制药1副本2.docx

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制药1副本2

一．名词解释

1.蓝白斑筛选：

载体上有一段β-半乳糖苷酶基因（LacZ）的α-片段（氨基端），其上有外源DNA的插入位点。

受体菌基因组中有突变的β-半乳糖苷酶基因（α-片段缺失），可以被IPTG诱导表达。

当载体被引入宿主菌时，两者之间可实现基因内互补，形成具有活性的β-半乳糖苷酶。

由α-互补而产生的lac+细菌在诱导物IPTC和生色底物X-gal存在下形成蓝色菌落；外源基因插入载体后，使载体部分lacZ失活，无法进行α-互补，带有重组质粒的细菌将产生白色菌落。

2.载体：

将外源目的DNA导入受体细胞，并能自我复制和增殖的工具。

3.抗生素：

由微生物产生，在低浓度下能杀灭和抑制病原体，但对宿主不会产生严重的副作用的物质，或使用化学方法半合成的衍生物和全合成的仿制品。

广义的抗生素还包括一些抗肿瘤药、杀虫剂和除草剂。

4.酶的固定化：

指经物理或化学方法处理，使酶（细胞）限制或固定于特定空间位置，使之不但能连续发挥催化作用，而且反应后酶又可以反复利用的技术。

5.基因治疗：

广义上来讲是指将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，以达到治疗疾病目的的方法。

6.盐析：

是利用各种生物分子在浓溶液中溶解度的差异，通过向溶液中引入一定数量的中性盐，使目的物或杂蛋白以沉淀析出，达到纯化目的的方法。

7.等电点：

等电点（pI）：

在某一PH的溶液中，氨基酸或蛋白质解离成阳离子和阴离子的趋势或程度相等，成为兼性离子，呈电中性，此时溶液的pH称为该氨基酸或蛋白质的等电点。

8.cDNA文库：

利用某种生物的总mRNA经反转录合成cDNA，再将这些cDNA与合适载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。

9.连续发酵培养：

将种子接入发酵反应器中，搅拌式培养达到一定的菌体浓度之后，同时进行进料、出料的操作，通过控制一定的营养物稀释比率，来进行不间断式培养的方式，称为连续培养。

10.融合蛋白：

将外源基因与受体菌自身的蛋白质编码基因拼接在一起，并作为一个开放型阅读框架进行表达,由这种杂合基因表达出的蛋白质称为融合蛋白。

11.愈伤组织及外植体：

外植体：

植物体上取出的用于培养和分离细胞的组织或器官愈伤组织：

植物的伤口或外植体的伤口长出的脱分化细胞的薄壁细胞团。

12.限制性内切酶：

生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。

它是可以将外来的DNA切断的酶，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。

由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶

13.生化药物：

具体运用生物化学研究方法，从生物中经提取，分离，纯化等手段获得的天然存在的生化活性物质或将上述这些物质加以结构改造或人工合成创造出自然界没有的新活性物质，统称生化药物。

14.受体细胞：

又称为宿主细胞或寄主细胞（hostcell）等，从实验技术上讲是能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞；从实验目的上讲是有应用价值和理论研究价值的细胞。

二．解答题：

1.基因工程的流程，目的基因获得的几种方法。

答：

基因工程的流程：

（1）分：

分离目的基因

（2）切：

对目的基因和载体适当切割（3）接：

目的基因与载体连接（4）转：

重组DNA转入受体细胞（5）筛：

筛选出含有重组体的受体细胞（6）表：

目的基因在受体细胞中表达，受体细胞成长为基因改造生物

目的基因获得的方法：

（1）酶切法直接分离目的基因

（2）PCR直接扩增目的基因（3）文库法分离目的基因（4）化学合成目的基因

2.酶的固定化，为什么固定化？

及其优缺点。

答：

酶的固定化：

指经物理或化学方法处理，使酶（细胞）限制或固定于特定空间位置，使之不但能连续发挥催化作用，而且反应后酶又可以反复利用的技术。

优点:

（1）可以多次使用，酶的稳定性提高；

（2）反应后，酶与底物和产物易于分开，产物中无残留酶，易于纯化；（3）反应条件易于控制，可实现催化反应的连续化和自动控制；（4）酶的利用率高，单位酶催化的底物量增加，用酶量少。

缺点：

（1）固定化过程中，可能会引起酶活性丧失；

（2）只适用于催化可溶性小分子底物的酶促反应，对大分子底物不适合；（3）通常不适用于多酶反应，尤其是需要辅助因子参与的反应。

3.单克隆抗体的制备及杂交瘤细胞的筛选方法。

答：

单克隆抗：

通过B细胞杂交瘤技术,获得特异性针对某一种抗原决定簇的细胞克隆，产生均一性的抗体.

