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抗氧化功能评价方法

附件1：

抗氧化功能评价方法

试验项目、试验原则及结果判定

Items,PrinciplesandResultAssessment

1试验项目

动物实验

体重

脂质氧化产物：

丙二醛或血清8-表氢氧异前列腺素（8-Isoprostane）

蛋白质氧化产物：

蛋白质羰基

抗氧化酶：

超氧化物歧化酶或谷胱甘肽过氧化物酶

抗氧化物质：

还原性谷胱甘肽

人体试食试验

脂质氧化产物：

丙二醛或血清8-表氢氧异前列腺素（8-Isoprostane）

超氧化物歧化酶

谷胱甘肽过氧化物酶

2试验原则

动物实验和人体试食试验所列的指标均为必测项目。

脂质氧化产物指标中丙二醛和血清8-表氢氧异前列腺素任选其一进行指标测定，动物实验抗氧化酶指标中超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶任选其一进行指标测定。

氧化损伤模型动物和老龄动物任选其一进行生化指标测定。

在进行人体试食试验时，应对受试样品的食用安全性作进一步的观察。

3结果判定

动物实验：

脂质氧化产物、蛋白质氧化产物、抗氧化酶、抗氧化物质四项指标中三项阳性，可判定该受试样品抗氧化功能动物实验结果阳性。

人体试食试验：

脂质氧化产物、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶三项指标中二项阳性，且对机体健康无影响，可判定该受试样品具有抗氧化功能的作用。

抗氧化功能检验方法

MethodfortheAssessmentofAntioxidativeFunction

1动物实验

实验动物

选用10月龄以上老龄大鼠或8月龄以上老龄小鼠，也可用氧化损伤模型鼠。

单一性别，小鼠每组10－15只，大鼠8－12只。

剂量分组及受试样品给予时间

实验设三个剂量组和一个溶剂对照组，以人体推荐量的10倍（小鼠）或5倍（大鼠）为其中的一个剂量组，另设两个剂量组，高剂量一般不超过30倍，必要时设阳性对照组、空白对照组。

受试样品给予时间30天，必要时可延长至45天。

实验方法

老龄动物

选用10月龄以上大鼠或8月龄以上小鼠，按血中MDA水平分组，随机分为1个溶剂对照组和3个受试样品剂量组。

3个剂量组给予不同浓度受试样品，对照组给予同体积溶剂，实验结束时处死动物测脂质氧化产物含量、蛋白质羰基含量、还原性谷胱甘肽含量、抗氧化酶活力。

D－半乳糖氧化损伤模型

原理

D-半乳糖供给过量，超常产生活性氧，打破了受控于遗传模式的活性氧产生与消除的平衡状态，引起过氧化效应。

造模方法

选25-30g健康成年小鼠，除空白对照组外，其余动物用D-半乳糖40mg－kgBW颈背部皮下注射或腹腔注射造模，注射量为10g，每日1次，连续造模6周，取血测MDA，按MDA水平分组。

随机分为1个模型对照组和3个受试样品剂量组，3个剂量组经口给予不同浓度受试样品，模型对照组给予同体积溶剂，在给受试样品的同时，模型对照组和各剂量组继续给予相同剂量D-半乳糖颈背部皮下或腹腔注射，实验结束处死动物测脂质氧化产物含量、蛋白质羰基含量、还原性谷胱甘肽含量、抗氧化酶活力。

乙醇氧化损伤模型

原理

乙醇大量摄入，激活氧分子产生自由基，导致组织细胞过氧化效应及体内还原性谷胱甘肽的耗竭。

造模方法

选25－30g健康成年小鼠（180－220g大鼠），随机分为4个组，1个模型对照组和3个受试样品剂量组，必要时可增设1个空白对照组。

3个剂量组给予不同浓度受试样品，模型对照组给予同体积溶剂，连续灌胃30天，末次灌胃后，模型组对照组和3个剂量组禁食16小时（过夜），然后1次性灌胃给予50%乙醇12ml/kgBW，6小时后取材（空白对照组不作处理，不禁食取材），测血清或肝组织脂质氧化产物含量、蛋白质羰基含量、还原性谷胱甘肽含量、抗氧化酶活力。

