抑制性削减杂交实验方法.docx

1、抑制性削减杂交实验方法抑制性削减杂交PCR 削减杂交是一强有力的使研究人员能够比较两种mRNA群和获得仅在一mRNA群表达而在另一mRNA群没有表达克隆的强有力的技术。虽然有几种不同的方法，但削减杂交背后的基本理论却非常简单。首先，两组mRNA均转化为cDNA：我们将含有特异(差异表达的)转录物称为“tester”,对照cDNA称为“driver”。Tester和Driver cDNA进行杂交，接着去除杂交序列。结果，保留的未杂交的cDNA就代表了那些仅在tester组表达，而在driver组不表达的mRNA。虽然传统的减法杂交方法在某些研究中已成功运用，但要求几轮的杂交且也不适合鉴定稀有信息

2、。CLONTECH PCR-Select cDNA削减杂交是唯一克服了传统减法杂交的这些缺点的方法。图1表示PCR-Select过程的简短回顾。本方法的几个特点使其具有高效和可重复性。方法仅要求0.5-2g polyA+ RNA，花34天时间，也不用分离ss和ds分子。而且，抑制性PCR预防了不需要的扩增而使目标分子得到富集。图2详细地描述了发生在PCR-Select cDNA消减杂交分子事件。首先，cDNA从0.5-2g的polyA+ RNA合成。Tester和driver cDNA以Rsa酶切，该酶为一四碱基限制性内切酶，产生平末端。Tester cDNA接着分成两部分，每一部分连一不同的

3、cDNA adaptor。 Adaptor的末端无磷酸基团，因此仅有adaptor的一链与cDNA 5末端相连。两adaptor具有不同的序列，这样当残留末端被补平后就能够同两个不同的PCR引物退火(Appendix B)。接着进行两轮杂交。首先，过量的driver cDNA 加入到每一tester样品，然后热变性和退火，在每一样品产生a、b、c和d分子(图2)。由于杂交二级动力学的原因，高丰度分子退火快，因此高和低丰度序列在a型分子中的浓度趋于均衡。同时，与在driver中没有差异表达的分子c、a型ss分子明显富集。在第二次杂交期间，两第一次杂交的样品不经变性直接混合。现在，仅有保持平衡的和

4、消减的ss tester cDNA能够重新配对形成新的e型杂交体。这些新杂交体成为具有不同的ds DNA分子，分别为tester1(与adaptor1相连)和tester2(分别与adaptor2相连)。将新变性的driver cDNA加入无需再次变性的已行第一次杂交反应的两混合物，进一步富集差异表达序列e型分子。经DNA多聚酶补平末端后，e型分子差异表达的tester序列在5和3端具有不同的退火位点。 接着整个分子群进行PCR以扩增需要的差异表达序列。在PCR中，a和d分子无引物退火位点，因而不能被扩增。由于抑制性PCR效应，绝大多数b型分子形成盘状结构而阻止其指数扩增(Appendix A

5、)。c型分子仅有一个引物结合位点而仅能被线性扩增。仅有e型分子，有两个不同adaptor，能被指数扩增，产生均衡的差异表达序列。 进而，进行第二次PCR扩增以进一步减少背景和富集差异表达序列。此时，差异表达的cDNA就能直接插入T/A克隆载体(例，使用CLONTECHs AdvanTAge PCR Cloning Kit, #k1901-1)或任何使用Rsa位点作为adaptor/cDNA 连接的载体。然后，差异表达的RNA能被测序、杂交分析鉴定。PCR混合物也可用作杂交探针进行DNA文库筛选。 如果你的起始材料有限，你可以用CapFinder PCR cDNA Synthesis Kit (

6、#k1052-1)预先扩增你的总RNA以用于PCR-Select Kit. 当总RNA 用常规方法合成cDNA时，即便是使用Oligo(dT)引物，核糖体RNA也会同polyA+ RNA一起被反转录。如果这种cDNA用于PCR-Select Kit，过量的核糖体RNA和低浓度的与PolyA+ RNA相对应的cDNA浓度将导致无效减法杂交。使用CapFinder PCR cDNA Synthesis Kit 可直接用于PCR-Select cDNA合成 tester和driver ds cDNA从待比较的mRNA合成 Rsa消化 Tester和driver cDNA分别消化以获得短的平末端分子

