1、抑制性削减杂交实验方法抑制性削减杂交PCR 削减杂交是一强有力的使研究人员能够比较两种mRNA群和获得仅在一mRNA群表达而在另一mRNA群没有表达克隆的强有力的技术。虽然有几种不同的方法,但削减杂交背后的基本理论却非常简单。首先,两组mRNA均转化为cDNA:我们将含有特异(差异表达的)转录物称为“tester”,对照cDNA称为“driver”。Tester和Driver cDNA进行杂交,接着去除杂交序列。结果,保留的未杂交的cDNA就代表了那些仅在tester组表达,而在driver组不表达的mRNA。虽然传统的减法杂交方法在某些研究中已成功运用,但要求几轮的杂交且也不适合鉴定稀有信息
2、。CLONTECH PCR-Select cDNA削减杂交是唯一克服了传统减法杂交的这些缺点的方法。图1表示PCR-Select过程的简短回顾。本方法的几个特点使其具有高效和可重复性。方法仅要求0.5-2g polyA+ RNA,花34天时间,也不用分离ss和ds分子。而且,抑制性PCR预防了不需要的扩增而使目标分子得到富集。图2详细地描述了发生在PCR-Select cDNA消减杂交分子事件。首先,cDNA从0.5-2g的polyA+ RNA合成。Tester和driver cDNA以Rsa酶切,该酶为一四碱基限制性内切酶,产生平末端。Tester cDNA接着分成两部分,每一部分连一不同的
3、cDNA adaptor。 Adaptor的末端无磷酸基团,因此仅有adaptor的一链与cDNA 5末端相连。两adaptor具有不同的序列,这样当残留末端被补平后就能够同两个不同的PCR引物退火(Appendix B)。接着进行两轮杂交。首先,过量的driver cDNA 加入到每一tester样品,然后热变性和退火,在每一样品产生a、b、c和d分子(图2)。由于杂交二级动力学的原因,高丰度分子退火快,因此高和低丰度序列在a型分子中的浓度趋于均衡。同时,与在driver中没有差异表达的分子c、a型ss分子明显富集。在第二次杂交期间,两第一次杂交的样品不经变性直接混合。现在,仅有保持平衡的和
4、消减的ss tester cDNA能够重新配对形成新的e型杂交体。这些新杂交体成为具有不同的ds DNA分子,分别为tester1(与adaptor1相连)和tester2(分别与adaptor2相连)。将新变性的driver cDNA加入无需再次变性的已行第一次杂交反应的两混合物,进一步富集差异表达序列e型分子。经DNA多聚酶补平末端后,e型分子差异表达的tester序列在5和3端具有不同的退火位点。 接着整个分子群进行PCR以扩增需要的差异表达序列。在PCR中,a和d分子无引物退火位点,因而不能被扩增。由于抑制性PCR效应,绝大多数b型分子形成盘状结构而阻止其指数扩增(Appendix A
5、)。c型分子仅有一个引物结合位点而仅能被线性扩增。仅有e型分子,有两个不同adaptor,能被指数扩增,产生均衡的差异表达序列。 进而,进行第二次PCR扩增以进一步减少背景和富集差异表达序列。此时,差异表达的cDNA就能直接插入T/A克隆载体(例,使用CLONTECHs AdvanTAge PCR Cloning Kit, #k1901-1)或任何使用Rsa位点作为adaptor/cDNA 连接的载体。然后,差异表达的RNA能被测序、杂交分析鉴定。PCR混合物也可用作杂交探针进行DNA文库筛选。 如果你的起始材料有限,你可以用CapFinder PCR cDNA Synthesis Kit (
6、#k1052-1)预先扩增你的总RNA以用于PCR-Select Kit. 当总RNA 用常规方法合成cDNA时,即便是使用Oligo(dT)引物,核糖体RNA也会同polyA+ RNA一起被反转录。如果这种cDNA用于PCR-Select Kit,过量的核糖体RNA和低浓度的与PolyA+ RNA相对应的cDNA浓度将导致无效减法杂交。使用CapFinder PCR cDNA Synthesis Kit 可直接用于PCR-Select cDNA合成 tester和driver ds cDNA从待比较的mRNA合成 Rsa消化 Tester和driver cDNA分别消化以获得短的平末端分子