脂质氧化产物测定

血中过氧化脂质降解产物丙二醛（MDA）含量测定

血中过氧化脂质降解产物丙二醛（MDA）含量可采用荧光法和比色法测定，方法任选其一。

.1荧光法

.荧光法原理

MDA（malondiadehycle）是细胞膜脂质过氧化的终产物之一，测其含量可间接估计脂质过氧化的程度。

1个丙二醛（MDA）分子与2个硫代巴比妥酸（TBA）分子在酸性条件下共热，形成粉红色复合物。

以波长536nm为激发光，在550nm有最强荧光强度。

可用荧光法进行微量测定。

.仪器与试剂

仪器：

荧光分光光度计、微量加样器、恒温水浴锅、普通离心机、混旋器、具塞离心管

试剂：

10mmol/L四乙氧基丙烷（贮备液，棕色瓶4℃保存12个月），临用前用纯水稀释成1nmol/mL

29mmol/L硫代巴比妥酸工作液

硫代巴比妥酸

25mg

谷胱甘肽（还原型）1mg

用LNaOH50mL溶解（微温助溶，棕色瓶4℃保存2周）

酸水解液

LH2SO4125mL

LNa2SO4125mL

加水150mL用H2SO4调pH，加水稀释至500mL

正丁醇

以上所用玻璃器皿均需经50％硝酸浸泡24h后，再经蒸馏水、双蒸水淋洗干燥，试剂（选AR级）最好用双蒸水配制。

.实验步骤

.样品制备

全血上清液：

取血50μl加入生理盐水，2000r/min离心10min，取上清液待测。

血清样品：

取血室温静置10min，2000r/min离心10min，取上清液待测。

.标准曲线制作

将10nmol/mL四乙氧基丙烷，用双蒸水稀释成、、、、、2、3、5、10nmol/mL分别取加入酸水解液2mL、TBA工作液→混匀，避光、沸水浴60min→流水冷却至室温→3mL正丁醇振荡抽提1min→3000r/min离心5min→取上清液（正丁醇层）测荧光强度（入射狭缝，出射狭缝5nm，激发波长536nm，发射波长550nm）

以四乙氧基丙烷浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标作图。

.样品测定

试剂

空白管

样本管

标准管

10mL具塞离心管

蒸馏水

血清*

标准＃

酸水解液

2mL

TBA工作液

混匀，避光沸水浴60min，流水冷却

正丁醇

3mL

振荡抽提1min，3000r/min离心5min

*全血上清液（空白管加蒸馏水，标准管加标准、蒸馏水）

＃1nmol/mL四乙氧基丙烷（标准）

血清（或全血上清液）→加入酸水解液2mL、TBA工作液→混匀，避光、沸水浴60min→流水冷却至室温→3mL正丁醇振荡抽提1min→3000r/min离心5min→取上清液（正丁醇层）测荧光强度（入射狭缝，出射狭缝5nm，激发波长536nm，发射波长550nm）

