第十一章植物离体无性繁殖.docx

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第十一章植物离体无性繁殖

第十一章植物离体无性繁殖

1植物离体无性繁殖的概念和特点

植物有两种基本生殖方式：

有性生殖和无性生殖。

有性生殖是经过雌、雄性细胞融合而发育成合子胚或种子，并用种子繁殖后代的，如小麦、水稻、玉米等的繁殖。

无性生殖是不经过雌、雄性细胞融合而直接用营养体细胞繁殖后代，如甘蔗、甘薯、土豆等的繁殖。

由于很多的植物是高度杂合的，如大多数果树和观赏植物、甘蔗、甘薯、马铃薯等，因此它们的种子后代不可能与原种完全相同。

只有由无性繁殖产生的植株，在遗传上才能与其亲本植物完全相同，从而可使品种的特性代代相传。

一个品种通过无性繁殖可产生在遗传上等同的多个拷贝，其中由一个个体通过无性繁殖产生的一个群体称为一个无性系（克隆）。

在自然界中，无性繁殖的途径有二种：

一是无融合生殖，即不经过减数分裂和受精而形成种子；二是营养繁殖，即由母株的营养体部分再生出新的植株。

无融合生殖是指被子植物未经受精的卵或胚珠内某些细胞直接发育成胚的现象。

它不经过雌、雄性细胞融合而直接由营养体细胞或卵细胞发育成无性胚或无性种子。

包括：

（1）孤雌生殖。

卵细胞不经受精直接发育成胚的现象。

孤雌生殖有两种类型：

一种是由经过减数分裂的胚囊中的单倍体卵细胞发育成胚，这样的胚长成的植物体为单倍体，不能产生后代。

这种类型在自然界罕见。

另一种是由未经减数分裂的胚囊中的二倍体卵细胞发育成胚。

如蒲公英。

（2）无配子生殖。

由胚囊内卵细胞以外的非生殖性细胞，如助细胞、反足细胞或极核等直接发育成胚的现象。

见于韭、含羞草、鸢尾等植物。

（3）无孢子生殖。

由珠心或珠被细胞直接发育成胚的现象。

见于柑桔属、高粱属等植物。

由于无融合生殖只发生在少数几个物种，因此，人们一直采用营养繁殖的方法对入选品种进行无性繁殖。

有些栽培植物，例如香蕉、葡萄、无花果、矮牵牛和菊花等的某些品种，很少产生或不产生有生活力的种子，所以营养繁殖是惟一的繁殖方法。

作为植物营养繁殖的一个新手段，植物组织培养技术现正日益普及。

利用植物组织培养技术，在无菌条件下对外植体进行离体培养，使其短期内获得遗传性一致的大量再生植株的方法称为植物离体无性繁殖（propagationinvitro）。

植物离体无性繁殖又称植物快繁或微繁（micropropagation），它是植物组织培养技术在农业生产中应用最广泛、产生经济效益最大的研究领域，涉及的植物种类繁多，技术日益成熟并程序化，繁殖速度突破了植物自然繁殖的界限，成就了工厂化育苗的梦想。

