引物设计流程.docx
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引物设计流程
2010级动科2班杨教童222010328210151
1.引物设计的原理和步骤
PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的寡核苷酸片段，其中在扩增的DNA片断5'端的引物对应于有意链DNA序列，3'端的引物对应于无意链DNA序列，使其能有效地扩增模板DNA序列。
因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。
要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。
同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。
如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。
如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。
现在可以在这一保守区域里设计一对引物。
一般引物长度为15~30碱基，扩增片段长度为100~600碱基对。
1.引物设计的原则
（1）碱基组成：
GC含量应在40%-60%（45%-55%）之间，4中碱基在引物中分配均匀。
没有多聚嘌呤或多聚嘧啶序列，如AAAAA等，没有二核苷酸重复序列，如GCGCGC等；
（2）引物长度：
引物中与模板互补的区应为18-25个核苷酸长度，上下引物长度差别不能大于3bp，如上游引物为19bp，下游引物为24bp等。
（3）重复或自身互补序列：
形成发夹结构，会阻止引物和模板之间的复性。
（4）上下引物的互补性：
一个引物的3'末端序列不允许结合到另一个引物的任何位点上，因为PCR中引物浓度较高，会形成引物二聚体。
当一个PCR有多对引物时，注意检查任何一个3'末端都不能和其他任何引物互补。
（5）解链温度（Tm值）：
计算出来的两个引物的Tm值相差不能大于5℃，扩增产物的Tm值与引物的Tm值相差不能大于10℃；引物的Tm值一般为50-70℃。
这些特性保证了扩增产物在每一个PCR循环可有效变性。
（6）3’末端
3’末端的性质非常关键。
如果可能的话，每个引物的3’末端碱基为G或C；最好不要A，或AA等多聚A；
（7）5’端序列添加限制性酶切位点：
2.用PrimerPremier5.0软件设计两对引物
（1）在网页上找到要制作引物的一段序列，最好在1000左右，比如：
ORIGIN
1atgaatccaaatcaaaagataataacaattggttctgtttctctcatcattgccacaata
61tgtttccttatgcaaattgctatcctagtaactactgtaacattacatttcaagcagcat
121gactacaactcccccgcaaacaaccaagcaatgctgtgtaaaccaacaataatagaaaga
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301tccaaggacaattcaattcggctttctgctggtggggacatctgggtgacaagagaacct
361tatgtgtcatgcgatcctgacaagtgttatcaatttgcccttgggcagggaacaacatta
421aacaacggacattcaaataacactgtacatgataggaccccttatcgaaccctattgatg
481aatgaattgggtgttccatttcatttaggaaccaggcaagtgtgcatggcatggtccagc
541tcaagttgtcacgatggaaaagcatggctgcatgtttgtataactggggatgatagcaat
601gcaacagctagcttcatttacaatgggaggcttgtagatagtattggttcatggtccaaa
661aatatactcagaacccaggagtcggaatgcgtctgtatcaatggaacctgtacagtagta
721atgactgatgggagcgcttcaggaaaagctgatactaaaatactattcgttgaggagggg
781aagatcgttcatgttagcacattgtcaggaagtgctcagcatgttgaggagtgctcctgt
841tatccacgatttcctggtgtcagatgtgtctgcagagacaactggaaaggctccaatagg
901cccatcgtagatataaatgtaaagaattatagcattgtttccagttatgtatgctcagga
961cttgttggagacacacccagaaaaggcgacagcgtcagcagtagttattgcctagatcct
1021aacaatgagaaaggtggtcatggggtgaaaggctgggcctttgatgatggaaatgacgtg
1081tggatgggaaggacaatcaacgagacgttacgcttaggttatgaaaccttcaaagtcatt
1141gaaggctggtccaaagctaactccaaattacagacaaatagacaagtcatagttgaaaag
1201ggcgacaggtccggttattctggtattttctccgttgaaggcaaaagctgcatcaatcgg
1261tgcttttatgtggagttgataaggggaaggaaagaggaaactaaagtctggtggacctca
1321aacagtattgttgtgttttgtggcacctcaggtacatatggaacaggctcatggcctgat
1381ggagcggatatcaatctcatgcctatataa
（2）将序列粘贴到制作区域
（3）点击Primer后点击Search开始搜索引物，如：
上述设计得如下一对引物
5’CCTAAGCGTAACGTCTCGT
3’TGGGAGGCTTGTAGATAGT
优点：
转化率为80%，产物长度比较长，为495bp.能够很到限度的利用所选序列的，在5’端没有A或者多聚A结构，引物的Tm值的差距小于5
，GC含量在45%到55%之间。
缺点：
引物转化率不够高，而且极易发生三类结合错误，首先，易形成引物内互补结构，形成自身互补序列，阻碍了引物与所选序列的配对；其次，两个引物之间容易形成两类不完全配对，形成引物二聚体，这样引物便不容易和DNA学列结合，减少扩增速度。
最后，两条产物链的温差大于10度，这也不利于PCR循环扩增。
此外，另外一对引物如下：
5’ATCTGACACCAGGAAATCG
3’AGTCGGAATGCGTCTGTAT
优点：
比较高的转化率，GC含量为在合理的范围之内，复合引物设计原则，Tm值是一样的，也符合引物设计原则。
缺点：
容易形成引物二聚体，5’末端有A，当末端碱基为A时，错配时引发链合成的效率大大降低；引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间。
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