.计算公式：

B-AB-A

过氧化脂质含量（nmol/mL血清）＝———×C×K=————×1×1

F-AF-A

B-AB-A1

过氧化脂质含量（nmol/mL血液）＝———×C×K=———×1×————

F-AF-A

A：

空白管荧光度

B：

样品荧光度

F：

四乙氧基丙烷荧光度

C：

四乙氧基丙烷浓度（1nmol/mL）

K：

稀释倍数

.2比色法

.比色法原理

MDA（malondiadehycle）是细胞膜脂质过氧化的终产物之一，测其含量可间接估计脂质过氧化的程度。

1个丙二醛（MDA）分子与2个硫代巴比妥酸（TBA）分子在酸性条件下共热，形成粉红色复合物。

该物质在波长532nm有极大吸收峰。

可用分光光法进行测定。

.仪器与试剂

仪器：

可见光分光光度计、酶标仪、微量加样器、恒温水浴锅、普通离心机、混旋器、具塞离心管。

试剂：

乙酸盐缓冲液

乙酸溶液185mL

乙酸钠溶液15mL

1mmol/L四乙氧基丙烷（贮备液，4℃保存3个月），临用前用水稀释成40nmol/mL

%十二烷基硫酸钠SDS

%硫代巴比妥酸TBA

磷酸盐缓冲液

磷酸氢二钠1920mL

磷酸二氢钾480mL

.实验步骤

.样品制备

溶血液样品：

取血20μL加入蒸馏水制成2％溶血液。

.样品测定

试剂

空白管

样品管

标准管

2％溶血液*

40nmol/mL四乙氧基丙烷

%SDS

乙酸盐缓冲液

%TBA

H2O

混匀，避光沸水浴60min，流水冷却，于532nm比色

注：

如用试剂盒，可按试剂盒的操作要求进行。

*若用血清，样品管，标准管。

.计算

B–AB–A

过氧化脂质含量（nmol/mL2%溶血液）＝————×C×K=—————×40×1

F–AF–A

B–AB–A

过氧化脂质含量（nmol/mL血清）＝————×C×K=—————×40×1

F–AF–A

空白管吸光度

B：

样品吸光度

F：

四乙氧基丙烷吸光度

C：

四乙氧基丙烷浓度（40nmol/mL）

K：

稀释倍数

组织中过氧化脂质降解产物丙二醛（MDA）含量测定

.1原理

见.

.2仪器与试剂

仪器：

可见光分光光度计、酶标仪、微量加样器、恒温水浴锅、普通离心机、混旋器、具塞离心管、组织匀浆器

试剂：

见.

.3实验步骤

.样品制备

组织匀浆样品：

取一定量的所需脏器，生理盐水冲洗、拭干、称重、剪碎，置匀浆器中，加入磷酸盐缓冲液，以20000r/min匀浆10s，间歇30s，反复进行3次，制成10％组织匀浆（W/V），3000r/min离心5－10min，取上清液待测。

.样品测定

试剂

空白管

样品管

标准管

10％组织匀浆

40nmol/mL四乙氧基丙烷

%SDS

乙酸盐缓冲液

%TBA

H2O

混匀，避光沸水浴60min，流水冷却，于532nm比色

注：

如用试剂盒，可按试剂盒的操作要求进行

.计算

B-AB-A1

过氧化脂质含量＝————×C×K=———×40×————————

（nmol/mg组织）F-AF-A×10%×1000

空白管吸光度

B：

样品管吸光度

F：

四乙氧基丙烷吸光度

C：

四乙氧基丙烷浓度（40nmol/mL）

K：

稀释倍数

血清中8-表氢氧-异前列腺素（8-Isoprostane）测定

.1原理

8-表氢氧-异前列腺素（8-Isoprostane）是体内脂质氧化应激反应稳定而具有特异性的标志物，其含量能间接反应因机体内自由基的产生而导致组织细胞的脂质过氧化程度。

.2仪器与试剂

仪器：

酶标仪、生化培养箱、微量振荡器、微量加样器、洗板机

试剂：

8-IsoprostaneKIAKit（酶联免疫试剂盒）

8-IsoprostaneEIA抗体血清、8-IsoprostaneAChE示踪物、8-IsoprostaneEIA标准品、EIA缓冲液、洗涤缓冲液、吐温20、鼠抗-兔IgG抗体、EIA示踪染色剂、EIA抗体血清染色剂、Ellman’s试剂

