抑制性削减杂交实验方法.docx
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抑制性削减杂交实验方法
抑制性削减杂交PCR
削减杂交是一强有力的使研究人员能够比较两种mRNA群和获得仅在一mRNA群表达而在另一mRNA群没有表达克隆的强有力的技术。
虽然有几种不同的方法,但削减杂交背后的基本理论却非常简单。
首先,两组mRNA均转化为cDNA:
我们将含有特异(差异表达的)转录物称为“tester”,对照cDNA称为“driver”。
Tester和DrivercDNA进行杂交,接着去除杂交序列。
结果,保留的未杂交的cDNA就代表了那些仅在tester组表达,而在driver组不表达的mRNA。
虽然传统的减法杂交方法在某些研究中已成功运用,但要求几轮的杂交且也不适合鉴定稀有信息。
CLONTECHPCR-SelectcDNA削减杂交是唯一克服了传统减法杂交的这些缺点的方法。
图1表示PCR-Select过程的简短回顾。
本方法的几个特点使其具有高效和可重复性。
方法仅要求0.5--2gpolyA+RNA,花3—4天时间,也不用分离ss和ds分子。
而且,抑制性PCR预防了不需要的扩增而使目标分子得到富集。
图2详细地描述了发生在PCR-SelectcDNA消减杂交分子事件。
首先,cDNA从0.5--2g的polyA+RNA合成。
Tester和drivercDNA以RsaⅠ酶切,该酶为一四碱基限制性内切酶,产生平末端。
TestercDNA接着分成两部分,每一部分连一不同的cDNAadaptor。
Adaptor的末端无磷酸基团,因此仅有adaptor的一链与cDNA5’末端相连。
两adaptor具有不同的序列,这样当残留末端被补平后就能够同两个不同的PCR引物退火(AppendixB)。
接着进行两轮杂交。
首先,过量的drivercDNA加入到每一tester样品,然后热变性和退火,在每一样品产生a、b、c和d分子(图2)。
由于杂交二级动力学的原因,高丰度分子退火快,因此高和低丰度序列在a型分子中的浓度趋于均衡。
同时,与在driver中没有差异表达的分子c、a型ss分子明显富集。
在第二次杂交期间,两第一次杂交的样品不经变性直接混合。
现在,仅有保持平衡的和消减的sstestercDNA能够重新配对形成新的e型杂交体。
这些新杂交体成为具有不同的dsDNA分子,分别为tester1(与adaptor1相连)和tester2(分别与adaptor2相连)。
将新变性的drivercDNA加入无需再次变性的已行第一次杂交反应的两混合物,进一步富集差异表达序列e型分子。
经DNA多聚酶补平末端后,e型分子—差异表达的tester序列—在5’和3’端具有不同的退火位点。
接着整个分子群进行PCR以扩增需要的差异表达序列。
在PCR中,a和d分子无引物退火位点,因而不能被扩增。
由于抑制性PCR效应,绝大多数b型分子形成盘状结构而阻止其指数扩增(AppendixA)。
c型分子仅有一个引物结合位点而仅能被线性扩增。
仅有e型分子,有两个不同adaptor,能被指数扩增,产生均衡的差异表达序列。
进而,进行第二次PCR扩增以进一步减少背景和富集差异表达序列。
此时,差异表达的cDNA就能直接插入T/A克隆载体(例,使用CLONTECH’sAdvanTAgePCRCloningKit,#k1901-1)或任何使用RsaⅠ位点作为adaptor/cDNA连接的载体。
然后,差异表达的RNA能被测序、杂交分析鉴定。
PCR混合物也可用作杂交探针进行DNA文库筛选。
如果你的起始材料有限,你可以用CapFinderPCRcDNASynthesisKit(#k1052-1)预先扩增你的总RNA以用于PCR-SelectKit.当总RNA用常规方法合成cDNA时,即便是使用Oligo(dT)引物,核糖体RNA也会同polyA+RNA一起被反转录。
如果这种cDNA用于PCR-SelectKit,过量的核糖体RNA和低浓度的与PolyA+RNA相对应的cDNA浓度将导致无效减法杂交。
使用CapFinderPCRcDNASynthesisKit可直接用于PCR-Select