7、Adaptor连接 试验组平分成两份，分别连上不同的adaptor, 但driver cDNA无adaptor 第一次杂交 杂交动力学导致均衡和富集差异表达序列 第二次杂交 以产生用于PCR扩增模板的差异表达序列 第一次PCR扩增 使用抑制性PCR，仅差异表达的序列呈指数级扩增 第二次PCR扩增 背景减少，不同表达的序列进一步富集 图1. CLONTECH PCR-Select过程的概况，含特异转录物cDNA称tester，对照称driver 消减杂交，即便是总RNA用作起始材料(注意：使用CapFinder PCR cDNA Library Construction Kit AK1051-1

8、产生的擦与PCR-Select Kit 并不相容。) 一旦你确定了差异表达cDNA，那么Marathon&trade cDNA Amplification Kit (#K1802-1) Marathon Ready&trade cDNA可以提供优秀的克隆相应全长的方法(Chenchik et al. 1996)。欲求更多的信息，参阅相关产物的描述。 二、试剂成分表 RNA存于-70，储存4杂交液于室温。其它储存于-20。本试剂盒提供的足够7次cDNA合成的试剂。每次反应最好使用2g polyA RNA，但也可少至0.5g。但是，如果使用低于2g的polyA RNA，在消减过程中，低丰度的差异c

9、DNA可能丢失。7次cDNA合成相当于6次完全的消减实验和1次对照。如果每次合成用于不同实验的tester和driver(在特殊系统鉴定上调或下调cDNA)，PCR试剂足够50次primary和100次secondary PCR反应。参阅附录B的primer和adaptor序列。 第一链的合成 * 7l MMLV反转录酶（200u/l） 10l cDNA合成引物 （10M） 200l 5第一链缓冲液 250mM Tris-HCl (pH8.3) 30nM MgCl2 375mM KCl 第二链合成 *28l 20第二链酶混合物 （DNA多聚酶1，RNase H, 0.2u/l, E.coli

10、DNA连接酶，1.2u/l） *200l 5第二链缓冲液 500mM KCl 50mM Ammonium Sulfate 25mM MgCl2 0.75mM -NAD 100mM Tris-HCl (pH7.5) 0.25mg/ml 牛血清白蛋白 *14l T4 DNA多聚酶（3u/l） 内切酶消化 *200l 10Rsa1 限制缓冲液 100mM Bis Tris Propane-HCl (pH7.0) 100mM MgCl2 1mM DTT *11l Rsa1 (10u/l) Adaptor 连接 *21l T4DNA 连接酶 （400u/l; 含3mM ATP） * 30l Adapto

11、r1 (10M) * 30l Adaptor2 (10M) *200l 5DNA连接缓冲液 250mM Tris-HCl (pH7.8) 50mM MgCl2 10mM DTT 0. 25mg/ml BSA 杂交 *200l 4杂交缓冲液 *1.4ml 稀释缓冲液 20mM HEPES-HCl (pH8.3) 50mM NaCl 0.2nM EDTA (pH8.0) PCR扩增 *50l PCR引物1 （10M） *100l 巢氏PCR引物1 （10lM） *100l 巢氏PCR引物2 （10M） *10l 质控消减cDNA 对照实验 *5l 对照polyA RNA (来源于人骨骼肌) *10

12、l 对照DNA （3lg/l ） (Hae-消化的细菌噬菌体x174 DNA) *50l G3PDH 5 引物（10M） *50l G3PDH 3 引物 （10M） 这些引物可以扩增人、大鼠、小鼠G3PDH 一般试剂 *20l dNTP*混合物 10mM each dATP, dCTP, dGTP, dTTP *100l 20EDTA/glycogen mix (0.2M EDTA; 1mg/ml glycogen) *400l NH4OAc (4M) *1ml 灭菌水 三、另外所需试剂 下面的试剂是需要的，但未提供 *Hae3消化的噬菌体X174（#6310-1，2）：凝胶上DNA Mark

