钠

0.01M EDTA

灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25μl溶液。

胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。

（2）准备RNA样品 

取3μgRNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10μg/ml。

加热至70℃孵育15分钟使样品变性。

（3）电泳

上样前凝胶须预电泳5min，随后将样品加入上样孔。

5-6V/cm电压下2h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2-3cm。

（4）紫外透射光下观察并拍照 

28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提RNA的物种类型），上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。

还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖体RNA）组成。

在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。

RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。

用数码照相机拍下电泳结果。

三、样品cDNA合成

1. 反应体系

序号     反应物     剂量

1     逆转录buffer   2μl

2    上游引物     0.2μl

3    下游引物      0.2μl

4     dNTP      0.1μl

5   逆转录酶MMLV  0.5μl

6    DEPC水       5μl

7     RNA模版      2μl

8     总体积      10μl

轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。

2. 混合液在加入逆转录酶MMLV之前先70℃干浴3分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5μl，37℃水浴60分钟。

3. 取出后立即95℃干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存于-80℃待用。

四、梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因（β-actin）实时定量PCR

1. β-actin阳性模板的标准梯度制备阳性模板的浓度为1011，反应前取3μl按10倍稀释（加水27μl并充分混匀）为1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104，以备用。

2. 反应体系如下：

标准品反应体系

序号     反应物        剂量

1   SYBRGreen1染料     10μl

2   阳性模板上游引物F     0.5μl

3   阳性模板下游引物R     0.5μl

4       dNTP      0.5μl

5        Taq酶      1μl

6     阳性模板DNA      5μl

7       ddH2O       32.5μl

8       总体积      50μl

轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。

3. 管家基因反应体系：

序号  反应物            剂量

1   SYBRGreen1染料      10μl

2   内参照上游引物F      0.5μl

3  内参照下游引物R       0.5μl

4   dNTP             0.5μl

5 Taq酶            1μl

6   待测样品cDNA        5μl

7   ddH2O             32.5μl

8 总体积            50μl

轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。

3. 制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为：

93℃　2分钟，然后93℃1分钟，55℃2分钟，共40个循环。

五、制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板

1. 针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。

2. 反应体系

序号  反应物         剂量

1   10×PCR缓冲液      2.5ul

2   MgCl2溶液      1.5ul

3   上游引物F        0.5ul

4   下游引物R        0.5ul

5   dNTP混合液      3ul

6   Taq聚合酶       1ul

7   cDNA         1ul

8   加水至总体积为      25ul

轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。

35个PCR循环（94℃1分钟；55℃1分钟；72℃1分钟）；72℃延伸5分钟。

（3）PCR产物与DNALadder在2％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。

（4）将PCR产物进行10倍梯度稀释:

将PCR产物进行10倍梯度稀释:

设定PCR产物浓度为1×1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。

六、待测样品的待测基因实时定量PCR

1. 所有cDNA样品分别配置实时定量PCR反应体系。

2. 体系配置如下：

序号   反应物           剂量

1    SYBRGreen1染料   10ul

2  上游引物         1ul

3  下游引物         1ul

4     dNTP           1ul

5    Taq聚合酶        2ul

6    待测样品cDNA       5ul

7    ddH2O           30ul

8    总体积          50ul

轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。

（3）将配制好的PCR反应溶液置于RealtimePCR仪上进行PCR扩增反应。

反应条件为：

93℃2分钟预变性，然后按93℃1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，共40做个循环，最后72℃7分钟延伸。

七、实时定量PCR使用引物列表

引物设计软件：

PrimerPremier5.0，并遵循以下原则：

引物与模板的序列紧密互补；引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；引物不在模板的非目的位点引发DNA聚合反应（即错配）。

八、电泳

各样品的目的基因和管家基因分别进行RealtimePCR反应。

PCR产物与DNALadder在2％琼脂糖凝胶电泳，GoldView染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。

PCR-SSCP分析的基本程序为：

首先PCR扩增特定靶序列，然后将扩增产物变性为单链，进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。

在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，DNA单链的迁移率除与DNA链的长短有关外，更主要的是取决于DNA单链所形成的构象。

在非变性条件下，DNA单链可自身折叠形成具有一定空间结构的构象。

这种构象由DNA单链碱基决定，其稳定性靠分子内局部顺序的相互作用（主要为氢键）来维持。

相同长度的DNA单链其顺序不同，甚至单个碱基不同，所形成的构象不同，电泳迁移率也不同。

PCR产物变性后，单链产物经中性聚丙烯酰胺凝胶电泳，靶DNA中含单碱基置换，或数个碱基插入或缺失等改变时，因迁移率变化会出现泳动变位，从而可将变异DNA与正常DNA区分开。