cDNA合成
tester和driverdscDNA从待比较的mRNA合成
RsaⅠ消化
Tester和drivercDNA分别消化以获得短的平末端分子
Adaptor连接
试验组平分成两份,分别连上不同的adaptor,但drivercDNA无adaptor
第一次杂交
杂交动力学导致均衡和富集差异表达序列
第二次杂交
以产生用于PCR扩增模板的差异表达序列
第一次PCR扩增
使用抑制性PCR,仅差异表达的序列呈指数级扩增
第二次PCR扩增
背景减少,不同表达的序列进一步富集
图1.CLONTECHPCR-Select过程的概况,含特异转录物cDNA称tester,对照称driver
消减杂交,即便是总RNA用作起始材料(注意:
使用CapFinderPCRcDNALibraryConstructionKitAK1051-1产生的擦与PCR-SelectKit并不相容。
)
一旦你确定了差异表达cDNA,那么Marathon&tradecDNAAmplificationKit(#K1802-1)
MarathonReady&tradecDNA可以提供优秀的克隆相应全长的方法(Chenchiketal.1996)。
欲求更多的信息,参阅相关产物的描述。
二、试剂成分表
RNA存于-70℃,储存4杂交液于室温。
其它储存于-20℃。
本试剂盒提供的足够7次cDNA合成的试剂。
每次反应最好使用2gpolyARNA,但也可少至0.5g。
但是,如果使用低于2g的polyARNA,在消减过程中,低丰度的差异cDNA可能丢失。
7次cDNA合成相当于6次完全的消减实验和1次对照。
如果每次合成用于不同实验的tester和driver(在特殊系统鉴定上调或下调cDNA),PCR试剂足够50次primary和100次secondaryPCR反应。
参阅附录B的primer和adaptor序列。
第一链的合成
*7lMMLV反转录酶(200u/l)
10lcDNA合成引物(10M)
200l5第一链缓冲液
250mMTris-HCl(pH8.3)
30nMMgCl2
375mMKCl
第二链合成
*28l20第二链酶混合物
(DNA多聚酶1,RNaseH,0.2u/l,E.coliDNA连接酶,1.2u/l)
*200l5第二链缓冲液
500mMKCl
50mMAmmoniumSulfate
25mMMgCl2
0.75mM-NAD
100mMTris-HCl(pH7.5)
0.25mg/ml牛血清白蛋白
*14lT4DNA多聚酶(3u/l)
内切酶消化
*200l10Rsa1限制缓冲液
100mMBisTrisPropane-HCl(pH7.0)
100mMMgCl2
1mMDTT
*11lRsa1(10u/l)
Adaptor连接
*21lT4DNA连接酶(400u/l;含3mMATP)
*30lAdaptor1(10M)
*30lAdaptor2(10M)
*200l5DNA连接缓冲液
250mMTris-HCl(pH7.8)
50mMMgCl2
10mMDTT
0. 25mg/mlBSA
杂交
*200l4杂交缓冲液
*1.4ml稀释缓冲液
20mMHEPES-HCl(pH8.3)
50mMNaCl
0.2nMEDTA(pH8.0)
PCR扩增
*50lPCR引物1(10M)
*100l巢氏PCR引物1(10lM)
*100l巢氏PCR引物2(10M)
*10l质控消减cDNA
对照实验
*5l对照polyARNA(来源于人骨骼肌)
*10l对照DNA(3lg/l)
(HaeⅢ-消化的细菌噬菌体x174DNA)
*50lG3PDH5’引物(10M)
*50lG3PDH3’引物(10M)
这些引物可以扩增人、大鼠、小鼠G3PDH
一般试剂
*20ldNTP*混合物
10mMeachdATP,dCTP,dGTP,dTTP
*100l20EDTA/glycogenmix
(0.2MEDTA;1mg/mlglycogen)
*400lNH4OAc(4M)
*1ml灭菌水
三、另外所需试剂
下面的试剂是需要的,但未提供
*Hae3消化的噬菌体X174(#6310-1,2):
