质粒DNA提取定量酶切与PCR鉴定实验报告.docx
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质粒DNA提取定量酶切与PCR鉴定实验报告
质粒DNA提取定量酶切与PCR鉴定实验报告
粒质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR判定一、实验目的1.学习并掌握用碱裂解法提取质粒DNA的要领；2.学习并掌握了解质粒酶切判定的要领；3.学习并掌握紫外吸收检测DNA浓度和纯度的原理和要领；4.学习并掌握PCR基因扩增的实验原理和操纵要领；5.学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳的原理和使用要领。
二、实验原理1.PCR（多聚酶链式反响）
在DNA聚合酶催化下，可以DNA为模板，以特定引物为延伸起点，以dNTP为原料，通过变性、退火、延伸等步调，在体外（缓冲液中）复制DNA，使目的DNA按2n方法呈指数形式扩增。
PCR一次循环的具体反响步调为：
A.变性：
加热反响系统至95℃，使模板DNA在高温下完全变性，双链解链。
B.退火：
逐渐低落溶液温度，使合成引物在低温（35－70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右），与模板DNA互补退火形成部分双链。
C.延伸：
溶液反响温度升至中温72℃，在Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。
2.质粒DNA的提取与制备
（1）.碱裂解法：
染色体DNA与质粒DNA的变性与复性存在差别：
A.高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA均变性； B.当以高盐缓冲液调治其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并生存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。
（2）.离心层析柱：
A.硅基质膜在高盐、低pH值状态下可选择性地结合溶液中的质粒DNA，而不吸附溶液中的卵白质和多糖等物质；B.通已往卵白液和漂洗液将杂质和其它细菌身分去除；C.低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。
3.质粒DNA的定量阐发（紫外分光光度法）：
A.物质在光的照射下会产生对光的吸收效应，且其对光的吸收是具有选择性；B.种种差别的物质都具有其各自的吸收光谱:
DNA分对波长260nm的紫外光有特异的吸收峰卵白质对波长280nm的紫外光有特异的吸收峰碳水化合物对230nm的紫外光有特异的吸收峰C.A260/A280及A260/A230的比值可以反响DNA的纯度；A260/A280=1.8
DNA纯净A260/A280<1.8
体现样品中含卵白质（芳香族）或酚类物质
A260/A280>1.8
含RNA杂质，用RNA酶去除。
4.质粒DNA的酶切判定：
限制性内切酶是DNA重组操纵历程中所使用的根本东西。
限制性内切酶能特异性地与一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA序列结合，或是与其四周的特异位点结合，并在结合位点切割双链DNA。
5.琼脂糖凝胶电泳：
琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的巨细决定于琼脂糖的浓度。
DNA分子在碱性情况中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应：
差别的DNA，分子量巨细及构型差别，电泳时的泳动率就差别，从而分出差别的区带（迁移速度与分子量的对数值成反比干系）.
三、质料与要领：
：
（一）
实验质料：
：
1.PCR仪器：
PCR仪、台式离心机、微量加样枪、灭菌的薄壁离心管质料：
菌液【大肠杆菌DH5a菌株（pMD19-T质粒,含目的片段-绿色荧光卵白GFP）】、无菌去离子水、2_____Premi_Taq、引物2.
质粒DNA的提取与制备仪器：
恒温培养箱、台式离心机、离心层析柱、Eppendorf管、微量加样枪、离心管质料：
溶液P1（S1）、溶液P2（S2）、溶液P3（S3）、去卵白液PE（W1）漂洗液WB（W2）、洗脱液EB（Eluent）、含pMD19-T质粒的大肠杆菌DH5alpha;3.
质粒DNA的定量（紫外分光光度法）
仪器：
比色杯、紫外分光光度计、微量加样枪质料：
蒸馏水、质粒ＤＮＡ4.质粒DNA的酶切判定仪器：
1.5ml的EP管、微量加样枪质料：
无菌水、10_____M酶切缓冲液BufR、质粒DNA、HindIII（15U/ul）、EcoRI（12U/ul）5.琼脂糖凝胶电泳
仪器：
凝胶电泳系统、凝胶成像系统质料：
电泳指示剂、Gelview、TBE、琼脂糖、DNAMarker5000、电泳缓冲液
（二）实验要领
1.
.PCR
2.
.
质粒DNA的提取与制备
准备目的DNA：
菌液煮沸10min，冷冻，室温解冻后离心取上清液取0.2mlPCR反响管一只，用微量加样枪按下述顺序分别参加：
灭菌去离子水5.5mu;l、2_Premi_Taq12.5mu;l、引物1（10mol/L）1mu;l、引物2（10mol/L）1mu;l、菌液5mu;l将装有PCR反响体系的PCR反响管放入PCR仪上进行如下操纵：
①94℃预变性5分钟后开始以下循环②循环为94℃;;30秒，50℃;;30秒，72℃;;1分钟。
循环为30次③72℃5分钟④4℃
保温取1.5ml培养物参加Eppendorf管中将扩增后的基因用微量加样枪加到电泳仪的凝胶孔中
13000rpm_1min，弃上清
将PCR反响管置台式离心机中瞬时离心
3.