13、er用 *0.5mlPCR反应管，推荐Perkin-Elmer GeneAmp *80%和96%乙醇 *酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）。按下配制： 1、 重蒸酚 2、 等体积灭菌TNE缓冲液平衡（50mM Tris,Ph7.5, 150mM NaCl, 1mM EDTA） 3、 室温下2-3小时 4、 去除上层水相 5、 加入等体积氯仿：异戊醇(24：1)，完全混合，去除上层相 6、 储存下层酚：氯仿：异戊醇于4，最多2周 *氯仿：异戊醇(24：1) *50PCR酶混合物 推荐ClonTECH Advantage TM KlenTaq Polymerase Mix(#8417-1) *10

14、PCR缓冲液 *dNTP混合物（10mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP） *TAE 电泳缓冲液 配制50储存液： 242g Tris 57.1ml Hac 37.2g Na2EDTA.2H2O 加水至1升 四、Clontech PCR-Select cDNA消减步骤 A、 一般事项 *戴手套以防RNA和cDNA样品被核酸酶降解 *本手册的循环参数已使用Perkin-Elmer DNA Thermal Cycle 480和 Perkin-Elmer GeneAmp Systems 2400/9600优化。不同的循环仪可能需要不同的循环次数、50polymerase 混合物和模板

15、*必须使用热启动以减少非特异DNA合成。我们推荐TaqStart Antibody或人工热启动。本步骤已用TaqStart抗体调号(包含在Clontechs Advantage KlenTaq Polymerase Mix中) *悬浮沉淀和混合反应时，轻轻上下吹打，短暂离心以将成分沉于管底。 *用旋涡振荡酚：氯仿抽提混合物 *向混合物中最后加酶，轻轻上下吹打以将酶和混合物混匀 *不要增加酶量和反应的DNA浓度。量和浓度已优化好了。 *虽然不是要求的，推荐使用-32PdCTP进行第一链合成以定量产生的cDNA，确定DNA沉淀的效率，以利解决合成cDNA的困难。 B、 RNA的准备和处理 1、 一

16、般注意事项 完整的、纯的polyA RNA是合成高质量cDNA所必须的。为了避免RNA污染和降解，将RNase减少到最低程度，使用下面注意事项： 戴手套以避免手上的RNase污染。使用无气溶胶的吸尖以测量小体积和灭菌一次性吸管测量大体积 2、 RNA分离 使用相同试剂和方法 3、 RNA分析 总RNA和polyA RNA分离后，用甲醛变性胶/EB检测其完整性。乳动物总RNA典型表现为两条带，28和18S位于4。5和1。9KB，比率1。5-2。5：1。如果比率小于1：1，检查所有RNA分离试剂是否有RNA酶污染或找另外组织细胞分离RNA。乳动物polyA RNA表现为从0。5-12kb的Smea

17、r和弱的rRNA1.9, 4.5kb。质量差的RNA会引起高背景，不应使用。 C、 cDNA第一链的合成 使用tester、driver和对照polyA RNA完成本操作。本节得到的cDNA将作为以后步骤的对照cDNA。在下节，将通过加入少量质控cDNA(Hae3-消化的X174)到骨骼肌dsDNA以制作模拟tester cDNA。用这些骨骼肌tester和driver cDNA与自己的消减实验平行作一完整的对照消减实验。对照消减实验可用于估计合成的cDNA的产量和大小范围。它也是证明实验的多步骤是否有效的最好办法。 1、 对每一实验，对照和骨骼肌polyA RNA，在一消毒的0.5ml离心管

18、中混合下列成分(不要用聚苯乙烯管)： polyA RNA （2g） 2-4l* cDNA合成引物(10M) 1l *对于对照合成，加入2l骨骼肌polyA RNA 如果需要，加入2l消毒水至终体积5l，混匀成分，短暂离心。 2、 在PCR仪中，70温育2分钟 3、 冰上冷却2分钟 4、 短暂离心 5、 每反应管加入下列成分： 5第一链缓冲液 2l dNTP Mix(10mM each) 1l 消毒水* 1l MMLV反转录酶(200u/l) 1l *为了监测cDNA合成的进展，将1l-32PdCTP(10mCi/ml, 3000Ci/mmol)以9l水稀释，代替上面的水加入以标记 6、 轻轻振

