BDFACSCalibur流式细胞仪培训手册.docx

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BDFACSCalibur流式细胞仪培训手册

BD-FACSCalibur流式细胞仪培训手册

BDFACSCalibur流式细胞仪

FACS101Handbook

本课程介绍「表面抗原流式分析」有关之基础工作原理。

如希望进一步了解流式细胞技术应用，请至本公司网站订阅FACSinformation电子报.tw/bdb/index.html。

如需要本课程手册，欢迎至本公司网站下载.tw/bdb/10-5-3-1.html。

如需要免疫荧光染色方法，请至本公司网站下载.tw/bdb/10-5-4-1.html。

一、BDFACSCalibur基本结构

1.1仪器本体：

1.电源开关：

在BDFACSCalibur仪器右侧下方，先启动仪器本体，再打开计算机。

2.光学系统：

BDFACSCalibur基本配有一支波长488nm的氩离子雷射

以BDFACSCalibur基本型为例

ØFSCDiode只收488nm波长散射光

ØSSCPMT只收488nm波长散射光

ØFL1PMT荧光光谱峰值落在绿色范围（波长515-545nm）

ØFL2PMT荧光光谱峰值落在橙红色范围（波长564-606nm）

ØFL3PMT荧光光谱峰值落在深红色范围（波长>650nm）

3.仪器面板：

仪器前方面板的右下方有三个流速控制键、及三个功能控制键。

流速控制：

LO：

样品流速：

12μl/min

MED：

样品流速：

35μl/min

HI:

样品流速：

60μl/min

功能控制：

∙RUN：

此时上样管加压，使细胞悬液从进样针进入流动室。

（正常显示绿色；黄色时表示仪器不正常，请检查是否失压。

）

∙STANDBY：

无样品或暖机时之正常位置，此时鞘液停止流动，雷射功率自动降低。

∙PRIME：

去除流动室中的气泡，流动室施以反向压力，将液流从流动室冲入样品管，持续一定时间后，以鞘液回注满流动室。

PRIME结束，仪器恢复STANDBY状态。

4.储液箱抽屉：

在主机左下方之储液箱抽屉。

可向前拉开，内含鞘流液筒、废液筒、鞘液过滤器SheathFilter，及空气滤网Airfilter。

请注意气路减压阀VENTTOGGLE之位置。

∙鞘液筒：

位于抽屉左侧，容积4升。

装八分满鞘液筒，仪器可以运行大约3小时。

筒上装有液面感应器，鞘液用完时，仪器软件上会有显示。

鞘液筒盖上有金属环扣，保证鞘液筒密闭。

∙废液筒：

位于抽屉右侧，容积4升。

筒上装有液面感应器，废液盛满时，仪器软件上会有显示。

注意废液可能有潜在的生物传染性。

∙鞘液过滤器：

0.22μm过滤器，去除鞘液中的杂质，保证进入流动室的鞘液是干净的。

∙气路减压阀：

沿箭头方向移动阀门开关，鞘液筒减压，气压恢复正常。

在鞘液筒添加鞘液时，需要减压。

∙空气过滤网：

用于过滤冷却雷射的空气。

5.上样品区：

上样品区是样本管的上样位置。

它包括三个部分，一个是进样针SampleInjectionTube，将样本输入流动室，还有就是支撑架TubeSupportArm、和液滴存留系统DropletContainmentSystem。