（1）单克隆抗体的制备：

（2）杂交瘤细胞的筛选方法：

1）HAT选择系统（HAT是含有次黄嘌呤（H）+氨基喋呤（A）+胸腺嘧啶核苷（T）的一种选择性培养基。

）

2）抗药性选择系统利用生物细胞对于药物敏感性的差异程度，来筛选杂种细胞的方法，称为抗药性选择系统。

3）营养互补选择系统生物细胞在缺乏某种营养成份时就不能生长，这种细胞称为营养缺陷型细胞。

4）原位杂交法

5）基因探针选择法

4.RNAi干扰药物及相关原理。

答：

RNA干扰（RNAinterference，RNAi）：

是一种由双链RNA诱导的基因表达调控和基因沉默的过程，其广泛存在于从植物、无脊椎动物到哺乳动物的各种生物。

RNAi的作用原理:

双链RNA诱导RNAi的过程主要分为两个阶段：

Ⅰ启动阶段；Ⅱ执行阶段

Ⅰ启动阶段：

当细胞中由于感染等原因出现双链RNA分子时，细胞中一种称为Dicer的核酸酶就会识别这些双链RNA，并将其降解成21-23bp长的小干扰RNA（siRNA），单链siRNA与一些蛋白形成复合体，构成“RNA诱导的沉默小体”Ⅱ执行阶段：

当目标mRNA与RISC中的siRNA完全配对时，RISC就会切割目标RNA，并由细胞中的核酸酶将其进一步降解，从而抑制目标基因的表达5.人鼠嵌合抗体制备过程。

答：

人—鼠嵌合抗体（chimericantibody）：

在基因水平上把鼠源性单克隆抗体的H和L链的V区基因分离出来，分别与人Ig的H链和L链的C区基因连接，即成为人—鼠嵌合抗体的H和L链基因，再共转染骨髓瘤细胞，就能表达出完整的ChimericAntibody.这样既能保持鼠单抗的特性，又使获得的单抗隆降低了在人体内的免疫反应。