.3实验步骤

.样品制备

小鼠眼内眦静脉丛取血，3000r/min离心10min。

取上清液，用EIA缓冲液稀释15倍备用。

.样品测定

按试剂盒说明操作。

8-表氢氧异前列腺素标准孔浓度分别为：

500pg/mL、200pg/mL、80pg/mL、32pg/mL、pg/mL、pg/mL、pg/mL、mL

步骤

试剂

空白

NSB

标准/样品

1.加试剂

EIA缓冲液

100μL

50μL

标准/样品

50μL

AChE示踪物

50μL

抗体血清

50μL

2.培养

用封板膜盖好酶标板，并在4℃避光条件下培养18小时

3.清洗

清洗所有反应孔五次

4.加试剂

AChE示踪物

5μL

Ellman’s

200μL

5.培养

用封板膜盖好酶标板，并在常温避光条件下培养45-90分钟

6.读数

在波长412nm处测量各孔吸光度（B0在范围）

标准或样品孔吸光度—NSB孔吸光度

%B/B0=——————————————————×100

B0孔吸光度—NSB孔吸光度

以标准物的浓度的对数（log）为横坐标，%B/B0为纵坐标绘制标准曲线，亦可将数据转换成logit（B/B0）或ln[B/B0/（1-B/B0）]做为纵坐标绘制标准曲线，计算回归方程。

将样品的%B/B0值，代入方程式，计算出样品的浓度，再乘以稀释倍数，即为样品中的8-表氢氧异前列腺素浓度。

蛋白质氧化产物测定

H2O2或O2·ˉ自由基对蛋白质氨基酸侧链的氧化可导致羰基产物的积累。

羟自由基也可直接作用于肽链，使肽链断裂，引起蛋白质一级结构的破坏，在断裂处产生羰基。

羰基化蛋白极易相互交联、聚集为大分子从而降低或失去原有蛋白质的功能，蛋白质羰基含量可直接反映蛋白质损伤的程度。

蛋白质羰基形成是多种氨基酸在蛋白质的氧化修饰过程中的早期标志，它随着年龄的增长而增加。

血清中蛋白质羰基测定

.1原理

被氧化后的蛋白质羰基含量增多，羰基可与2，4-二硝基苯肼反应生成2，4-二硝基苯腙，2，4．二硝基苯腙为红棕色的沉淀，将沉淀用盐酸胍溶解后即可在分光光度计上读取370nm下的吸光度值，从而测定蛋白质的羰基含量。