∙进样针：

是一根不锈钢管，将细胞从样本针中吸入流动室。

进样管外有一套管，是液滴保留系统的一部分。

∙支撑架：

用于支撑样本管、并负责启动液滴存留系统。

支撑架有三个位置：

位于样本管之下的中位，样本管左侧或右侧。

液滴存留系统：

系统由支撑架、真空帮浦和外套管组成。

当支撑架位于左侧或右侧位置时，真空帮浦就会启动，将液体从外管吸入废液筒内。

上样时，须注意将支撑架位于中位，以避免过多样品被抽吸到废液筒内（当支撑架位于中位，真空帮浦停止工作）。

更换样品时，让仪器保持RUN的模式，使得进样针可以反冲；切换到STANDBY模式前，确保液路已冲洗彻底以免碎片沈积到流动室中。

1.2Macintosh计算机与打印机：

准备您的细胞样品

1.理想样品浓度调至1-10X105cells/ml？

一般实验只需0.5ml的样品。

2.细胞样品务必放至BDFALCON352052试管中，否则无法上机。

3.上机前务必去除样品中之细胞团块，以防止管路堵塞？

可使用附滤网BDFALCON试管（Cat.No.352235）或35-55μm的尼龙筛网。

4.供流式分析的样品是单细胞悬浮液，而且大部分样品都需经荧光染色。

表面抗原荧光染色的方法大致有两种：

直接免疫荧光、间接免疫荧光染色。

研究生可至本公司网站下载染色方法.tw/bdb/10-5-4-1.html

∙直接免疫荧光染色

∙Lysed-No-WashProcedure

∙Lysed-And-WashProcedure,SimulTEST&HLA-B27

∙PeripheralBloodMononuclearCellProcedure

∙LeukemiaandLymphomaProcedure1

∙LeukemiaandLymphomaProcedure2,B-cellClonalityAssay

∙间接免疫荧光染色

∙滴定抗体浓度

∙常用试剂

5.如因特殊因素无法下载上述实验方法，请e-mail：

yenchichen@.tw或austin_bdtwn@.tw。

二、开机、关机标准操作

2.1FACSCalibur开机

1.开启细胞仪电源。

2.开启其它周边配备电源，如打印机及MO机。

3.开启计算机。

4.确认鞘流液筒有八分满的FACSFlow，确实旋紧（鞘液筒容量为4L）。

5.将废液倒掉，并在废液筒中加入200ml家用漂白水（废液筒容量为4L）。

6.将减压阀方向调在加压（Pressurize）位置。

7.排除液流管路与过滤器中的气泡。

8.取下样品管，执行PRIME功能两次。

9.使用1mlPBS，HIGHRUN两分钟。

10.可开始分析样品。

2.2FACSCalibur关机

关机前必要动作：

清洗进样管和外套管，防止进样管堵塞、或有染料残留。

1.将样品支持架左移，取2mlFACSClean（10%Bleach）上样品，让仪器的真空系统抽取约1ml的液体。

2.将样品支持架回正，按HIRUN，然后让FACSClean清洗管路10分钟。

3.按Standby，取下样品管，执行PRIME功能两次。

4.取2mldH2O，重复上述步骤1-3。

5.注意最后只留约1mldH2O在试管中。

6.按STANDBY五分钟，使风扇冷却雷射后，关闭细胞仪（必要动作，以保护雷射光源。

）

7.倒掉废液，并回填200ml漂白水。

8.将减压阀放在「VENT漏气」位置。

将鞘流液筒充填至八分满。

9.退出软件“File”→“Quit”（如有对话选项，选择“Don‘tsave”）。

确认退出计算机中所有BD应用软件，所有数据数据已储存备份。

10.关闭计算机。

“Special”→“Shutdown”。

三、上机分析流程

建议首次试机避免进行大量试验，仅需准备下列样品。

（1）NegativeControl（不加任何抗体）。

（2）CD3-FITC（FL1单染）。

（3）CD19-PE（FL2单染）。

（4）CD3-FITC/CD19-PE（FL1/FL2双染）。

3.1Calibur开机

1.先开启细胞仪本体再打开计算机。

*秘技1：

如顺序相反，仪器和计算机之间无法建立正常通讯，无法执行“connecttocytometer”。

解决之道，两者都关机、然后以正确方式重开。

2.向前拉开储液箱抽屉，检查鞘液筒、废液筒水量，如需充填鞘液，将减压阀方向调在VENT位置（箭头方向）。

3.仪器会对鞘流液筒打气加压，请确认筒盖确实旋紧。

*秘技2：

将减压阀方向调在加压（向前）位置。

减压阀如在VENT（箭头方向）位置，按RUN功能键时将显示橙黄色（表示仪器不正常，请检查是否失压），正常为绿色显示。