由此可见，PCR-SSCP分析技术是一种DNA单链凝胶电泳技术，它根据形成不同构象的等长DNA单链在中性聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率变化来检测基因变异。

该技术已被广泛用于癌基因和抗癌基因变异的检测、遗传病的致病基因分析以及基因诊断、基因制图等领域。

为了高灵敏特异性地显示SSCP分析结果，现已发展多种PCR-SSCP技术，各有其优势及适用领域。

例如，可以在PCR扩增中用同位素或荧光素等标记引物或核苷，也可以在电泳后用银染或溴化乙锭染色以显示结果。

这里将重点介绍最常用的放射性同位素PCR-SSCP法。

在进行PCR扩增特定靶基因序列时，利用γ-32P-ATP标记引物或直接在PCR反应体系中加入α-32P-dCTP进行PCR扩增，使扩增产物带有同位素标记物，然后将扩增产物变性为单链进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，放射自显影显示结果。

利用引物标记或碱基掺入法使PCR扩增产物带有同位素标记物，均可使产物信号增强几个数量级。

二者相比较，前者经济、扩增特异性强，多用于大样本的检测和筛选；后者操作简便，适于一般实验室开展，可用于小样本或大样本的检测和筛查。

本节仅介绍同位素标记碱基掺入法。

一、试剂准备

⒈　PCR相关试剂

⒉　α-32P-dCTP

⒊　30％聚丙烯酰胺（29：

1）：

丙烯酰胺29g、甲叉双丙烯酰胺1g，溶于100mlddH2O中，4℃保存。

⒋　10％过硫酸铵配制方法：

1g过硫酸铵，溶于10mlddH2O中，4OC保存（可用数周）。

⒌　TEMED（N，N，N，N’，N’-四甲基乙二胺）

⒍5×TBE缓冲液：

Tris碱54g、硼酸27.5g、0.5MEDTA（pH8.0）20ml，加ddH2O至1000ml。

7．变性上样液：

95%甲酰胺、0.03%二甲苯青、0.05%溴酚蓝、20mMEDTA（pH8.0）

二、操作步骤

⒈PCR扩增

反应总体积为10μl，在0.5ml微量离心管中加入下列反应成分：

10×buffer　1μl

dNTPmix　　70μM

DNA模板100ng

引物及TaqDNA酶依实验设计要求按比例加入

α-32P-dCTP　0.1μl

加ddH2O至10μl

按实验设计循环参数进行扩增，获取扩增产物。

⒉聚丙烯酰胺凝胶电泳

⑴电泳槽玻璃板的处理：

用洗涤剂清洗玻璃板，自来水反复冲净洗涤剂，双蒸水冲洗3次，晾干，95％乙醇擦拭，自然干燥。

用棉签沾取SigmaCote涂于玻璃的贴胶面上，5～10min后再用软纸擦拭除去多余的SigmaCote溶液。

在两块玻璃内的两侧放好衬条对齐，用固定夹夹紧两块玻璃，并用玻璃胶带封边。

⑵制胶：

按照被分离DNA片段的大小、含量及玻璃板、衬条的大小决定凝胶的浓度与体积，一般来讲使用5％～8％的凝胶较为合适。

轻轻摇匀配制的胶液于真空抽气（开始时要缓慢）除气泡，加35μlTEMED至聚丙烯酰胺混合液中，混匀。

用10ml玻璃吸管或50ml注射器吸取胶液，将玻璃模具倾斜成60O角，缓慢注入两玻璃板间的空隙中，直至灌满模具顶部。

立即插入相应的点样梳，（小心勿使梳齿下带进气泡，并且不要将梳齿全部插入胶内，留约2mm梳齿于玻璃板上端，以免拔梳子时把胶孔拔断）。

由于凝胶在聚合过程中有回缩，所以应小心添加些胶液于梳子处，水平放置，室温聚合1hr。

将封口玻璃胶带掀去，放入电泳槽，凹型玻璃贴紧电泳缓冲液槽，用大号固定夹固定住两侧。

在上下电泳槽内灌入1×TBE电泳缓冲液。

小心取出点样梳，用槽内的缓冲液反复冲洗点样孔，以去除可能存在的未聚合的聚丙烯酸胺和气泡。

⑶扩增产物的处理：

将PCR扩增产物与变性上样液按1：

5的比例加入0.5ml微量离心管中，混匀。

样品上胶前应98℃变性10min，立即冰浴骤冷。

取约3～5μl变性样品（根据点样孔的大小决定上样量），以微量加样器上样，（上样时要注意不要有气泡冲散样品，而且速度要快，时间长了样品易于扩散）。

⑷电泳：

电泳槽接上电极（上槽接负极，下槽接正极）开启电源，根据扩增片段的大小及电泳槽和凝胶的大小，决定电泳的电压及电泳时间。