凝胶上DNAMarker用
*0.5mlPCR反应管,推荐Perkin-ElmerGeneAmp
*80%和96%乙醇
*酚:
氯仿:
异戊醇(25:
24:
1)。
按下配制:
1、 重蒸酚
2、 等体积灭菌TNE缓冲液平衡(50mMTris,Ph7.5,150mMNaCl,1mMEDTA)
3、 室温下2-3小时
4、 去除上层水相
5、 加入等体积氯仿:
异戊醇(24:
1),完全混合,去除上层相
6、 储存下层酚:
氯仿:
异戊醇于4℃,最多2周
*氯仿:
异戊醇(24:
1)
*50PCR酶混合物
推荐ClonTECH’AdvantageTMKlenTaqPolymeraseMix(#8417-1)
*10PCR缓冲液
*dNTP混合物(10mMdATP,dCTP,dGTP,dTTP)
*TAE电泳缓冲液
配制50储存液:
242gTris
57.1mlHac
37.2gNa2EDTA.2H2O
加水至1升
四、ClontechPCR-SelectcDNA消减步骤
A、 一般事项
*戴手套以防RNA和cDNA样品被核酸酶降解
*本手册的循环参数已使用Perkin-ElmerDNAThermalCycle480和Perkin-ElmerGeneAmpSystems2400/9600优化。
不同的循环仪可能需要不同的循环次数、50polymerase混合物和模板
*必须使用热启动以减少非特异DNA合成。
我们推荐TaqStartAntibody或人工热启动。
本步骤已用TaqStart抗体调号(包含在Clontech’sAdvantageKlenTaqPolymeraseMix中)
*悬浮沉淀和混合反应时,轻轻上下吹打,短暂离心以将成分沉于管底。
*用旋涡振荡酚:
氯仿抽提混合物
*向混合物中最后加酶,轻轻上下吹打以将酶和混合物混匀
*不要增加酶量和反应的DNA浓度。
量和浓度已优化好了。
*虽然不是要求的,推荐使用[-32P]dCTP进行第一链合成以定量产生的cDNA,确定DNA沉淀的效率,以利解决合成cDNA的困难。
B、 RNA的准备和处理
1、 一般注意事项
完整的、纯的polyARNA是合成高质量cDNA所必须的。
为了避免RNA污染和降解,将RNase减少到最低程度,使用下面注意事项:
戴手套以避免手上的RNase污染。
使用无气溶胶的吸尖以测量小体积和灭菌一次性吸管测量大体积
2、 RNA分离
使用相同试剂和方法
3、 RNA分析
总RNA和polyARNA分离后,用甲醛变性胶/EB检测其完整性。
乳动物总RNA典型表现为两条带,28和18S位于4。
5和1。
9KB,比率1。
5-2。
5:
1。
如果比率小于1:
1,检查所有RNA分离试剂是否有RNA酶污染或找另外组织细胞分离RNA。
乳动物polyARNA表现为从0。
5-12kb的Smear和弱的rRNA1.9,4.5kb。
质量差的RNA会引起高背景,不应使用。
C、 cDNA第一链的合成
使用tester、driver和对照polyARNA完成本操作。
本节得到的cDNA将作为以后步骤的对照cDNA。
在下节,将通过加入少量质控cDNA(Hae3-消化的X174)到骨骼肌dsDNA以制作模拟testercDNA。
用这些骨骼肌tester和drivercDNA与自己的消减实验平行作一完整的对照消减实验。
对照消减实验可用于估计合成的cDNA的产量和大小范围。
它也是证明实验的多步骤是否有效的最好办法。
1、 对每一实验,对照和骨骼肌polyARNA,在一消毒的0.5ml离心管中混合下列成分(不要用聚苯乙烯管):
polyARNA(2g)2-4l*
cDNA合成引物(10M)1l
*对于对照合成,加入2l骨骼肌polyARNA
如果需要,加入2l消毒水至终体积5l,混匀成分,短暂离心。
2、 在PCR仪中,70℃温育2分钟
3、 冰上冷却2分钟
4、 短暂离心
5、 每反应管加入下列成分:
5第一链缓冲液2l
dNTPMix(10mMeach)1l
消毒水*1l
MMLV反转录酶(200u/l)1l
*为了监测cDNA合成的进展,将1l[-32P]dCTP(10mCi/ml,3000Ci/mmol)以9l水稀释,代替上面的水加入以标记