7、Adaptor连接 试验组平分成两份,分别连上不同的adaptor, 但driver cDNA无adaptor 第一次杂交 杂交动力学导致均衡和富集差异表达序列 第二次杂交 以产生用于PCR扩增模板的差异表达序列 第一次PCR扩增 使用抑制性PCR,仅差异表达的序列呈指数级扩增 第二次PCR扩增 背景减少,不同表达的序列进一步富集 图1. CLONTECH PCR-Select过程的概况,含特异转录物cDNA称tester,对照称driver 消减杂交,即便是总RNA用作起始材料(注意:使用CapFinder PCR cDNA Library Construction Kit AK1051-1
8、产生的擦与PCR-Select Kit 并不相容。) 一旦你确定了差异表达cDNA,那么Marathon&trade cDNA Amplification Kit (#K1802-1) Marathon Ready&trade cDNA可以提供优秀的克隆相应全长的方法(Chenchik et al. 1996)。欲求更多的信息,参阅相关产物的描述。 二、试剂成分表 RNA存于-70,储存4杂交液于室温。其它储存于-20。本试剂盒提供的足够7次cDNA合成的试剂。每次反应最好使用2g polyA RNA,但也可少至0.5g。但是,如果使用低于2g的polyA RNA,在消减过程中,低丰度的差异c
9、DNA可能丢失。7次cDNA合成相当于6次完全的消减实验和1次对照。如果每次合成用于不同实验的tester和driver(在特殊系统鉴定上调或下调cDNA),PCR试剂足够50次primary和100次secondary PCR反应。参阅附录B的primer和adaptor序列。 第一链的合成 * 7l MMLV反转录酶(200u/l) 10l cDNA合成引物 (10M) 200l 5第一链缓冲液 250mM Tris-HCl (pH8.3) 30nM MgCl2 375mM KCl 第二链合成 *28l 20第二链酶混合物 (DNA多聚酶1,RNase H, 0.2u/l, E.coli
10、DNA连接酶,1.2u/l) *200l 5第二链缓冲液 500mM KCl 50mM Ammonium Sulfate 25mM MgCl2 0.75mM -NAD 100mM Tris-HCl (pH7.5) 0.25mg/ml 牛血清白蛋白 *14l T4 DNA多聚酶(3u/l) 内切酶消化 *200l 10Rsa1 限制缓冲液 100mM Bis Tris Propane-HCl (pH7.0) 100mM MgCl2 1mM DTT *11l Rsa1 (10u/l) Adaptor 连接 *21l T4DNA 连接酶 (400u/l; 含3mM ATP) * 30l Adapto
11、r1 (10M) * 30l Adaptor2 (10M) *200l 5DNA连接缓冲液 250mM Tris-HCl (pH7.8) 50mM MgCl2 10mM DTT 0. 25mg/ml BSA 杂交 *200l 4杂交缓冲液 *1.4ml 稀释缓冲液 20mM HEPES-HCl (pH8.3) 50mM NaCl 0.2nM EDTA (pH8.0) PCR扩增 *50l PCR引物1 (10M) *100l 巢氏PCR引物1 (10lM) *100l 巢氏PCR引物2 (10M) *10l 质控消减cDNA 对照实验 *5l 对照polyA RNA (来源于人骨骼肌) *10
12、l 对照DNA (3lg/l ) (Hae-消化的细菌噬菌体x174 DNA) *50l G3PDH 5 引物(10M) *50l G3PDH 3 引物 (10M) 这些引物可以扩增人、大鼠、小鼠G3PDH 一般试剂 *20l dNTP*混合物 10mM each dATP, dCTP, dGTP, dTTP *100l 20EDTA/glycogen mix (0.2M EDTA; 1mg/ml glycogen) *400l NH4OAc (4M) *1ml 灭菌水 三、另外所需试剂 下面的试剂是需要的,但未提供 *Hae3消化的噬菌体X174(#6310-1,2):凝胶上DNA Mark