.2仪器与试剂

仪器：

紫外分光光度计、酶标仪、微量加样器、生化培养箱、恒温水浴锅、低温高速离心机、混旋器、2ml离心管。

试剂：

10mmol/L2，4-二硝基苯肼（DNPH）

99毫克2，4-二硝基苯肼用50ml2mol/LHCL溶解，4℃避光保存。

2mol/LHCL

200g/L三氯乙酸（TCA）

6mol/L盐酸胍

无水乙醇乙酸乙酯混合应用液

将无水乙醇和乙酸乙酯按照体积比1：

1的比例配置成混合溶液，现用现配。

.3操作步骤

试剂

测定管

对照管

血清（血浆）

10mmol/L2，4-二硝基苯肼

2mol/LHCL

涡旋混匀1分钟，37℃准确避光反应30分钟

200g/L三氯乙酸

涡旋混匀1分钟，以4℃下，以12000r/min离心10min，弃上清，留沉淀

无水乙醇乙酸乙酯混合应用液

涡旋混匀1分钟，以4℃下，以12000r/min离心10min，弃上清，留沉淀

无水乙醇乙酸乙酯混合应用液

涡旋混匀1分钟，以4℃下，以12000r/min离心10min，弃上清，留沉淀

无水乙醇乙酸乙酯混合应用液

涡旋混匀1分钟，以4℃下，以12000r/min离心10min，弃上清，留沉淀

无水乙醇乙酸乙酯混合应用液

涡旋混匀1分钟，以4℃下，以12000r/min离心10min，弃上清，留沉淀

6mol/L盐酸胍

混匀后，37℃准确水浴15分钟

涡旋混匀，将全部沉淀溶解，以12000r/min离心15min，取上清液在370nm处比色，6mol/L盐酸胍试剂调零，测定OD值。

用双缩脲法测定血清（或血浆）蛋白质含量。

注：

如用试剂盒，可按试剂盒的操作要求进行。

.4计算公式

测定管OD-对照管OD

蛋白质羰基含量=——————————————————————×125×105

（nmol/mgprot）22×比色光径（cm）×样本蛋白浓度（mg/L）

组织中蛋白质羰基测定

.1原理

见.1

.2仪器与试剂

仪器：

紫外分光光度计、酶标仪、微量加样器、生化培养箱、恒温水浴锅、天平、匀浆器、低温高速离心机、混旋器、2ml离心管。

试剂：

10mmol/LHEPES缓冲液

克N-2-羟乙基哌嗪-2’-乙磺酸（HEPES）溶入1000ml双蒸馏水，用lNNaOH调pH至，4℃保存。

100g/L硫酸链霉素

1g硫酸链霉素，溶入10ml双蒸馏水，4℃避光保存。

10mmol/L2，4-二硝基苯肼（DNPH）

99毫克2，4-二硝基苯肼用50ml2mol/LHCL溶解，4℃避光保存。

2mol/LHCL

200g/L三氯乙酸（TCA）

6mol/L盐酸胍

无水乙醇乙酸乙酯混合应用液

将无水乙醇和乙酸乙酯按照体积比1：

1的比例配置成混合溶液，现用现配。

.3实验步骤

.样品处理

取组织，在冰的生理盐水中漂洗，以去掉表面的血迹。

加人的冰的10mmol/LHEPES缓冲液，制成10％的匀浆。

将匀浆液以3000r/min的转速，离心10min，保留上清。

取100g／L的硫酸链霉素溶液50μl，加入上清液450μl（v/v,1:

9），室温放置10min后，以11000r/min的转速，离心10min，取上清液待测。

.操作步骤

试剂

测定管

对照管

组织匀浆上清液

10mmol/L2，4-二硝基苯肼

2mol/LHCL

涡旋混匀1分钟，37℃准确避光反应30分钟

200g/L三氯乙酸

涡旋混匀1分钟，以4℃下，以12000r/min离心10min，弃上清，留沉淀

无水乙醇乙酸乙酯混合应用液

涡旋混匀1分钟，以4℃下，以12000r/min离心10min，弃上清，留沉淀

无水乙醇乙酸乙酯混合应用液

涡旋混匀1分钟，以4℃下，以12000r/min离心10min，弃上清，留沉淀

无水乙醇乙酸乙酯混合应用液

涡旋混匀1分钟，以4℃下，以12000r/min离心10min，弃上清，留沉淀

无水乙醇乙酸乙酯混合应用液

涡旋混匀1分钟，以4℃下，以12000r/min离心10min，弃上清，留沉淀

6mol/L盐酸胍

混匀后，37℃准确水浴15分钟

涡旋混匀，将全部沉淀溶解，以12000r/min离心15min，取上清液在370nm处比色，6mol/L盐酸胍试剂调零，测定OD值。

用双缩脲法测定匀浆上清液蛋白质含量。

注：

如用试剂盒，可按试剂盒的操作要求进行。

.计算公式

测定管OD-对照管OD

蛋白质羰基含量=——————————————————————×125×105

（nmol/mgprot）22×比色光径（cm）×样本蛋白浓度（mg/L）

注意事项

.1加入硫酸链霉素：

在匀浆上清液中加人硫酸链霉素溶液的作用是沉淀核酸。

核酸中的一些碱基如鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶等也含有羰基，如不去除核酸，这些碱基就会与DNPH结合，并反应生成有色物质，这些物质会增加最后溶液的吸光度，使结果偏大。

.2DHPH的溶解：

DNPH不溶于水，只能溶于稀酸和稀碱等溶液，因此，用2mol／LHC1来溶解DNPH。

设对照管是为了避免HC1与反应液中一些物质反应生成对比色有影响的物质。

.3反应体系应避光：

当蛋白质溶液中加人DNPH

进行反应时，反应体系需置于黑暗中，因为DNPH不稳定，见光会分解。

如果反应体系遇到光，DNPH分解，体系中会有剩余的没有变成蛋白质腙衍生物，对反应比色有影响。

.4去除未与蛋白质结合的DNPH：

由于DNPH在370nm左右有强烈的光吸收，因而用乙醇和乙酸乙脂混合物反复洗涤沉淀，去掉未与蛋白质结合的DNPH，否则，会增加吸光值。

抗氧化酶活力测定

SOD催化超氧阴离子自由基（O2·ˉ）生成H2O2，再由其它抗氧化酶如谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）和过氧化氢酶作用生成水，这样可以清除O2·ˉ对细胞的毒害作用。