19、荡，短暂离心 7、 42，空气孵箱中1.5h 注：不要用水浴或PCR仪。蒸发可能减少反应混合物体积，减低反应效率。 8、 反应管置冰上以终止第一链合成并立即进入D节。 D、 cDNA第二链合成 使用每一第一链tester、driver和对照骨骼肌cDNA 1、 在第一链合成管中(含10l)加入预先冰上冷却的下列成分： 消毒水 48.4l 5第二链合成缓冲液 16.0l dNTP Mix(10mM) 1.6l 20第二链酶混合物 4.0l 2、 混匀并短暂离心，终体积应为80l 3、 16(水浴或PCR仪)孵育2小时 4、 加入2l（6u）T4 DNA多聚酶，混匀 5、 16孵育30分钟(水浴或

20、PCR仪) 6、 加入4l 20EDTA/glycogen混合物以终止第二链合成 7、 加入100l酚、氯仿、异戊醇混合物(25:24:1) 8、 混匀，14000rpm10min, RT 9、 取上清于另一清洁0.5ml离心管 10、 加入100l氯仿、异戊醇混合物(24：1) 11、 重复步骤8、9 12、 加入05cytokins such as interleukin-1, transforming growth factor0.5vol 4M NH4OAc 和2.5vol (总体积的)95%乙醇 13、 混匀，14000rpm20min, RT 14、 去上清 15、 如果使用-32

21、PdCTP，用Geiger计数器检测沉淀放射性 16、 沉淀中加入500l80%乙醇 17、 14000rpm10min 18、 去上清。如果使用-32PdCTP，用Geiger计数器检测沉淀放射性 19、 空气中晾10分钟以蒸发残留乙醇 20、 50l dH2O溶解沉淀 21、 取6l加入另一新干净离心管。储存样品于-20直到Rsa1消化物琼脂糖凝胶 电泳以估计产量和合成的cDNA大小(见V.A节) 22、 转E节 E、 Rsa1消化 用每一实验ds tester和driver cDNA，对照骨骼肌cDNA。这一步产生短的、平末端dscDNA 片段以供消减杂交和F节与adaptor连接。 1

22、、 在一试管中加入： ds cDNA 43.5l 10Rsa1缓冲液 5.0l Rsa1 (10u/l) 1.5l 2、 旋振混匀并短暂离心 3、 37孵育1.5小时 4、 用5l消化物分析Rsa1消化效率(参阅Section V.B) 5、 加2.5l 20EDTA/glycogen以终止反应 6、 加入50l酚、氯仿、异戊醇混合物(25：24：1) 7、 混匀 8、 14000rpm10min 9、 取上清置于一清洁0.5ml离心管 10、 加50l氯仿、异戊醇(24：1)，混匀 11、 14000rpm10min 12、 上清移入一0.5ml清洁离心管 13、 加0.5vol 4M NH

23、4OAc和2.5vol 95%乙醇 14、 旋转混匀 15、 14000rpm, 20min, RT 16、 去上清 17、 80%乙醇200l洗沉淀 18、 14000rpm, 5min 19、 去上清，若使用-32PdCTP，用Geiger计数器测沉淀放射性 20、 空气干燥沉淀5-10min 21、 5.5l dH2O溶解沉淀，-20保存 准备实验driver cDNA和对照骨骼肌driver cDNA到此完成。按SectionF完成实验和对照骨骼肌tester cDNAs F、 Adaptor连接 准备adaptor连接的tester cDNA的实验计划如图3所示。对于每一个实验组te

24、ster cDNA和对照骨骼肌cDNA，需要制备一与Adaptor-1相连的tester(Tester1-1)和一与Adaptor-2相连的tester(Tester1-2),和一连接了双adaptors的tester cDNA(非杂交的tester control 1-c)。非杂交的tester对照用作消减杂交的阴性对照。Adaptors提供了不同的PCR引物退火位点。下面的步骤用于完成每个不同的实验cDNA和对照骨骼肌tester cDNA。Adaptor不能连于driver cDNA。 1、 对于每一实验tester cDNA，用7.5l消毒dH2O稀释来源于Section E的Rsa1