6、 轻轻振荡,短暂离心
7、 42℃,空气孵箱中1.5h
注:
不要用水浴或PCR仪。
蒸发可能减少反应混合物体积,减低反应效率。
8、 反应管置冰上以终止第一链合成并立即进入D节。
D、 cDNA第二链合成
使用每一第一链tester、driver和对照骨骼肌cDNA
1、 在第一链合成管中(含10l)加入预先冰上冷却的下列成分:
消毒水48.4l
5第二链合成缓冲液16.0l
dNTPMix(10mM)1.6l
20第二链酶混合物4.0l
2、 混匀并短暂离心,终体积应为80l
3、 16℃(水浴或PCR仪)孵育2小时
4、 加入2l(6u)T4DNA多聚酶,混匀
5、 16℃孵育30分钟(水浴或PCR仪)
6、 加入4l20EDTA/glycogen混合物以终止第二链合成
7、 加入100l酚、氯仿、异戊醇混合物(25:
24:
1)
8、 混匀,14000rpm10min,RT
9、 取上清于另一清洁0.5ml离心管
10、 加入100l氯仿、异戊醇混合物(24:
1)
11、 重复步骤8、9
12、 加入05cytokinssuchasinterleukin-1,transforminggrowthfactor0.5vol4MNH4OAc和2.5vol(总体积的)95%乙醇
13、 混匀,14000rpm20min,RT
14、 去上清
15、 如果使用[-32P]dCTP,用Geiger计数器检测沉淀放射性
16、 沉淀中加入500l80%乙醇
17、 14000rpm10min
18、 去上清。
如果使用[-32P]dCTP,用Geiger计数器检测沉淀放射性
19、 空气中晾10分钟以蒸发残留乙醇
20、 50ldH2O溶解沉淀
21、 取6l加入另一新干净离心管。
储存样品于-20℃直到Rsa1消化物琼脂糖凝胶电泳以估计产量和合成的cDNA大小(见V.A节)
22、 转E节
E、 Rsa1消化
用每一实验dstester和drivercDNA,对照骨骼肌cDNA。
这一步产生短的、平末端dscDNA片段以供消减杂交和F节与adaptor连接。
1、 在一试管中加入:
dscDNA43.5l
10Rsa1缓冲液5.0l
Rsa1(10u/l)1.5l
2、 旋振混匀并短暂离心
3、 37℃孵育1.5小时
4、 用5l消化物分析Rsa1消化效率(参阅SectionV.B)
5、 加2.5l20EDTA/glycogen以终止反应
6、 加入50l酚、氯仿、异戊醇混合物(25:
24:
1)
7、 混匀
8、 14000rpm10min
9、 取上清置于一清洁0.5ml离心管
10、 加50l氯仿、异戊醇(24:
1),混匀
11、 14000rpm10min
12、 上清移入一0.5ml清洁离心管
13、 加0.5vol4MNH4OAc和2.5vol95%乙醇
14、 旋转混匀
15、 14000rpm,20min,RT
16、 去上清
17、 80%乙醇200l洗沉淀
18、 14000rpm,5min
19、 去上清,若使用[-32P]dCTP,用Geiger计数器测沉淀放射性
20、 空气干燥沉淀5-10min
21、 5.5ldH2O溶解沉淀,-20℃保存
准备实验drivercDNA和对照骨骼肌drivercDNA到此完成。
按SectionF完成实验和对照骨骼肌testercDNAs
F、 Adaptor连接
准备adaptor连接的testercDNA的实验计划如图3所示。
对于每一个实验组testercDNA和对照骨骼肌cDNA,需要制备一与Adaptor-1相连的tester(Tester1-1)和一与Adaptor-2相连的tester(Tester1-2),和一连接了双adaptors的testercDNA(非杂交的testercontrol1-c)。
非杂交的tester对照用作消减杂交的阴性对照。
Adaptors提供了不同的PCR引物退火位点。
下面的步骤用于完成每个不同的实验cDNA和对照骨骼肌testercDNA。
Adaptor不能连于drivercDNA。