3.2开启CellQuest软件、编辑实验文件

4.在苹果菜单下点击CELLQuest启动软件。

桌面会出现一’Untitled’实验文件，可点击实验文件的右上角的放大钮，将实验文件窗口放大。

5.从工具板中点击散点图图示。

在实验文件的空白区点击，拖曳对角线至适当大小，然后放开鼠标。

出现散点图对话方框。

6.在出现的散点图对话方框中点击PlotSource，选择Acquisition（收取），确认X和Y轴参数预设为FSC-H1024、SSC-H1024。

在颜色方框中点击MulticolorGating（收取样品时，门内细胞将出现颜色）。

点击OK。

此时实验文件会出现FSC/SSC散点图。

7.说明：

散点图（Dotplot），又称二维散点图是流式分析最常用图谱，它可以显示两个独立参数的相互关系。

在图中，横坐标X轴为为荧光1强度的相对值，单位是道数，纵坐标Y轴则通常表示荧光2或光散射强度的相对值。

仪器使用者可因应实验需求来修改所有图谱中显示之参数。

第一图X和Y轴参数分别设为FSC-H1024、SSC-H1024；第二图X和Y轴参数分别设为FL1-H1024、FL2-H1024。

修改动作为轻击图谱上X和Y轴参数，并依需要选择之（FSC：

细胞大小，SSC：

细胞折射率，FL1：

FITC绿色荧光，FL2：

PE橙色荧光，FL3：

PerCP红色荧光）。

8.从屏幕上方Plots菜单中选择DotPlot功能，可复制一个同样大小的散点图，在出现的对话方框内选择X轴：

FL1-H1024，Y轴：

FL2-H1024。

点击OK，FL1/FL2的散点图出现。

完成后可将重制图移至原图右方。

9.在工具板中选择四象限工具，在FL1/FL2散点图上拖动Quadrant的中心将它设定在（x，y）＝（101，101）处，这些象限将指定阴性/阳性区域。

建立仪器和计算机之间通讯

10.从Acquire菜单中选择ConnecttoCytometer，此时会出现AcquisitionControl对话方框。

如果无法选择ConnecttoCytometer，参考秘技#1。

如果没见到AcquisitionControl对话，可到屏幕上方Windows菜单中选择ShowAcquisitionControl。

仪器设置文件

注意：

实验数据质量，取决于最适化仪器设定文件。

仪器设定文件不能在数据收取后再更改，研究人员必须在第一次就使用正确的仪器设定文件。

仪器设定文件（Instrumentsettings），含信号器高压（Detector/Amps），阈值（Threshold），荧光补偿（Compensation）等仪器条件的组合。

一般而言，仪器设定的顺序为Detector/Amps--Threshold--Compensation。

11.检查现有仪器条件，从Cytometer菜单中选择Detectors/Amps。

出现Detectors/Amps窗口。

在Detectors/Amps窗口确认FSC与SSC为LIN（线性放大），其它FL1-3为LOG（对数放大），将其拖至空白区。

12.从Cytometer菜单中选择Threshold，出现Threshold窗口在Threshold窗口：

确认FSC为设阈参数，初步确认预设阈值52。

将其拖至空白区。

13.从Cytometer菜单中选择Compensation，确认所有预设数值皆为零。

将其拖至空白区。

3.3上样品、设置仪器

14.使仪器处于HighRUN，支撑架左移，上阴性对照管样品，支撑架回位。

确认AcquisitionControl窗口中☒Setup前需打叉或打勾（即不储存数据），点击Acquire。

调节FSC/SSC探测器（电压）

15.观察FSC/SSC图的变化。

FSC电压（Voltage）预设为E00，可调节AmpGain从1.00—9.99使主要细胞群得以清楚显示（如细胞较大，将FSC电压设置于E-1；较小细胞，将FSC电压设置于E01）。

调节SSC电压使主要细胞群得以清楚呈现。

调节FSC/SSC图的原则，在于能得到一独立离散的细胞族群，该细胞群不与其它族群、细胞碎片有重迭现象。

调整定位后，点击AcquisitionControl窗口中的Pause。

Gating圈选

细胞检品中，常含有大小不同、性质相异的细胞群体。

我们常用前方散射与侧方散射的二维位图，即散射光图谱（ScatterPlot），来圈选出不同细胞群的范围，选择性显示出有意义的细胞群体，如下图圈选白血球之淋巴细胞族群。