植物快繁与传统营养繁殖（vegetativepropagation）相比，其特点表现在：

①繁殖效率高。

由于不受季节和灾害性气候的影响，材料可周年繁殖。

生长速度快，材料能以几何级数增殖。

②培养条件可控性强。

培养材料完全是在人为提供的培养基质和小气候环境条件下生长，便于对各种环境条件进行调控。

③占用空间小。

一间30m2的培养室可同时存放1万多个培养瓶，培育数十万株苗木。

④管理方便，利于自动化控制。

培养材料在人为环境中生长，省去了田问栽培的一些繁杂劳动，并可利用仪器进行自动化控制，便于工厂化生产。

⑤便于种质保存和交换。

通过抑制生长或超低温贮存的方法，使培养材料长期保存，并保持其生活力，既节约了人力、物力和土地，还防止了有害病虫的传播，更便于种质资源的交换和转移。

2植物快繁的器官形成方式

植物种类、外植体类型及培养基组成等都影响着接种材料的生长、分化和再生，使外植体的器官形成方式表现出一定的差异。

根据器官形成方式的不同，将植物器官的再生分为五种类型，即短枝发生型、丛生芽发生型、不定芽发生型、胚状体发生型和原球茎发生型。

2.1短枝发生型

短枝发生型是指外植体携带的带叶茎段，在适宜的培养环境中萌发，形成完整植株，再将其剪成带叶茎段，继代再成苗的繁殖方法。

该方法与田间枝条的扦插繁殖方法类似，故又称为微型扦插。

能一次成苗，遗传性状稳定，培养过程简单，移栽成活率高。

许多花卉、葡萄、马铃薯等试管苗的繁殖常用此方法。

2.2丛生芽发生型

丛生芽发生型是指使外植体携带的顶芽或腋芽在适宜培养环境中可以不断发生腋芽而呈丛生状芽，将单个芽转人生根培养基中，诱导生根成苗的繁殖方法。

携带侧芽和（或）茎尖的外植体在含有外源细胞分裂素的培养基中，可促使顶芽或侧芽萌动，形成微型的多枝多芽的小灌木丛状结构。

将丛生苗分割成带芽茎段，继代培养，重复芽苗增殖培养，可获得大量无根小苗。

无根小苗转移到生根培养基后，经培养得到完整小植株。

2.3不定芽发生型

凡是在叶腋或茎尘以外任何其它地方所形成的芽统称为不定芽。

严格地说，由愈伤组织分化形成的茎芽也应当视为不定芽。

不定芽发生型（adventitousbudformation）是指外植体在适宜培养基和培养条件下，经过脱分化形成愈伤组织，然后经过再分化诱导愈伤组织产生不定芽，或外植体不形成愈伤组织而直接从其表面形成不定芽，将芽苗转移到生根培养中，经培养获得完整植株的繁殖方法。

从愈伤组织途径再生不定芽的方式称为器官发生型，而将外植体直接再生不定芽的方式称为器官型。

以不定芽发生型快繁的植物，外植体的类型可涉及多种器官，如茎段、叶、根、花组织等。

对于植物的无性繁殖而言，由离体器官直接形成不定芽，比通过愈伤组织更好。

不定芽发生型是许多植物快繁的主要方式。

由于不定芽形成的数量与腋芽数目无关，其增殖率高于丛生芽发生型。

但经过愈伤组织途径或多次继代培养后，易导致细胞分裂不正常，增加变异植株发生频率。

如香蕉继代次数控制在8代之内，再生植株的变异率则可控制在3％左右。

需要注意的一点是，表现嵌合性状的植株通过不定芽方式再生时，往往导致嵌合性状发生分离，而失去原有价值。

如观赏植物色彩镶嵌的叶子、带金边或银边的植物，通过不定芽途径再生植株时，可能会失去这些具有观赏价值的特征（花斑叶天竺葵品种MmeSalleron也是一个嵌合体，不经愈伤组织由叶柄节段直接形成的不定芽长成植株后或是绿的，或是白的，从不表现嵌合性。