1、 对于每一实验testercDNA,用7.5l消毒dH2O稀释来源于SectionE的Rsa1消化的实验cDNA。
2、 准备对照骨骼肌testercDNA
a、 短暂离心对照DNA(Hae3-消化的X174DNA[3ng/ml])
b、 用38l消毒水稀释2lDNA(至150ng/ml)
c、 用5l稀释的X174/Hae3DNA混合1l骨骼肌testercDNA(来源于SectionE)
这就是对照骨骼肌testercDNA,含0.2%Hae3-消化的X174DNA,每一片段相当于总cDNA的0.02%。
当用骨骼肌testercDNA和drivercDNA消减杂交后,在最后的PCR产生的主要条带应对应于这些对照片段。
3、 准备用于所有连接和一个额外反应的足够MasterMix,
每一反应包括1l消毒dH2O,2l5连接缓冲液和1.0lT4DNA连接酶(400u/l)
注意:
连接所需的ATP在T4DNA连接酶里(初始为3Mm,结束时为300M)
4、 对于每一实验testercDNA和对照骨骼肌testercDNA,按下表顺在一0.5ml离心管中混合下列试剂,上下吹打以完全混匀。
表1、配制连接反应
(重复实验testercDNA和对照骨骼肌cDNA)
管号
成分12
Tester1-1(l)Tester1-2(l)
稀释的实验testercDNA22
Adaptor1(10M)2-
Adaptor2(10M)-2
H2O22
MasterMix44
终体积1010
5、 在一新的离心管中,混合2lTester1-1和Tester1-2,这就是非消减的testercontrol1-c。
连接后,该管的1/3的cDNA分子会在其末端带上两个不同的adaptors
6、 短暂离心,16℃过夜
7、 加入1lEDTA/glycogen混合物终止连接反应
8、 72℃,5min以灭活连接酶
9、 短暂离心。
制备实验和对照骨骼肌Adaptor连接的TestercDNA1-1和1-2就完成了。
10、 从每一非消减testercontrol(1-c,2-c)取1l稀释于1mlH2O,该标本将用于PCR扩增(StepIV1.1)
11、 标本储存于-20℃
完成连接效率分析(方法在SectionV.C),然后作SectionIV.G
G、 第一次杂交
重要启示:
在进行下面描述的杂交之前,我们推荐完成连接效率分析(SectionV.C,结果分析和困难指导)。
如果连接没有成功,在杂交之前应重复连接反应。
在下面的过程中,每一testercDNA均加入过量的cDNA,然后标本热变性和退火。
退火之后,高丰度和低丰度序列的ss形式被均衡,因为由于二级杂交动力学的原因,高丰度的分子退火快。
而且,留下的差异表达的sscDNAs(为第二次杂交所需)明显富集,因为tester和drivercDNA非目标cDNA形成杂合体。
重要事项:
开始杂交前,一定要使4杂交缓冲液已到室温至少15-20min。
在使用缓冲液前,要保证没有可见颗粒和沉淀。
如有必要,37℃加热10min以溶解任何沉淀。
1、 对于每一实验和骨骼肌消减杂交,在一0.5ml离心管中按下表混合试剂
表2、配制第一次杂交反应
(重复每一实验testercDNA和对照骨骼肌cDNA)
杂交标本1(l)杂交标本2(l)
Rsa1-消化的drivercDNA1.51.5
(来源于E2.1)
Adaptor-1连接的Tester1-11.5-
(来源于F.8)
Adaptor-2连接的Tester1-2-1.5
(来源于F.8)
4杂交液1.01.0
总体积4.04.0
2、 覆盖石蜡油并短暂离心
3、 在PCR仪中,98℃,1.5min
4、 68℃杂交8小时,立即进入SectionH
标本可以杂交短至6小时,长至12小时,但勿超过12小时
H、 第二次杂交
两份来自于第一次杂交的标本混合在一起,且新变性的drivercDNA也可以进一步富集差异表达的序列。
末端具有不同adaptor的代表不同表达的cDNA新杂合体分子就形成了。
注意:
不要在此阶段变性第一次杂交的标本,也不要将杂交标本置于PCR仪外超过加入新的driver所需时间。
对于每一实验testercDNA