16.在工具板中选择多边形的Region，在FSC/SSC散点图上划定淋巴细胞R1区域（如下图）。

分析样品时，区域内细胞应会呈现成红色，可移动或改变形状来圈选有意义的细胞。

如果要删除R1区域，您可以在工具栏中点选Gates→Regionlist，以鼠标点选R1，再按Delete键删除R1区域。

删除R1区域后，可用绘图工具板，重画R1。

17.选取希望Gate的FL1/FL2散点图，从Plots菜单中选择Formatdotplot。

在出现的对话方框内，将NoGate改选G1=R1。

点击OK。

调节FL1、FL2的探测器（电压）

18.点击AcquisitionControl窗口中的Restart。

在Detector/Amps窗口中调节FL1、FL2的电压，使NegativeControl细胞群着落在所选直方图或散点图之100--101处。

19.在Threshold窗口，适当地提高FSC阈值>52，以去除碎片或低阶噪音。

唯需注意不要切掉主要细胞族群。

20.点击AcquisitionControl窗口中的Pause、Abort。

移去阴性对照管，关闭Detector/Amps、Threshold窗口，我们已设定好有意义细胞群之自体荧光。

调节荧光补偿

说明：

最适化的最后一步是调节光谱重迭。

（如是单色荧光实验可跳过此步骤）如是2色样本，必要时需调节FL2-%FL1，FL1-%FL2（若3色样本，必要时需调节FL2-%FL1、FL1-%FL2、FL3-%FL2、FL2-%FL3的补偿）。

21.HighRUN，换上单染CD3-FITC管。

点击AcquisitionControl窗口中的Acquire。

调节FL2-%FL1使FITC阳性细胞在FL1/FL2散点图的右下象限。

补偿调节可通过点击↑↓来选择或直接拖动滑标上下移动。

调节完毕，点击AcquisitionControl窗口中的Pause。

22.移去单染CD3，换上单染CD19-PE管。

点击AcquisitionControl窗口中的Restart。

调节FL1-%FL2使PE+细胞在FL1/FL2散点图的左上象限。

调节完毕，点击AcquisitionControl窗口中的Pause。

23.最后以CD3-FITC/CD19-PE双染样本上机，点击AcquisitionControl窗口中的Restart，确定三群细胞工整垂直。

当您已完成2色荧光之光谱重迭时，点击AcquisitionControl窗口中的Pause、Abort。

24.移去样本管，换上dH2O管，让仪器暂且处于Standby状态。

关闭Compensation窗口。

您已完成2色荧光之最适化。

3.4收集实验数据

决定储存细胞总数

25.预设之「储存细胞总数」为10000。

如需修改，从Acquire菜单中选择Acquisition&Storage，并在出现的窗口功，确认「CollectionCriteria」从10000ofAll，再点击OK。

26.找个档案匣准备储存数据。

从Acquire菜单中选择ParameterDescription，出现ParameterDescription对话方框。

点击Folder，并在随后出现之对话方框，选择「YourFolder」或新建活页夹，点击此对话方框的Select’YourFolder’。

27.命名即将储存之文件名：

点击ParameterDescription对话方框的File，出现文件名编辑窗口。

在CustomPrefix中：

输入文件名20031231，点击此对话方框的OK。

日期为最常用之文件名系统。

28.Optional：

如有需要，可选择或在P1-P5后的空格中输入相关参数名。

如P1：

Size,P2：

Granularity,P3：

CD3FITC。

输入参数名会存入实验档案中，显示在图谱上。

计数器Counters

29.从Acquire菜单中选择Counters.窗口会显示样品分析速率、与总数进度。

收集实验数据

30.你可以开始收集实验数据了。

HIGHRUN，将第一管样品放到检测区，在AcquisitionControl窗口中，将☒Setup改成☐Setup，此时CellQuest会自动显示YourFolder：