与此相反，所有由茎尖培养产生的植株都表现典型的花斑性状p259）。

因此，这类植株快繁时，应通过丛生芽途径进行。

2.4胚状体发生型

胚状体发生型是指外植体在适宜培养环境中，经诱导产生体细胞胚的繁殖方法。

外植体诱导产生的愈伤组织进一步发育成类似合子胚的体细胞胚（图11—1），或外植体表皮细胞直接发育成体细胞胚。

体细胞胚由于具有胚芽和胚根的两极原基，不经生根培养即可直接形成完整小植株。

图11—1愈伤组织经诱导形成的体细胞胚状体

a.当归愈伤组织形成的胚状体b.葡萄愈伤组织产生的体细胞胚（引自RobertN.Trigiano，2000）

胚状体发生途径具有成苗数量大、速度快、结构完整的特点，因而是外植体增殖系数最大的途径。

但胚状体发生和发育情况复杂，通过胚状体途径快繁的植物种类，远没有丛生芽和不定芽涉及的广泛。

体细胞胚再生的小植株与丛生芽或不定芽再生的小植株相比，具有两个显著差异：

①胚状体多起源于单细胞。

体细胞胚很早就具有明显的根端和苗端的两极分化，极幼小时也是一个根、芽齐全的微型植物，无需诱导生根。

②生理隔离。

胚状体发育的小植株与周围愈伤组织或母体组织间没有结构上的联系，出现生理隔离现象，小植株独立形成，易于分离。

而丛生芽或不定芽发育的小植株，最初由分生细胞团形成单极性的生长点，发育成芽，致使芽苗与母体组织或愈伤组织紧密联系，如维管束组织、皮层和表皮组织等。

转移生根时，需切割才能分开。

2.5原球茎发生型

原球茎发生型是兰科植物的一种快繁方式，它是指茎尖或腋芽外植体经培养产生原球茎（即扁球状体、基部生假根）的繁殖类型。

原球茎是短缩的、呈珠粒状的、由胚性细胞组成的、类似嫩茎的器官，它可以增殖，形成原球茎丛。

由茎尖或腋芽外植体诱导产生原球茎，切割原球茎进行增殖，或停止切割使其继续培养而转绿，产生毛状假根，叶原基发育成幼叶，将其转移培养生根，形成完整植株。

原球茎繁殖体系是兰花惟一有效的大规模无性繁殖方法。

该方法是1960年由法国学者G.Morel开创的，促使了兰花工业的形成，获得了巨大的经济效益。

3植物快繁的程序

离体无性繁殖是一个相当复杂的过程，包括好几个步骤或阶段。

Murashige（1978）提出，可以把商业上进行无性繁殖的整个过程分为4个不同的阶段，即阶段Ⅰ—无菌培养物的建立；阶段Ⅱ—茎芽的增殖；阶段Ⅲ—芽苗的生根；阶段Ⅳ—小植株的移栽驯化。

以上4个阶段中前3个都是在无菌条件下进行的，第4个则是在温室环境中完成的。

后来，Debergh和Maene（1981）建议，在阶段Ⅰ之前再加上一个阶段O，其间要把供体植株在仔细监控的环境条件下栽种至少3个月，并且要采取措施减少供体植物的表面污染和内生菌污染。