13、er用 *0.5mlPCR反应管,推荐Perkin-Elmer GeneAmp *80%和96%乙醇 *酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)。按下配制: 1、 重蒸酚 2、 等体积灭菌TNE缓冲液平衡(50mM Tris,Ph7.5, 150mM NaCl, 1mM EDTA) 3、 室温下2-3小时 4、 去除上层水相 5、 加入等体积氯仿:异戊醇(24:1),完全混合,去除上层相 6、 储存下层酚:氯仿:异戊醇于4,最多2周 *氯仿:异戊醇(24:1) *50PCR酶混合物 推荐ClonTECH Advantage TM KlenTaq Polymerase Mix(#8417-1) *10
14、PCR缓冲液 *dNTP混合物(10mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP) *TAE 电泳缓冲液 配制50储存液: 242g Tris 57.1ml Hac 37.2g Na2EDTA.2H2O 加水至1升 四、Clontech PCR-Select cDNA消减步骤 A、 一般事项 *戴手套以防RNA和cDNA样品被核酸酶降解 *本手册的循环参数已使用Perkin-Elmer DNA Thermal Cycle 480和 Perkin-Elmer GeneAmp Systems 2400/9600优化。不同的循环仪可能需要不同的循环次数、50polymerase 混合物和模板
15、*必须使用热启动以减少非特异DNA合成。我们推荐TaqStart Antibody或人工热启动。本步骤已用TaqStart抗体调号(包含在Clontechs Advantage KlenTaq Polymerase Mix中) *悬浮沉淀和混合反应时,轻轻上下吹打,短暂离心以将成分沉于管底。 *用旋涡振荡酚:氯仿抽提混合物 *向混合物中最后加酶,轻轻上下吹打以将酶和混合物混匀 *不要增加酶量和反应的DNA浓度。量和浓度已优化好了。 *虽然不是要求的,推荐使用-32PdCTP进行第一链合成以定量产生的cDNA,确定DNA沉淀的效率,以利解决合成cDNA的困难。 B、 RNA的准备和处理 1、 一
16、般注意事项 完整的、纯的polyA RNA是合成高质量cDNA所必须的。为了避免RNA污染和降解,将RNase减少到最低程度,使用下面注意事项: 戴手套以避免手上的RNase污染。使用无气溶胶的吸尖以测量小体积和灭菌一次性吸管测量大体积 2、 RNA分离 使用相同试剂和方法 3、 RNA分析 总RNA和polyA RNA分离后,用甲醛变性胶/EB检测其完整性。乳动物总RNA典型表现为两条带,28和18S位于4。5和1。9KB,比率1。5-2。5:1。如果比率小于1:1,检查所有RNA分离试剂是否有RNA酶污染或找另外组织细胞分离RNA。乳动物polyA RNA表现为从0。5-12kb的Smea
17、r和弱的rRNA1.9, 4.5kb。质量差的RNA会引起高背景,不应使用。 C、 cDNA第一链的合成 使用tester、driver和对照polyA RNA完成本操作。本节得到的cDNA将作为以后步骤的对照cDNA。在下节,将通过加入少量质控cDNA(Hae3-消化的X174)到骨骼肌dsDNA以制作模拟tester cDNA。用这些骨骼肌tester和driver cDNA与自己的消减实验平行作一完整的对照消减实验。对照消减实验可用于估计合成的cDNA的产量和大小范围。它也是证明实验的多步骤是否有效的最好办法。 1、 对每一实验,对照和骨骼肌polyA RNA,在一消毒的0.5ml离心管
18、中混合下列成分(不要用聚苯乙烯管): polyA RNA (2g) 2-4l* cDNA合成引物(10M) 1l *对于对照合成,加入2l骨骼肌polyA RNA 如果需要,加入2l消毒水至终体积5l,混匀成分,短暂离心。 2、 在PCR仪中,70温育2分钟 3、 冰上冷却2分钟 4、 短暂离心 5、 每反应管加入下列成分: 5第一链缓冲液 2l dNTP Mix(10mM each) 1l 消毒水* 1l MMLV反转录酶(200u/l) 1l *为了监测cDNA合成的进展,将1l-32PdCTP(10mCi/ml, 3000Ci/mmol)以9l水稀释,代替上面的水加入以标记 6、 轻轻振