20031231.001为资料文件名。

点击“Acquire”便可启动样品之分析测定与数据储存。

当计算机成功地收取足够数据，会自动储存数据文件20031231.001，并会以“嘟”声告知，CellQuest会自动升幂附加档名成20031231.002。

等待下一指示。

31.你可以换上下一管样品，点击“Acquire”启动样品之分析测定与数据储存。

可继续分析直到所有检品都分析完毕。

3.5实验数据之储存与备份：

32.不建议长期使用硬盘储存数据数据，可考虑以烧光盘（如配有CD-RW）、口袋硬盘（FlashDrive）来备份大量实验数据，以免占用原有硬盘的内存，影响数据处理速度。

可将备份后之数据，拿到另一苹果计算机或个人PC进行离机分析。

33.确认所有档案皆己备份后，以鼠标圈选欲删除数据，将其拖拉至Trash筒。

退出软件

34.检品分析完毕后，记得从屏幕上方File指令栏选择SaveAs，储存实验文件，以备日后使用，不需每次重新编辑。

35.从屏幕上方Cytometer指令栏，选择InstrumentSetting，出现InstrumentSetting窗口。

点系print打印此次实验条件，可贴入实验笔记留底，再点击Save以储存此一实验的仪器条件，供日后再使用。

点系SAVE后会出现文件保存对话方框，选择文件目录及文件名（例：

YourFolder：

/YourSetting1），点击Save。

点击Done。

36.检品分析完毕后，用鼠标从屏幕上方Acquire指令栏中，选取DisconnecttoCytometer以断绝计算机与仪器间之联机。

之后如不分析数据，您可退出软件“File”→“Quit”（遇有选项永远选择“Don‘tsave”），进行关机程序。

管路清洗

37.以2ml10％漂白水取代样品，将样品架置于左位以外管吸除约1ml，再将样品架置于中位HIRUN十分钟。

改用2mlDIwater。

重复上述程序，样品架上留约1mlDIwater。

按STANDBY五分钟。

关主机、关计算机

四、数据分析

FCSlistmode数据文件：

说明：

FCSlistmode数据文件是流式细胞仪的标准格式档案（FCS2.0）。

该文件含有从流式细胞仪收取的平均10,000个细胞数的资料，含有4~6个参数。

一般软件无法打开listmode数据文件，需藉助如CellQuest,WinList,WinMDI,等Flow分析软件，才可开启、绘图、并进行分析统计。

4.1开启一CellQuest实验文件

1.从屏幕上方File菜单中选择New。

桌面会出现一’Untitled’实验文件，可点击实验文件的右上角的放大钮，将实验文件窗口放大。

4.2散点图之统计分析（双色）

2.从工具板中点击散点图图示。

在实验文件的空白区点击，然后拖动对角线至适当大小。

Plot拖曳完成后可以在右方看到DotPlot对话框。

3.在DotPlot方框中，PlotSource应预设为Analysis，可点击SelectFile钮，并用随后之方框来开启预存之SampleFiles，它们的路径位于MacHD：

BDApplications：

CellQuestFolder：

SampleFiles。

连续双击鼠标来打开次目录，找到档案后，点击Open来开启NORM001档案。

X与Y参数项会出现默认值—FSC-H256与SSC-H256，在Color方框中点击MulticolorGating，确认无误之后，点击OK便完成了一个NORM001的FSC/SSC散点图。

4.工具板中选择多角形区隔工具，将Cursor移至FSC/SSC散点图上，并沿着淋巴球聚落周边画出范围，连点击两次可关闭该区域。

你已完成R1区域的界定，我们将以此区域来圈选淋巴细胞。

（如果要删除R1区域，您可以在工具栏中点选Gates→Regionlist，以鼠标点选R1，再按Delete键删除R1区域。

删除R1区域后，可用绘图工具板，重画R1。

）

5.从Plots菜单中选择DotPlot可复制一个同样大小的散点图，屏幕上会出现一DotPlot对话方框。

点击XParameter钮来显示NORM001档案中所有的参数项（FSC,SSC,FL1,FL2）将X参数项改成「FL1-H256Gamma-1」，Y参数项改成「FL2-H256Gamma-2」。

从Gate输入栏中将NoGate改成G1=R1。

6.点击OK便完成了一个以G1圈选的FL1/FL2散点图，可将复制图