引物设计流程.docx

1、引物设计流程 2010级动科2班 杨教童 2220103282101511.引物设计的原理和步骤 PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的寡核苷酸片段，其中在扩增的DNA片断5端的引物对应于有意链 DNA序列，3端的引物对应于无意链DNA序列，使其能有效地扩增模板 DNA序列。因此，引物的优劣直接关系到 PCR的特异性与成功与否。要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。现在可以在这一保守区域里设计一对引物。一般引物长度为1530碱基，扩增片段长度为100

2、600碱基对。1.引物设计的原则 （1）碱基组成：GC含量应在40%-60%（ 45%-55% ）之间，4中碱基在引物中分配均匀。没有多聚嘌呤或多聚嘧啶序列，如AAAAA等，没有二核苷酸重复序列，如GCGCGC等； （2）引物长度：引物中与模板互补的区应为18-25个核苷酸长度，上下引物长度差别不能大于3bp，如上游引物为19bp，下游引物为24bp等。 （3）重复或自身互补序列：形成发夹结构，会阻止引物和模板之间的复性。 （4）上下引物的互补性：一个引物的3末端序列不允许结合到另一个引物的任何位点上，因为PCR中引物浓度较高，会形成引物二聚体。当一个PCR有多对引物时，注意检查任何一个3末端

3、都不能和 其他任何引物互补。（5）解链温度（Tm 值）：计算出来的两个引物的 Tm 值相差不能大于5 ，扩增产物的 Tm 值与引物的 Tm 值相差不能大于10 ；引物的 Tm 值一般为50-70。这些特性保证了扩增产物在每一个 PCR 循环可有效变性。（6）3末端3末端的性质非常关键。如果可能的话，每个引物的3末端碱基为G或C；最好不要A，或AA等多聚A；（7）5端序列添加限制性酶切位点： 2.用Primer Premier 5.0 软件设计两对引物 （1）在网页上找到要制作引物的一段序列，最好在1000左右，比如：ORIGIN 1 atgaatccaa atcaaaagat aataacaa

4、tt ggttctgttt ctctcatcat tgccacaata 61 tgtttcctta tgcaaattgc tatcctagta actactgtaa cattacattt caagcagcat 121 gactacaact cccccgcaaa caaccaagca atgctgtgta aaccaacaat aatagaaaga 181 aacacaacag agattgtgta tttgaccaac accaccatag agaaagaaat atgccccaaa 241 ctagtagaat atagaaactg gtcaaagccg caatgtaaca ttacagg

5、gtt tgcacctttt 301 tccaaggaca attcaattcg gctttctgct ggtggggaca tctgggtgac aagagaacct 361 tatgtgtcat gcgatcctga caagtgttat caatttgccc ttgggcaggg aacaacatta 421 aacaacggac attcaaataa cactgtacat gataggaccc cttatcgaac cctattgatg 481 aatgaattgg gtgttccatt tcatttagga accaggcaag tgtgcatggc atggtccagc 541 t

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7、 attgtcagga agtgctcagc atgttgagga gtgctcctgt 841 tatccacgat ttcctggtgt cagatgtgtc tgcagagaca actggaaagg ctccaatagg 901 cccatcgtag atataaatgt aaagaattat agcattgttt ccagttatgt atgctcagga 961 cttgttggag acacacccag aaaaggcgac agcgtcagca gtagttattg cctagatcct 1021 aacaatgaga aaggtggtca tggggtgaaa ggctggg

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9、tggacctca 1321 aacagtattg ttgtgttttg tggcacctca ggtacatatg gaacaggctc atggcctgat 1381 ggagcggata tcaatctcat gcctatataa（2）将序列粘贴到制作区域（3）点击Primer后点击Search开始搜索引物，如：上述设计得如下一对引物5CCTAAGCGTAACGTCTCGT3TGGGAGGCTTGTAGATAGT优点：转化率为80%，产物长度比较长，为495bp.能够很到限度的利用所选序列的，在5端没有A或者多聚A结构，引物的Tm值的差距小于5，GC含量在45%到55%之间。缺点：引物转

10、化率不够高，而且极易发生三类结合错误，首先，易形成引物内互补结构，形成自身互补序列，阻碍了引物与所选序列的配对；其次，两个引物之间容易形成两类不完全配对，形成引物二聚体，这样引物便不容易和DNA学列结合，减少扩增速度。最后，两条产物链的温差大于10度，这也不利于PCR循环扩增。此外，另外一对引物如下： 5ATCTGACACCAGGAAATCG3AGTCGGAATGCGTCTGTAT优点：比较高的转化率，GC含量为在合理的范围之内，复合引物设计原则，Tm值是一样的，也符合引物设计原则。缺点：容易形成引物二聚体，5末端有A，当末端碱基为 A 时，错配时引发链合成的效率大大降低；引物3端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间。