3.1阶段Ⅰ—无菌培养物的建立

这个阶段的任务包括母株和外植体的选取、无菌培养物的获得及外植体的启动生长，以利于离体材料在适宜培养环境中以某种器官发生类型进行增殖。

阶段Ⅰ是植物快繁能否成功的重要一步。

3.1.1母株和外植体的选取

用来进行繁殖的材料，其母株（stockplant）应选择性状稳定、生长健壮、无病虫害的成年植株。

如果田间母株污染严重，无菌培养物无法获得，可将其剪切后进行室内栽种培养，并喷洒毒虫剂和杀菌剂，待长出新枝后进行采样。

虽然每种植物器官和组织都可以作为外植体进行植株快繁，但实际应用中，选用何种外植体多与被繁殖植物的种类有关。

通常木本植物、较大的草本植物多采用带芽茎段、顶芽或腋芽作为快繁的外植体；易繁殖、矮小或具短缩茎的草本植物则多采用叶片、叶柄、花茎、花瓣等作为快繁的外植体。

在一定程度上，用于离体繁殖的外植体的性质，是由所要采用的茎芽繁殖方法决定的。

例如，为了增加腋生枝的数目，就应当使用带有营养芽的外植体。

为了由受感染的个体生产脱毒植株，就必须使用不足1mm长的茎尖做外植体。

不过，倘若母株是无毒的，或是不需要脱毒，最适用的外植体则是带节的插条。

根据一般经验，茎尖以下的较老节段对于杀菌剂毒性的忍耐力比顶端要强得多，但有些植物必须用顶芽来繁殖。

如Miller和Murashige（1976）在铁树和龙血树的培养中使用的是顶芽，这是因为侧芽不能产生可供再培养的枝条。

在对根状茎植物如草莓等进行微繁时，通常是使用匍匐枝的茎尖。

在切取外植体的当时供体植株的生理状态，对于芽的反应能力有明显的影响。

在生长季开始时由活跃生长的枝条上切取的外植体，通常能产生最好的效果。

对于需要低温、高温或特殊的光周期才能打破休眠的鳞茎、球茎、块茎和其他器官，应当在取芽之前进行必要的处理。

如由经过1l℃冷处理6～8周的水仙鳞茎上切取的茎尖，比由未经处理的鳞茎上切取的茎尖在离体培养中生长快，存活率高。

在通过形成不定芽进行快繁的时候，无论是否要经历愈伤组织阶段，都可用根段、茎段或珠心做外植体。

对于用做外植体源的器官的选择，是由其天然形成不定芽的能力决定的。

在愈伤组织培养中，正确选择外植体对茎芽的分化也起很大作用。

在柠檬桉中，只有起源于木质块茎（1ignotuber）的愈伤组织才能分化茎芽，由茎或根形成的愈伤组织没有这种能力。

同样，在咖啡中，茎芽和小植株的分化只发生在直生茎（orthotrophicshoots）节段的培养物中。

3.1.2无菌培养物的获得

选取的各种外植体材料经适当、有效的灭菌处理后（如何减少污染？

），接种在基本培养基中，以检测每个材料的菌类污染情况。

一般每一培养瓶中接种一块材料，避免相互污染。

对接种15d以上仍未见污染并且成活的外植体，可转移至促使其启动生长的培养基中。

3.1.3外植体的启动生长

不同外植体启动生长的方式不同，主要有：

①腋芽被刺激后进行生长；②茎段、叶片、花芽、子叶和其他器官外植体的伤口处产生不定芽；③外植体切口表面产生愈伤组织。

启动生长所用的培养基随植物种类、栽培方式和外植体类型的不同而异。

外植体启动生长培养基中，生长素和细胞分裂素的浓度最为重要，如刺激腋芽生长时，细胞分裂素（6-BA、KT或2-ip）的适宜浓度是0.5～1.0mg／L，生长素的浓度水平则很低，为0.01～0.1mg／L；诱导不定芽形成时，需较高水平的细胞分裂素；诱导愈伤组织形成，增加生长素的浓度并补充一定浓度的细胞分裂素是十分必要的。

通常，阶段I的完成需要4～6周，获得的培养产物转移到阶段Ⅱ中进行增殖。

然而，有些外植体可能需要在阶段I中停留较长时间，这时，必须将外植体转移到新培养基上培养。

如一些木本植物的阶段I完成需1年时间，此时，继代后具有正常茎芽的培养物才能稳定增殖，反之，则在发育中被抑制，无法增殖。

3.2阶段Ⅱ—茎芽的增殖

这个阶段的任务是对阶段I获得的培养材料进行增殖，不断分化产生新的丛生苗、不定芽或胚状体。

3.2.1培养材料的增殖

阶段I的培养物在阶段Ⅱ中以前述五种方式进行增殖。

每种植物采用哪种方式进行快繁，既取决于培养目的，也取决于材料自身的可能性。

一般大多数植物采用无菌短枝、腋芽萌发或诱导不定芽产生，再以芽繁殖芽的方式进行增殖；兰科植物、百合等则采用原球茎增殖途径，以保障繁殖材料的遗传稳定性。

增殖后形成的丛生苗或单芽苗分割后，转移到新培养基中继代培养。

在繁殖体增殖阶段，每4～8周继代一次。

有时，芽苗随培养时间的延长而出现衰退，即不能生长、茎尖褐化、进入休眠甚至失去再生的潜能，降低培养基中生长调节剂的浓度和避免基部愈伤组织的产生等都可以降低芽苗的衰退。