质粒DNA的定量（紫外分光光度法）
参加250mu;l溶液S1，吹打，使细菌沉淀疏散，彻底悬浮
参加250mu;l溶液S2，颠倒4～6次混匀（不要剧烈振荡），直到溶液变得清亮
参加350mu;l溶液S3，立即温和混匀6~8次。
13000rpm离心10min，小心取上清液（500-800mu;l）
将吸附柱放于收集管中，将上一步所得上清液参加吸附柱中，13000rpm离心3min，弃滤液
参加500mu;l去卵白液（W1），13000rpm离心1min，弃滤液
向吸附柱中参加700mu;l漂洗液W2，13000rpm离心1min，弃滤液；重复一遍空柱13000rpm离心1min，然后室温安排3min，使残留乙醇挥发取出吸附柱，放入一个洁净的离心管中，在吸附膜的中间加50mu;l洗脱缓冲液（Eluent），室温安排1min，13000rpm离心1min洗脱质粒DNA，-20℃生存备用清洗比色皿：
用微量加样枪向比色皿参加适量的蒸馏水刷洗，2~3次。
并用滤纸擦拭洁净空白比较比色测定向比色皿参加98ul蒸馏水，进行Blank调零再向比色皿参加2ul的质粒DNA，于紫外分光光度计上进行lsquo;sle��测定，记录相关数据
4.
.
质粒DNA的酶切判定
5.
琼脂糖凝胶电泳
四、结果与讨论：
（一）实验现象1.参加溶液P1，出现悬表现象；2.参加溶液P2,温和混匀，溶液会变得清亮；在一个洁净的1.5mlEP管中按顺序依次参加下述试剂
无菌水9.0mu;l、10_____M酶切缓冲液2.0mu;l、质粒DNA7.0mu;l、HindIII（15U/ul）1.0mu;l、
EcoRI（12U/ul）
1.0mu;l小心混匀试剂，将EP管置于恒温水浴箱中37℃1.5小时。
取质粒DNA、经酶切反响后的DNA片段和PCR扩增的DNA各6mu;l于三个EP管中并做好标记往每个EP管中参加1mu;lGelview染料，室温安排一分钟用微量加样枪分别各吸取10ul，按序号参加到电泳仪的凝胶孔中电泳30分钟
取出凝胶紫外光下视察，拍照
3.参加溶液P3,有白色絮状沉淀生成；4.电泳时，可视察到在电流作用下，点样的溶液出现电泳现象，电泳速度差别。
在紫外检测仪条件下，可以视察到差别的物质出现差别的电泳带。
（二）实验结果
原始实验数据丈量次数
质粒DNA浓度（ug/ml）
Ratio比值（A260/A280）
1
148
1.46
2
106
1.52
3
115
1.45平均值
123
1.47
电泳后的图片
A:
PCR目的条带
B:
酶切片段
C:
质粒DNA
（四）实验阐发1.由上数据可知，Ratio=1.47
A260/A280<1.8
表明样品中含有较多的卵白质（芳香族）
2.
在图片中，其他三类DNA与Maker相比力，可知质粒DNA的分子巨细在
2500bp-3500bp，酶切反响的质粒DNA片段分子巨细在2800-3000bp和400-500左右，PCR的DNA分子巨细在400-500bp。
根本切合预期。
（四）实验讨论1.质粒DNA中出现三条带，分别对应超螺旋质粒DNA、线性DNA和开环状质粒DNA。
这三种差别构型的分子有差别的迁移率，在一般情况下，迁移速度最快的为超螺旋型，其次为线性分子，最慢的为开环状分子，所以条带从上到下分别为：
超螺旋型DNA、线性分子、开环状分子。
2.对付实验结果中：
A260/A280<1.8的可能原因为：
A.在质粒DNA的提取实验的“取上清液”步调中吸入沉淀导致引入较多的卵白杂质，进而导致后续实验中因卵白质量较多而难以去除。
B.可能为试剂污染引起杂质卵白的引入。
3.实验中需注意的事项：
用微量加样枪加试剂时，同种试剂可以不消换吸头，每次换差别试剂时要记得换一个新吸头。
在PCR中，如果配好的反响液较多沾到管壁上，要将PCR反响管置台式离心机中瞬时离心，使反响液会合于管底，然后才将反响管放到基因扩增仪上。
在质粒DNA提取的实验中，参加溶液S2时，时间不能太久，行动要温柔，轻轻颠倒频频。
在电泳实验中，点样时枪头下伸，点样孔内不能有气泡。
在电泳中，Geldview有毒，切勿用手打仗。
思考题：
（1）碱裂解法提取质粒时，溶液I、II、III的作用分别为？
答：
溶液I：
螯合金属离子，抑制脱氧核酸酶对DNA的降解作用；有利于溶酶体的作用。
溶液II：
细胞壁肽聚糖在碱性下水解，核酸和卵白质变性。
溶液III：
酸性条件下质粒DNA复性，变性卵白-SDS+线性DNA沉淀，Na+可中和DNA。
（2）结合实验情况，如何提高限制性酶切的反响效率？
答：
①尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶。
②酶量的选择任何时候2种酶的总量不能凌驾反响体系的1/10体积，并且最大反响体系最好不要小于20ul，且酶切反响中甘油浓度应低于5%。
③底物DNA的纯度：
主要污染DNA的某些物质，如酚、氯仿、乙醇等均能抑制酶反响应尽量纯化底物。
④反响系统：
主要是反响缓冲液中的离子强度,如NaCl和Mg2+,符合离子强度可以引发酶切反响。
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