19、荡,短暂离心 7、 42,空气孵箱中1.5h 注:不要用水浴或PCR仪。蒸发可能减少反应混合物体积,减低反应效率。 8、 反应管置冰上以终止第一链合成并立即进入D节。 D、 cDNA第二链合成 使用每一第一链tester、driver和对照骨骼肌cDNA 1、 在第一链合成管中(含10l)加入预先冰上冷却的下列成分: 消毒水 48.4l 5第二链合成缓冲液 16.0l dNTP Mix(10mM) 1.6l 20第二链酶混合物 4.0l 2、 混匀并短暂离心,终体积应为80l 3、 16(水浴或PCR仪)孵育2小时 4、 加入2l(6u)T4 DNA多聚酶,混匀 5、 16孵育30分钟(水浴或
20、PCR仪) 6、 加入4l 20EDTA/glycogen混合物以终止第二链合成 7、 加入100l酚、氯仿、异戊醇混合物(25:24:1) 8、 混匀,14000rpm10min, RT 9、 取上清于另一清洁0.5ml离心管 10、 加入100l氯仿、异戊醇混合物(24:1) 11、 重复步骤8、9 12、 加入05cytokins such as interleukin-1, transforming growth factor0.5vol 4M NH4OAc 和2.5vol (总体积的)95%乙醇 13、 混匀,14000rpm20min, RT 14、 去上清 15、 如果使用-32
21、PdCTP,用Geiger计数器检测沉淀放射性 16、 沉淀中加入500l80%乙醇 17、 14000rpm10min 18、 去上清。如果使用-32PdCTP,用Geiger计数器检测沉淀放射性 19、 空气中晾10分钟以蒸发残留乙醇 20、 50l dH2O溶解沉淀 21、 取6l加入另一新干净离心管。储存样品于-20直到Rsa1消化物琼脂糖凝胶 电泳以估计产量和合成的cDNA大小(见V.A节) 22、 转E节 E、 Rsa1消化 用每一实验ds tester和driver cDNA,对照骨骼肌cDNA。这一步产生短的、平末端dscDNA 片段以供消减杂交和F节与adaptor连接。 1
22、、 在一试管中加入: ds cDNA 43.5l 10Rsa1缓冲液 5.0l Rsa1 (10u/l) 1.5l 2、 旋振混匀并短暂离心 3、 37孵育1.5小时 4、 用5l消化物分析Rsa1消化效率(参阅Section V.B) 5、 加2.5l 20EDTA/glycogen以终止反应 6、 加入50l酚、氯仿、异戊醇混合物(25:24:1) 7、 混匀 8、 14000rpm10min 9、 取上清置于一清洁0.5ml离心管 10、 加50l氯仿、异戊醇(24:1),混匀 11、 14000rpm10min 12、 上清移入一0.5ml清洁离心管 13、 加0.5vol 4M NH
23、4OAc和2.5vol 95%乙醇 14、 旋转混匀 15、 14000rpm, 20min, RT 16、 去上清 17、 80%乙醇200l洗沉淀 18、 14000rpm, 5min 19、 去上清,若使用-32PdCTP,用Geiger计数器测沉淀放射性 20、 空气干燥沉淀5-10min 21、 5.5l dH2O溶解沉淀,-20保存 准备实验driver cDNA和对照骨骼肌driver cDNA到此完成。按SectionF完成实验和对照骨骼肌tester cDNAs F、 Adaptor连接 准备adaptor连接的tester cDNA的实验计划如图3所示。对于每一个实验组te
24、ster cDNA和对照骨骼肌cDNA,需要制备一与Adaptor-1相连的tester(Tester1-1)和一与Adaptor-2相连的tester(Tester1-2),和一连接了双adaptors的tester cDNA(非杂交的tester control 1-c)。非杂交的tester对照用作消减杂交的阴性对照。Adaptors提供了不同的PCR引物退火位点。下面的步骤用于完成每个不同的实验cDNA和对照骨骼肌tester cDNA。Adaptor不能连于driver cDNA。 1、 对于每一实验tester cDNA,用7.5l消毒dH2O稀释来源于Section E的Rsa1