3.2.2增殖培养基

增殖率是植株快速繁殖特别是商业性繁殖的重要指标。

外植体在每次继代培养中，应能产生最大数量的有效繁殖体。

因此，需进行适宜增殖培养基配方的确定。

增殖培养基的确定因植物种类、品种和培养类型的不同而异。

通常，基本培养基与阶段Ⅰ相同，而细胞分裂素和矿物元素的浓度水平则高于阶段Ⅰ，其最佳浓度的确定应通过实验进行。

一般MS培养基适合许多种植物的培养。

3.2.3增殖体的大小和切割方法

为了保证每次继代培养能获得同样的快速增殖效果，增殖茎段应具有最小组织量，即携带一个茎节，但从初代培养物中切割的茎段一般都有2～4个茎节。

这些茎段可以垂直插入培养基中，但插入的深度不应淹没茎节；或水平放入培养基表面，以刺激侧芽的萌动。

初代培养物切割完茎段后，可以继续进行整块分割，再培养。

如果出现顶芽发育而抑制其他腋芽增殖的现象，应将顶芽茎段切除，对其基部进行再培养。

3.3阶段Ⅲ—芽苗生根

除了体细胞胚带有原先形成的胚根，可以直接发育成小植株外，在有细胞分裂素存在的情况下，由不定芽和腋芽长成的枝条一般都没有根。

诱导无根苗生根的方法有以下2种：

3.3.1离体生根

离体生根也称试管内生根，即把大约1cm长的小枝条逐个剪下，转插到生根培养基中。

生根时所用基本培养基组成同阶段I，但需降低无机盐浓度，一般用1／2或1／4的量，并减少或除去细胞分裂素，增加生长素的浓度。

对于大多数物种来说，诱导生根需要有适当的生长素，其中最常用的是NAA和IBA，浓度一般为0.1～10.0mg／L。

对有些植物，如果芽苗在含有生长素的培养基中生长1～2d，再转移至无生长素的培养基中，或芽苗在含生长素的生根溶液中浸蘸后直接插入无生长素的培养基中，其生根效果好；如果在生长素处理阶段辅以黑暗条件，则生根效果更好。

在阶段Ⅱ和阶段Ⅲ之间，将增殖的芽苗转移至无或低浓度细胞分裂素的培养基中培养2～4周，或添（增）加赤霉素，降低细胞分裂素的作用，这种芽苗在阶段Ⅲ时，可直接转入无细胞分裂素和赤霉素的培养基中诱导生根。

离体培养中的生根期也是前移栽期。

因此，在这个时期必须使植物做好顺利通过移栽关的各种准备。

在生根培养基中减少蔗糖浓度（如减到大约1％）和增加光照强度（如增至3000～10000lx），能刺激小植株使之产生通过光合作用制造食物的能力，以便由异养型过渡到自养型。

较强的光照也能促进根的发育，并使植株变得坚韧，从而对干燥和病害有较强的忍耐力。

虽然在高光强下植株生长迟缓并轻微退绿，但当移人土中之后，这样的植株比在低光强下形成的又高又绿的植株容易成活。

枝条在离体条件下生根所需的时间不等。

当根长至5mm左右时移栽最为方便，更长的根在移栽时易断，因此会降低植株的成活率。

3.3.2活体生根

活体生根又称试管外生根。

用此法生根时，芽苗可以先在生长素中快速浸蘸或在含有相对高浓度生长素的培养基中培养5～10d，诱导枝条形成根原基，然后再移栽土中，遮荫保湿，待其生根。

在可能的情况下，试管外生根由于减少了一个无菌操作步骤，因而可降低成本。

3.3.3无根苗的嫁接

当试管内难于诱导枝条生根，或在市场拒绝自根苗的情况下，嫁接就成了完成离体快繁最后一步的必然选择。

嫁接又可分为试管内嫁接和试管外嫁接两种情况：

试管内嫁接又叫微体嫁接，即以试管苗的0.1～0.2mm长的茎尖为接穗，以在试管内预先培养出来的带根无菌苗为砧木，在无菌条件下借助显微镜进行嫁接，之后继续在试管内培养，愈合后成为完整植株再移人土中。

这种嫁接方法技术难度高，不太容易掌握，但在苹果和柑橘脱毒苗生产中，已取得了一定进展。

试管外嫁接方法在三倍体无籽西瓜试管苗生产中应用较早，当把上述试管苗嫁接到瓠子上后，在温度为25～30℃，相对湿度基本饱和的条件下，3d后伤口长出愈伤组织，1周后成活并长出新叶。