通常室温下以l～5V／cm电泳。

⑸剥胶：

电泳结束后，倒弃电泳缓冲液，取下电泳胶玻璃，用塑料楔子从玻璃板底部一角小心分开玻璃，凝胶应附着在一块玻璃上，切去凝胶左上角，作为点样顺序标记。

剪一张与玻璃同样大小的滤纸，严密覆盖于凝胶上，顺一个方向将凝胶缓慢取下，用保鲜膜盖于胶面并包好，避免膜和胶之间产生气泡或皱折，将凝胶固定在X线片夹中。

⑹放射自显影：

在暗室中将X线片贴于胶面，盖严片夹，用黑布将X线片夹包裹，置-70OC放射自显影。

曝光时间根据同位素的强度而定，约24h～10d。

⑺冲洗胶片从-70oC取出X线片夹，在暗室内迅速取出X线片，立即显影，以免使X线片上出现过多的冷凝水。

（如果想再得到一张放射自显影影像，可立即在片夹中装一张新X线片并尽快放回到一70oC继续显影。

如果来不及再加入新片即已出现冷凝水则应使样品凝胶和X线片夹都恢复到室温，并擦去冷凝水后再装入新的X线片）。

依次按以下程序操作进行显影：

X线片显影液显影1-5min

水洗lmin

定影液定影5min

流动水冲洗15min

所有使用液的温度应为18～20OC为宜。

三、注意事项

⒈核酸片段的大小:

用于SSCP分析的核酸片段越小，检测的敏感性越高。

对于<200bp的片段，SSCP可发现其中70％的变异；对于300bP左右的片段则只能发现其中50％的变异；而＞500bp的片段，则仅能检出10％～3O％的变异，因此，<300bP，尤其是150bP左右的核酸片段更适于SSCP分析。

对于大于400bp的PCR产物就需要设法进一步处理，可以用限制性酶消化PCR产物，产生小于400bP的DNA片段，再进行SSCP分析。

⒉游离引物:

游离引物可能同PCR产物结合而改变其泳动率，即使游离引物量为6nM都有明显影响。

因此，应尽可能除去游离引物。

可以采用不对称引物扩增方法，尽可能消耗多余的引物。

也可以运用过柱或磁性球方法纯化PCR产物。

或者是稀释PCR产物，减少游离引物的干扰。

⒊低浓度变性剂:

凝胶中加入低浓度的变性剂，如5％-10％甘油、5％尿素或甲酸胺、10％二甲亚砜（DMSO）或蔗糖等有助于提高敏感性，可能是因为轻微改变单链DNA的构象，增加分子的表面积，降低单链DNA的泳动率。

但有些变异序列却只能在没有甘油的凝胶中被检出。

因此，对同一序列使用2～3种条件做SSCP，可能提高敏感性。

⒋电泳温度:

一般认为保持凝胶内温度恒定是SSCP分析最关键的因素，温度有可能直接影响DNA分子内部稳定力的形成及其所决定的单链构象，从而影响突变的检出。

室温下电泳适于大多数情况，但由于在电泳时温度会升高，为确保电泳温度相对恒定，应采取以下措施：

减少凝胶厚度，降低电压，有效的空气冷却或循环水冷却等。

⒌凝胶的长度:

可用测序板进行SSCP分析，凝胶板长度在40cm以上。

⒍凝胶浓度及厚度:

凝胶浓度很重要，一般使用5％～8％的凝胶，凝胶浓度不同，突变带的相对位置也不相同，如果在进行未知突变种类的SSCP分析时，最好采用两种以上凝胶浓度，这样可以提高突变种类的检出率。

凝胶的厚度对SSCP分析也很重要，凝胶越厚，背景越深，在上样量较多的前提下，尽量使凝胶越薄越好。

⒎假阴性:

一般认为，如没有污染，PCR－SSCP分析不存在假阳性结果，但可能出现假阴性结果，后者是由于点突变引起的空间构象变化甚微，迁移率相差无几所致，尤其是点突变发生在扩增片段的两端时。

如果有阳性和阴性对照，结果可以重复确定的突变带是可信的，如果没有阳性对照，应经测序来确定其是否为突变带。

由于PCR－SSCP的不足之处主要是可能检出假阴性结果。

应通过设置阳性对照，摸索电泳条件，假阴性结果在很大程度上是可以避免的。

但对未知基因变异的检测，假阴性结果就难以百分之百地消除。

8.结果分析:

单链凝胶电泳时，互补单链迁移率不同，一般形成两条单链带。

PCR产物进行单链凝胶电泳之前，通过加热变性产生单链。

如变性不彻底，残留双链亦可形成一条带．因此，PCR－SSCP分析结果至少显示三条带。

但是，由于一种DNA单链有时可形成两种或多种构象，检出三条或四条单链带就不足为奇。