25、消化的实验cDNA。 2、 准备对照骨骼肌tester cDNA a、 短暂离心对照DNA(Hae3-消化的X174 DNA3ng/ml) b、 用38l 消毒水稀释2l DNA(至150ng/ml) c、 用5l 稀释的X174/Hae3 DNA混合1l 骨骼肌tester cDNA(来源于Section E) 这就是对照骨骼肌tester cDNA, 含0.2% Hae3-消化的X174 DNA，每一片段相当于总cDNA的0.02%。当用骨骼肌tester cDNA和driver cDNA消减杂交后，在最后的PCR产生的主要条带应对应于这些对照片段。 3、 准备用于所有连接和一个额外反应的

26、足够Master Mix，每一反应包括1l消毒dH2O，2l 5连接缓冲液和1.0l T4 DNA连接酶(400u/l) 注意：连接所需的ATP在T4 DNA连接酶里(初始为3Mm，结束时为300M) 4、 对于每一实验tester cDNA和对照骨骼肌tester cDNA，按下表顺在一0.5ml离心管中混合下列试剂，上下吹打以完全混匀。 表1、配制连接反应 (重复实验tester cDNA和对照骨骼肌cDNA) 管 号 成分 1 2 Tester1-1(l) Tester1-2(l) 稀释的实验tester cDNA 2 2 Adaptor1(10M) 2 - Adaptor2(10M)

27、- 2 H2O 2 2 Master Mix 4 4 终体积 10 10 5、 在一新的离心管中，混合2lTester1-1和Tester1-2，这就是非消减的tester control1-c。连接后，该管的1/3的cDNA分子会在其末端带上两个不同的adaptors 6、 短暂离心，16过夜 7、 加入1l EDTA/glycogen 混合物终止连接反应 8、 72， 5min以灭活连接酶 9、 短暂离心。制备实验和对照骨骼肌Adaptor连接的Tester cDNA 1-1和1-2就完成了。 10、从每一非消减tester control(1-c，2-c)取1l稀释于1ml H2O，该标

28、本将用于PCR扩增(Step IV 1.1) 11、标本储存于-20 完成连接效率分析(方法在SectionV.C)，然后作Section IV.G G、 第一次杂交 重要启示：在进行下面描述的杂交之前，我们推荐完成连接效率分析(Section V.C,结果分析和困难指导)。如果连接没有成功，在杂交之前应重复连接反应。 在下面的过程中，每一tester cDNA均加入过量的cDNA，然后标本热变性和退火。退火之后，高丰度和低丰度序列的ss形式被均衡，因为由于二级杂交动力学的原因，高丰度的分子退火快。而且，留下的差异表达的ss cDNAs(为第二次杂交所需)明显富集，因为tester和drive

29、r cDNA非目标cDNA形成杂合体。 重要事项：开始杂交前，一定要使4杂交缓冲液已到室温至少15-20min。在使用缓冲液前，要保证没有可见颗粒和沉淀。如有必要，37加热10min以溶解任何沉淀。 1、 对于每一实验和骨骼肌消减杂交，在一0.5ml离心管中按下表混合试剂 表2、配制第一次杂交反应 (重复每一实验tester cDNA和对照骨骼肌cDNA) 杂交标本1(l) 杂交标本2(l) Rsa1-消化的driver cDNA 1.5 1.5 (来源于E2.1) Adaptor-1连接的Tester1-1 1.5 - (来源于F.8) Adaptor-2连接的Tester1-2 - 1.5 (来源于F.8) 4 杂交液 1.0 1.0 总体积 4.0 4.0 2、 覆盖石蜡油并短暂离心 3、 在PCR仪中，98，1.5min 4、 68杂交8小时，立即进入Section H 标本可以杂交短至6小时，长至12小时，但勿超过12小时 H、 第二次杂交 两份来自于第一次杂交的标本混合在一起，且新变性的driver cDNA 也可以进一步富集差异表达的序列。末端具有不同adaptor的代表不同表达的cDNA新杂合体分子就形成了。 注意：不要在此阶段变性第一次杂交的标本，也不要将杂交标本置于PCR仪外超过加入新的driver所需时间。 对于每一实验tester cDNA