苹果苗试管外嫁接的主要环节是：

选取苗高2cm，茎粗O.1～0．2cm的试管苗为接穗，在室温下锻炼1～2d后，劈接或皮接于大树新梢上，3周后愈合（杨玉梅，1986）。

3.4阶段Ⅳ——小植株的移栽驯化

3.4.1壮苗和炼苗

试管小植株的移栽驯化是试管苗从异养到自养的转变，有一个逐渐适应过程。

由于试管苗生长在恒温、高湿、弱光、无菌和有完全营养供应的特殊条件下，虽有叶绿素，但异养生活，因此在形态解剖和生理特性上都有很大脆弱性，例如水分输导系统存在障碍，叶面无角质层或蜡质层，气孔开张过大且不具备关闭功能等。

这样的试管苗若未经充分锻炼，一旦被移出试管，投人到一个变温、低湿、强光、有菌和缺少完全营养供应的条件下，会很快失水萎蔫，最后死亡。

因此，为了确保移栽成功，在移栽之前必须先要培育壮苗和开瓶炼苗。

壮苗是移栽成活的首要条件，但培育壮苗的方法则因材料和情况的不同而异。

在培养基中加入一定数量的生长延缓剂如多效唑（PP333），B9（比九）或矮壮素（CCC）等，在很多种植物中都是培育壮苗的一项有效措施。

壮苗之后则须开瓶炼苗降低瓶中湿度，增强光照强度，以便促使叶表面逐渐形成角质，促使气孔逐渐建立开闭机制，促使叶片逐渐启动光合功能等。

炼苗的具体措施则因苗的种类不同而异，有些单子叶草本植物，只要苗壮，炼苗方法十分简单：

拿掉封口塑料膜，在培养基表面加上薄薄一层自来水，置于散射光下3～5d即可。

有些植物如霞草和刺槐试管苗极易萎蔫，封口膜在炼苗开始时只能半开，且要求炼苗环境有较高的相对湿度。

喜光植物如枣和刺槐等可在全光下炼苗，耐荫植物如玉簪和白鹤芋等则须在较荫蔽的地方炼苗，萱草、月季、福禄考、油茶等可在50％～70％的遮荫网下炼苗（李云，2001）。

3.4.2移栽

试管小植株移栽时，首先应洗去小植株根部附着的培养基，避免微生物的繁殖污染，造成小苗死亡。

移栽前先将人工配制的混合培养基质进行消毒（0.3％～0.5％高锰酸钾或用40％福尔马林50～100倍液），然后浇透水，再后将小植株栽入其中。

基质用保湿又透气的材料，如蛭石、珍珠岩、粗沙、泥炭、腐殖土等按比例混合，以利小植株生长。

3.4.3驯化管理

由于试管苗是在高湿（90％～100％的相对湿度）环境中生长的，茎叶表面防止水分散失的角质层等几乎全无，根系又不发达，移栽后难以保证水分平衡，即使根系周围有足够的水分也不行。