SOD、GSH-Px在动物某些器官和人体血红细胞中的含量均有明显的增龄变化，酶活性与生物年龄的增长成反比。

消除自由基的能力与酶活性成正比。

血或组织中超氧化物歧化酶（SOD）活力测定

.1原理

O2·ˉ氧化羟胺的最终产物为亚硝酸盐，后者在对氨基苯磺酸及甲萘胺作用下呈现紫红色，在波长530nm处有极大吸收峰，可用分光光度法进行测定，当SOD消除O2·ˉ后形成的亚硝酸盐减少。

.2仪器与试剂

仪器可见光分光光度计、酶标仪、离心机、恒温水浴、匀浆器

试剂65mM磷酸盐缓冲液（PBS）

10mmol/L盐酸羟胺

盐酸羟胺，加PBS至10mL

L黄嘌呤

黄嘌呤，加NaOH溶解，加PBS至10mL

L黄嘌呤氧化酶

取10g/L黄嘌呤氧化酶加冰冷PBS至10mL

%甲萘胺

取α-甲萘胺溶于40mL沸蒸馏水，凉至室温加50mL冰醋酸，再加110mL凉蒸馏水至200mL

%对氨基苯磺酸

取对氨基苯磺酸溶于150mL温蒸馏水，加50mL冰醋酸至200mL

SOD标准品

三氯甲烷

95％乙醇（v/v）

%生理盐水

.3实验步骤

红细胞抽提液制备：

10μl全血冲入生理盐水，2000r/min离心3min，弃上清，加冰冷的双蒸水混匀，加入95％乙醇，振荡30s，加入三氯甲烷，置快速混合器抽提1min，4000r/min离心3min，分层，上层为SOD抽提液，中层为血红蛋白沉淀物，下层为三氯甲烷，记录上清液体积待测。

组织匀浆的制备：

剪取一定量的所需脏器，生理盐水冲洗、拭干、称重、剪碎，至玻璃匀浆器中加入冷生理盐水20000r/min匀浆10s，间歇30s，反复进行三次，制成1％组织匀浆，（最好用超声波发生器处理30s），使线粒体振破，以中性红－詹钠氏绿B染色证明线粒体已振碎。

以4000r/min离心5min，取上清液20μl待测。

SOD标准抑制曲线将SOD标准品用磷酸盐缓冲液配制成750U/mL的溶液，再稀释到50倍，即SOD量为15U/mL（μg/mL），用本法测定不同量的SOD标准液的百分抑制率，以百分抑制率为纵坐标，以SOD活力单位U/mL为横坐标绘制标准曲线。

对照管OD－测定管OD

SOD百分抑制率＝──────────────×100％

对照管OD

计算每mL反应液中SOD抑制率达50％时所对应的SOD量为一个单位。

（对照管OD-测定管OD）×100％

对照管OD反应液总量（6mL）

SOD活力（U/mL）＝─────────×──────────×样品稀释倍数

50％取液量

也可用酶比活法即以每管样品的百分抑制率从SOD标准曲线查出相应的SODU/mL，乘以稀释倍数（1mL/取样量）。

若样品为组织匀浆液，根据匀浆浓度或组织蛋白质含量，将单位换算为U/g组织或U/mg蛋白。

若样品为红细胞抽提液，根据血红蛋白含量，可换算为U/gHb。

样品测定步骤：

试剂

测定管

对照管

1/15mol/L磷酸盐缓冲液（mL）

样品

10mmol/L盐酸羟胺（mL）

L黄嘌呤（mL）

mL黄嘌呤氧化酶（mL）

双蒸水（mL）

混匀，37℃恒温水浴30min

%对氨基苯磺酸（mL）

%甲萘胺（mL）

混匀15min后，倒入1cm光径比色杯，以蒸馏水调零，530nm处比色测定OD值。

*A所用样品的量

红细胞抽提液

10μl

血清（或血浆）

20－30μl（溶血样品剔除）

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