25、消化的实验cDNA。 2、 准备对照骨骼肌tester cDNA a、 短暂离心对照DNA(Hae3-消化的X174 DNA3ng/ml) b、 用38l 消毒水稀释2l DNA(至150ng/ml) c、 用5l 稀释的X174/Hae3 DNA混合1l 骨骼肌tester cDNA(来源于Section E) 这就是对照骨骼肌tester cDNA, 含0.2% Hae3-消化的X174 DNA,每一片段相当于总cDNA的0.02%。当用骨骼肌tester cDNA和driver cDNA消减杂交后,在最后的PCR产生的主要条带应对应于这些对照片段。 3、 准备用于所有连接和一个额外反应的
26、足够Master Mix,每一反应包括1l消毒dH2O,2l 5连接缓冲液和1.0l T4 DNA连接酶(400u/l) 注意:连接所需的ATP在T4 DNA连接酶里(初始为3Mm,结束时为300M) 4、 对于每一实验tester cDNA和对照骨骼肌tester cDNA,按下表顺在一0.5ml离心管中混合下列试剂,上下吹打以完全混匀。 表1、配制连接反应 (重复实验tester cDNA和对照骨骼肌cDNA) 管 号 成分 1 2 Tester1-1(l) Tester1-2(l) 稀释的实验tester cDNA 2 2 Adaptor1(10M) 2 - Adaptor2(10M)
27、- 2 H2O 2 2 Master Mix 4 4 终体积 10 10 5、 在一新的离心管中,混合2lTester1-1和Tester1-2,这就是非消减的tester control1-c。连接后,该管的1/3的cDNA分子会在其末端带上两个不同的adaptors 6、 短暂离心,16过夜 7、 加入1l EDTA/glycogen 混合物终止连接反应 8、 72, 5min以灭活连接酶 9、 短暂离心。制备实验和对照骨骼肌Adaptor连接的Tester cDNA 1-1和1-2就完成了。 10、从每一非消减tester control(1-c,2-c)取1l稀释于1ml H2O,该标
28、本将用于PCR扩增(Step IV 1.1) 11、标本储存于-20 完成连接效率分析(方法在SectionV.C),然后作Section IV.G G、 第一次杂交 重要启示:在进行下面描述的杂交之前,我们推荐完成连接效率分析(Section V.C,结果分析和困难指导)。如果连接没有成功,在杂交之前应重复连接反应。 在下面的过程中,每一tester cDNA均加入过量的cDNA,然后标本热变性和退火。退火之后,高丰度和低丰度序列的ss形式被均衡,因为由于二级杂交动力学的原因,高丰度的分子退火快。而且,留下的差异表达的ss cDNAs(为第二次杂交所需)明显富集,因为tester和drive
29、r cDNA非目标cDNA形成杂合体。 重要事项:开始杂交前,一定要使4杂交缓冲液已到室温至少15-20min。在使用缓冲液前,要保证没有可见颗粒和沉淀。如有必要,37加热10min以溶解任何沉淀。 1、 对于每一实验和骨骼肌消减杂交,在一0.5ml离心管中按下表混合试剂 表2、配制第一次杂交反应 (重复每一实验tester cDNA和对照骨骼肌cDNA) 杂交标本1(l) 杂交标本2(l) Rsa1-消化的driver cDNA 1.5 1.5 (来源于E2.1) Adaptor-1连接的Tester1-1 1.5 - (来源于F.8) Adaptor-2连接的Tester1-2 - 1.5 (来源于F.8) 4 杂交液 1.0 1.0 总体积 4.0 4.0 2、 覆盖石蜡油并短暂离心 3、 在PCR仪中,98,1.5min 4、 68杂交8小时,立即进入Section H 标本可以杂交短至6小时,长至12小时,但勿超过12小时 H、 第二次杂交 两份来自于第一次杂交的标本混合在一起,且新变性的driver cDNA 也可以进一步富集差异表达的序列。末端具有不同adaptor的代表不同表达的cDNA新杂合体分子就形成了。 注意:不要在此阶段变性第一次杂交的标本,也不要将杂交标本置于PCR仪外超过加入新的driver所需时间。 对于每一实验tester cDNA
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