获得鼠源单克重轻链可变区基因→可变区基因定点突变→构建人鼠嵌合基因→构建真核表达系统

6.阳性克隆（重组子）的筛选方法。

重组克隆的筛选方法：

1）抗性筛选；质粒载体携带的筛选标记

2）蓝白斑筛选；α-互补：

lacZ由4个亚基构成；细菌表达一部分（无活性），载体表达一部分（无活性），合在一起构成有活性的lacZ可分解培养基平板中的底物X-Gal，生成蓝色物质。

（需要IPTG的诱导表达） 

   外源基因插入载体后，使载体部分lacZ失活，无法进行α-互补—白斑。

3）酶切电泳筛选；选用不同的酶切组合，通过电泳检测DNA片段的大小 

4）PCR筛选；通过特异引物扩增，电泳检测，筛选重组质粒 

5）测序验证；选取阳性克隆，送公司测序 

6）表达筛选；

7）生物活性筛选：

酶：

测定酶活； • 亲和蛋白：

与亲和底物作用。

 其它的生物活性。

抗药性检测筛选法——显色检测——限制酶切图谱检测——PCR扩增检测——原位杂交检测——序列测定双脱氧测序

7.如何提高外源基因在大肠杆菌内的表达效率？

答：

（1）外源基因在大肠杆菌中高效表达的要素a）强启动子：

决定转录启动的频率b）强终止子：

决定转录产物的均一性c）SD序列：

决定mRNA的翻译起始效率d）密码子：

不同生物体的基因对简并密码子的选择具有偏爱e）质粒的拷贝数：

mRNA的含量

（2）大肠杆菌中高效表达目的基因的策略：

①优化表达载体设计

②提高稀有密码子的表达频率③构建基因高表达受体菌④提高基因表达产物的稳定性⑤优化工程菌发酵过程

（3）提高目的基因表达水平的方法：

①利用点诱变技术使核糖体结合位点（SD序列和起始密码子ATC）周围的碱基发生突变，促进翻译的起始并提高基因表达水平

②试用不同表达水平的大肠杆菌宿主菌株

③在目的基因下游装置一段DNA序列，可以稳定mRNA或提高翻译效能

④通过改变温度、核糖体结合位点；启动子强度、质粒拷贝数或诱导物的量，从而改变目的蛋白合成的动力学。

8.生化药物制备基本流程。

答：

生化药物的提取与分离方法因原材料、药物的种类和性质不同而存在很大差异。

总的来说，其提取纯化一般分为五个步骤：

预处理、固液分离、提取、精制和成品加工（包括干燥、制丸、挤压、造粒、制片等步骤），如图所示：

生物材料、发酵或培养液↓预处理（清洗、加热、调pH、凝聚、絮凝）↓细胞分离（沉降、离心、过滤）↓细胞↓细胞破碎（高压均质处理、研磨、溶菌处理）↓收集上清液↓初步纯化（沉淀、吸附、萃取、过滤）↓高度纯化（离子交换色谱、亲和色谱、疏水色谱、吸附色谱及电泳等）↓成品加工（无菌过滤、超滤、浓缩、冷冻干燥、喷雾干燥、结晶等）9.发酵工程制备基本流程。

（种子选育，分离，几种方法，）

答：

基本流程：

菌种选育

自然界选种、诱变育种、基因工程、细胞工程↓

培养基配制根据培养基的配制原则制备，实践中需多次试验配方↓

灭菌

杀灭杂菌（胞体、孢子及芽孢）

↓

扩大培养和接种

↓

发酵过程（中心阶段）

检测进程，满足营养需要；严格控制温度、pH、溶氧、转速等

↓

分离纯化

菌体：

过滤、沉淀；代谢产物：

蒸馏、萃取、离子交换

三．设计题

1.如何从奶牛耳朵出发，去克隆一头奶牛。

参考

答：

（1）取出细胞核；

（2）从奶牛卵巢中取出未受精的卵细胞，并立即将细胞核除去，留下一个无核的卵细胞，此细胞称之为“受体细胞”；

（3）利用电脉冲方法，使供体细胞和受体细胞融合，最后形成“融合细胞”。

电脉冲可以产生类似于自然受精过程中的一系列反应，使融合细胞也能像受精卵一样进行细胞分裂、分化，从而形成“胚胎细胞”；

（4）将胚胎细胞转移到另一只奶牛子宫内，胚胎细胞进一步分化和发育，最后形成奶牛。

2.转乙肝疫苗西红柿转基因培育技术。

参考

答：

（1）获得编码抗原蛋白的基因序列：

目的基因的获得与分离：

①酶切法直接分离目的基因；

②PCR直接扩增目的基因；

③文库法分离目的基因；

④化学合成目的基因。

流程：

获得目的基因→构建重组质粒→组建基因工程细胞→工程菌培养→产物分离纯化

（2）构建表达载体，连接植物启动子

（3）阳性菌株的筛选，提取质粒

阳性菌筛选方法有：

①抗药性检测筛选法②显色检测③限制酶切图谱检测④PCR扩增检测⑤原位杂交检测⑥序列测定双脱氧测序

（4）转入农杆菌，验证，-70℃保存菌种

（5）西红柿组培技术

将消毒的西红柿外植体转接入灭菌的培养基中，此过程在超净工作台上操作。

之后将培养材料放在一定条件下使之生长，分裂和分化形成愈伤组织。

（6）农杆菌侵染愈伤组织，并分化产生西红柿苗。

农杆菌附着到植物细胞后，只留在细胞间隙中，T-DNA首先在细菌中被加工，剪切，复制，然后转入到植物细胞。

（7）转基因鉴定及培育

利用western杂交或PCR检测等技术对西红柿苗进行鉴定，并在一定条件下进行培养。

（8）临床动物实验，检测抗体。

例如获得的西红柿可喂养老鼠或兔子，检测其抗体。

四．论述题

1.以青霉素的生产为例，讲述青霉素制备的相关细节。

答：

（1）菌种选育:

自然界中分离获得的野生型菌种，通过不同的改良途径，发掘高产菌株。

（2）菌种保存：

生产菌株一般真空冷冻干燥保存分生孢子，也可用甘油或乳糖溶液做悬浮剂，超低温冷冻或在液氮中保存孢子悬浮液和营养菌丝体。

（3）发酵培养基：

葡萄糖、花生饼粉、麸质水、尿素、硝酸铵、硫代硫酸钠、苯乙酰胺和碳酸钙。

接种量约30%。

（4）优化发酵条件：

分三级发酵，由于每级发酵目的不同，因此对培养基和培养条件进行控制；发酵设备的灭菌，空气除菌。

（5）发酵过程控制：

①碳源和氮源浓度变化及其控制；②补无机盐、前体；③溶氧浓度的变化和控制；④温度控制：

青霉菌生长的适宜温度为30℃，而分泌青霉素的适宜温度为20℃左右，故采用分段变温控制法；⑤pH控制：

最适pH为6.2-6.8，青霉素在碱性条件下不稳定，易加速其水解，避免PH超过7.0；

⑥泡沫控制：

前、中期加入豆油控制，可采用间歇搅拌，豆油应当控制其用量并少量多次加入，后期尽量少加消沫剂“泡敌”与豆油交替使用。

（7）产黄青霉生产过程分为三个不同的代谢时期：

菌丝生长繁殖期、青霉素分泌期、菌丝自溶期，要求发酵过程延长分泌期，缩短菌丝生长繁殖期。

（8）通气与搅拌的控制：

青霉素深层培养需要通气与搅拌，并控制相应的溶氧量和通气比，搅拌转速在发酵各阶段应根据需要而调整。

（9）发酵液预处理：

加入草酸除钙离子，加三聚磷酸钠除镁离子，加黄血盐除铁离子，加入有机溶剂或表面活性剂使蛋白质变性。

（10）过滤：

发酵液过滤前加去乳化剂溴代十五烷吡啶PPB，采用鼓式过滤。

（11）萃取：

采用溶媒萃取法。

把两次获得的BA提取液加入活性炭脱色，过滤。

（12）青霉素成品加工：

用丁醇共沸结晶法，真空蒸馏，青霉素钠盐结晶析出；过滤，将晶体洗涤干燥后即得成品。

2.以t-PA制备为基准，设计一个基因工程药物的生产工艺流程。

答：

组织纤溶酶原激活剂是一种丝氨酸蛋白酶，属单链糖蛋白，它可使组织纤溶酶原活化成纤溶酶，而纤溶酶可水解纤维蛋白，因此组织纤溶酶原激活剂对血栓具有治疗作用。

培养基---Eagle培养基，加入青霉素100U/ml、链霉素100U/ml、10%小牛血清。

（1）工程细胞构建

（2）细胞培养（3）t-PA抗体的制备（4）抗t-PA的亲和吸附剂的制备[A]、Sepharose4B的活化[B]、抗t-PA亲和吸附剂（t-PA-IgG-Sepharoes-4B亲和吸附剂）的制备（5）t-PA的分离（6）t-PA的精制