故移栽后初期要通过喷雾或罩上透明塑料以保持小植株周围的空气湿度较高（90％～100％），减少叶面蒸腾，这对移栽的成功是非常重要的。

在塑料罩上可打些小孔，以利气体交换。

在移栽时把小植株的一部分叶片剪掉也可能是有益的。

随着时间的推移，应逐渐降低空气相对湿度，使移栽苗适应自然环境条件。

移栽小植株还应注意光、温控制。

试管苗是在营养丰富且含糖的培养基中进行异养生长的，移栽后要通过自身的光合作用来维持生存。

因此，移栽初期光照强度应较弱，经过一段时间适应后，再增加光照强度。

移栽小植株生长所需的适宜温度与植物种类有关，喜温性植物以25℃左右为宜，喜凉性植物则以18～20℃为好。

温度过高导致蒸腾作用加强，水分失衡，微生物滋生等；温度过低则使幼苗生长迟缓或不易存活。

如使基质温度高于空气温度2～3℃，则有利于生根和促进根系发育，提高存活率。

此外，在移栽小植株的驯化管理阶段，还应防止菌类滋生，适当喷一定浓度的杀菌剂可有效保护移栽小植株的正常生长。

总之，移栽苗成活的必要条件是：

空气湿度高，土壤通气好，太阳勿直照，温度要适宜。

4影响植物离体快繁的因素

4.1外植体

起始的外植体状况如外植体的来源、发育阶段、大小及预处理等，是决定植株繁殖速率和再生植株质量的最重要因素。

4.1.1外植体的来源

在植物组织培养中，不是所有的培养细胞都同样分裂增殖，常常是细胞群中的一部分细胞进行旺盛的分裂形成细胞块，称为拟分生组织。

尽管细胞全能性是所有植物细胞具有的特性，但全能性的表达常局限于某些特殊的细胞，即拟分生组织细胞，致使不同组织或器官的植株再生能力差异很大。

具有拟分生组织的外植体如茎尖、带芽茎段等是最佳的植物快繁外植体，因其形态已基本建成，生长速度快，遗传性稳定。

当所有其他组织作为外植体的植株再生工作都失败时，茎尖培养仍然可以获得成功。

无拟分生组织的外植体如叶片、根段、花器、子房、子叶等，如果在适当刺激下能产生拟分生组织，也是植物快繁的合适材料。

但是，由于培养技术和条件的限制，有些植物的一些组织或器官，如厚叶莲花掌的叶、非洲菊的花梗和花瓣，仍然无法获得再生植株，对这类植物进行快繁时，确定合适的外植体来源十分重要。

有的植物可从多种组织或器官中获得再生植株，如香石竹等，这类植物的外植体种类的确定应以采集和灭菌是否容易为标准。

4.1.2外植体生理年龄

植物生理学的基本观点是同一植株的不同器官和同一器官的不同部位都具有不同的生理年龄。

沿植物主轴，越近下部生理发育年龄越小，远离发育上的成熟，不易形成花器官，但易分化，再生能力强。

越近顶端的器官，生理年龄越老，接近发育上的成熟，易形成花器官，但分化和再生能力弱。

嫩叶再生能力高于老叶，木本植物幼树嫩枝、老树基部萌蘖枝再生能力强。

4.1.3外植体大小

培养成活的外植体数及其生长速率和繁殖率与外植体的起始大小密切相关。

外植体越小，成活率和繁殖率就越低。

茎尖离体成活的临界大小应为携带1～2个叶原基，为0.2～0.3mm；叶片、花瓣等约为5mm2；茎段则为0.5cm。

因此，除非是进行脱病毒植株繁殖，否则不宜将外植体切割得太小。

4.2培养基

长期以来，根据培养的植物种类、组织或器官及培养目的的不同，已设计了许多培养基配方。

4.2.1基本培养基

MS培养基是植物组织培养中应用最广泛的一种培养基。

这种培养基中的无机盐含量足以满足多种植物组织培养阶段I和阶段Ⅱ的营养需求。

但对某些植物，如乌饭树（Vacciniumbracteatum）、越橘、捕虫堇（Pinguiculamoranensis）等以及植物组织培养阶段Ⅲ，MS的无机盐含量就显得过高，应以1／4MS或l／2MS为好。

4.2.2碳源

对多数植物来说，蔗糖和葡萄糖是良好的碳源，其浓度为2％～4％，可满足阶段I和阶段Ⅱ的需求，阶段Ⅲ所需糖浓度较低，为1％～3％。

在植物大规模离体快繁时，常用白糖代替蔗糖，再生植株未见明显的差异，但可降低生产成本。

4.2.3植物生长调节剂

植物生长调节剂是完成阶段I、阶段Ⅱ和阶段Ⅲ过程所必需的物质，其浓度的高低及其种类的配合决定着植物的快繁过程能否顺利进行。

高浓度（1.0～10.0mg／L）的细胞分裂素和低浓度（0.1～1.0mg／L）的生长素配合（或无需生长素），可以使腋芽和茎尖外植体在阶段I启动，形成丛生芽或单芽，并进行阶段Ⅱ的增殖。

随着继代增殖次数的增加，应