（2）组织细胞培养

5L玻璃转瓶，按每平方米表面积2.5L的比例加入Eagle细胞培养液。

↓

将工程细胞按常规方法消化分散、洗涤、计数、稀释成细胞悬液。

↓

将细胞悬浮液接种到转瓶之中，接种浓度为3*103个/ml

↓

置于CO2培养箱中，37℃下培养、通入含5%CO2的无菌空气

↓

等到长成致密单层之后，弃去培养液，用PH=7.4、0.1mol/L的磷酸缓冲液洗涤细胞单层2-3次。

↓

换入无血清Eagle培养液继续培养

↓

每隔3-4天收获一次培养液，用于制备t-PA。

同时向转瓶中加入新培养液继续培养

↓

如此反复，可获得大量t-PA。

（3）t-PA抗体的制备

取人t-PA、或者猪心t-PA

↓

按每只家兔200-300ug的计量，t-PA采用福氏完全佐剂充分乳化，注射入家兔皮下。

↓

每隔2周再用t-PA100ug进行加强免疫，共加强2次

↓

取家兔血清

↓

用50%硫酸铵盐析

↓

沉淀物于0℃下，用生理盐水透析

↓

经过Sephadex75柱层析

↓

得到抗t-PA的免疫球蛋白IgG备用

（4）抗t-PA的亲和吸附剂的制备

[A]、Sepharose4B的活化[B]、t-PA的亲和吸附剂（IgG-Sepharoes4B亲和吸附剂）的制备

[A]、Sepharose4B的活化

Sepharose4B用10倍体积的蒸馏水（V/V）多次漂洗、布氏漏斗抽滤

↓

取20克Sepharose4B湿凝胶放入500ml的三颈烧瓶中，加蒸馏水30ml，搅均匀后，用2mol/L的NaOH溶液调节PH=11，降温至18℃

↓

在通风橱中，另取溴化氰1.5g于乳钵中，加入30-40ml蒸馏水分多次研磨溶解

↓

将溴化氰溶液倒入三颈烧瓶中，升温至20-22℃，同时滴加2mol/L的NaOH溶液调节PH=11-12

↓

等反应液PH值不变时，继续反应5分钟，取出烧瓶，向其中投入小冰块降温，用3号垂熔漏斗抽滤

↓

用300ml、4℃、0.1mol/L的NaHCO3溶液洗涤。

然后用300ml、PH=10.2、0.025mol/L的硼酸缓冲液分3-4次抽滤洗涤

↓

最后转移至250ml的烧瓶中，加入50-60ml的硼酸缓冲液，即得活化的Sepharose4B，备用[B]、t-PA的亲和吸附剂（IgG-Sepharoes4B亲和吸附剂）的制备

取抗t-PA的免疫球蛋白IgG，70-80mg溶于20ml硼酸缓冲液中、过滤。

滤液加入到已经活化的Sepharose4B中，10℃下搅拌反应16-18小时

↓

第二天装柱，用10倍柱床体积（V/V）、PH=10.2的硼酸缓冲液，以5-6ml/min的流速洗涤柱床。

收集流出液，测定其A280

↓

用5倍柱床体积（V/V）的、PH=10.0、0.1mol/L乙醇胺溶液洗涤柱床

↓

用5倍柱床体积（V/V）的、PH=8.0、0.1mol/L硼酸缓冲液洗涤柱床

↓

用5倍柱床体积（V/V）的、PH=7.4、0.1mol/L磷酸缓冲液洗涤平衡。

↓

直到流出液的A280小于0.01，所得到的固定化抗t-PA的免疫球蛋白IgG，就是待提取的t-PA的亲和吸附剂。

↓

将其转移至含0.01%NaN3的、PH=7.4、0.1mol/L的磷酸缓冲液中，于4℃下贮存，备用。

（5）t-PA的分离

步骤-2中所收集到的培养液中，加入蛋白酶抑制剂aprotinin至5万单位/ml。

加吐温-80至于0.01%、过滤、除去沉淀.滤液稀释3倍

↓

稀释液上柱，以5ml/min的流速进入IgG-Sepharoes4B亲和柱（直径4cm*长度40cm）。

↓

用含0.01%的吐温-80+2.5万单位/ml的蛋白酶抑制剂aprotinin+0.25mol/L的KSCN的PH=7.4、0.1mol/L的磷酸缓冲液以同样的流速洗涤亲和柱，以除去杂蛋白

↓

最后用3mol/L的KSCN溶液洗脱亲和柱，

以每管10-15ml的体积进行分区收集

合并t-PA的洗脱峰，

↓

装入透析袋内，埋入到PEG20000中浓缩至原体积的1/10-1/5。

↓

各t-PA粗提物（6）t-PA的精制

t-PA粗提物

↓

进Sephadex-G-150柱（直径2cm*长度100cm）

↓

用含0.01%的吐温-80的1mol/L的NH4HCO3溶液以2-3ml/min的流速进行洗脱

↓

以每管10-15ml的体积进行分区收集合并t-PA的洗脱峰，

↓

于冻干机中进行冻干

↓

得t-PA精品

HAT选择法基本原理

①培养基中的叶酸类似物氨基蝶呤（APT）阻断细胞核苷酸的全程合成途径，启动以次黄嘌呤（H）为底物的补救合成途径，该途径不受氨基蝶呤的抑制，继续合成出所需核苷酸。

→→→APT作用②由于在HAT培养基中补加有外源的胸苷（T），通过胸苷激酶（TK）的作用，tk+细胞能以其为底物合成TTP，所以tk+细胞可以继续存活下去；③而tk-细胞则不会进行这种合成作用，因而死亡。