牛奶中部分成分的分析.docx

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牛奶中部分成分的分析

1.实验目的

1.1设计合适的实验方法来分析牛奶中蛋白质与钙的含量

1.2学习利用等电点沉淀法从牛奶中制备酪蛋白

1.3熟悉可见光分光光度计的操作。

1.4加强对沉淀、抽滤、溶液配制等基本操作的锻炼。

1.5掌握双缩脲法测定蛋白质的原理和方法。

1.6掌握配位滴定法测定液体食品中钙含量的原理和方法。

1.7通过与牛奶包装上注明的含量比较，学会对自己实验分析结果进行客观评价。

2.实验原理

牛乳中的主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g·L-1。

酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。

利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。

用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯酪蛋白。

双缩脲（NH2CONHCONH2）在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色化合物，称为双缩脲反应，蛋白质分子中含有许多肽键在碱性溶液中也能与Cu2+反应产生紫红色化合物。

在一定范围内，其颜色的深浅与蛋白质浓度成正比。

因此，可以利用比色法测定蛋白质浓度。

双缩脲法是测定蛋白质浓度的常用方法之一。

操作简便、迅速、受蛋白质种类性质的影响较小，但灵敏度较差，而且特异性不高。

除-CONH-有此反应外，-CONH2、-CH2NH2、-CS-NH2等基团也有此反应。

钙与身体健康息息相关，钙除成骨以支撑身体外，还参与人体的代谢活动，它是细胞的主要阳离子，还是人体最活跃的元素之一，缺钙可导致儿童佝偻病，青少年发育迟缓，孕妇高血压，老年人的骨质疏松症。

缺钙还可引起神经病，糖尿病，外伤流血不止等多种过敏性疾病。

补钙越来越被人们所重视。

牛奶中含有易被人体吸收得钙，有些牛奶产品中还特地加钙而成为钙奶。

对于液体牛奶中钙的含量，可采用EDTA法进行直接测定。

考虑到牛奶中含有Fe3+、Al3+等干扰离子，可以加入少量三乙醇胺以消除它们的，调节pH≈12～13，以铬蓝黑R作指示剂，指示剂与钙生成红色的络合物，当用EDTA滴定至计量点时，游离出指示剂，溶液呈现蓝色。

3.实验步骤

3.1主要原料和仪器

3.1.1材料

新鲜牛奶、加钙牛奶

3.1.2试剂

95%乙醇、无水乙醚、醋酸、醋酸钠、NaOH、CuSO4·5H2O、酒石酸钾、碘化钾、牛血清蛋白（BSA）、EDTA、基准物质CaCO3、HCl、三乙醇胺、钙指示剂

3.1.2.10.5mol·L-1pH4.7醋酸-醋酸钠缓冲液

先配A液与B液。

A液：

0.5mol/L醋酸钠溶液。

B液：

0.5mol/L醋酸溶液。

A液：

4.1g醋酸钠，加水至100ml定容；B液：

2.85ml醋酸，加水至100ml定容

取A液50mL，B液50mL混合即得pH4.7的HAc-NaAc缓冲液100mL。

3.1.2.2乙醇—乙醚混合液：

乙醇:

乙醚=1:

1（V/V）95%乙醇和乙醚各25ml

3.1.2.3NaOH（6mol·L-1）：

称取24g氢氧化钠溶于100mL水中。

3.1.2.4双缩脲试剂：

称取CuS04·5H2O3.0g，酒石酸钾9.0g和碘化钾5.0g，分别溶解后混匀，加6mol·L-1NaOHl00mL，最后加水至1000mL，贮于棕色瓶中，避光，可长期保存。

3.1.2.50.9％NaCl（即生理盐水）1.8gNaCl200ml水

3.1.2.6蛋白质标准液（10mg·mL-1），用小烧杯称取干燥的牛血清蛋白100.0mg，以少量生理盐水溶解后倒入l0mL容量瓶中，淋洗小烧杯数次，一并倒入容量瓶中，最后加生理盐水至刻度线。

3.1.2.7待测蛋白样本：

将牛奶样品用生理盐水准确配制成一定浓度的溶液后再测定；将制得的酪蛋白用生理盐水准确配制成一定浓度的溶液后再测定。

（如若不能溶解，滴加几滴6mol·L-1NaOH溶液、分别用l0mL容量瓶定容），量取30.00ml纯牛奶，倒入100ml容量瓶中，定容。

3.1.2.8EDTA（0.01mol·L-1）：

称取2.0gEDTA二钠盐，用温热水溶解后，稀释至500mL，储存于聚乙烯塑料瓶中。

3.1.2.9CaCO3标准溶液（0.01mol·L-1）：

准确称取基准物质CaCO30.1g左右，先以少量水润湿，再逐滴小心加入6mol·L-1HCl，至CaCO3完全溶解，定量转入100mL容量瓶中，以水稀释至刻度，并计算其浓度。

3.1.2.10NaOH（5mol·L-1）20gNaOH100ml水

3.1.2.11HCl（6mol·L-1）50ml浓盐酸（12mol/L）50ml水

3.1.2.12三乙醇胺（200g·L-1）20g三乙醇胺100ml水

3.1.2.13铬蓝黑R（5g·L-1）乙醇溶液0.5g铬蓝黑R100ml乙醇

3.1.2.14注意：

本实验中需要准确称量的物质质量：

0.2mol·L-1pH4.7醋酸-醋酸钠缓冲液、蛋白质标准液（10mg·mL-1）、锌标准溶液（1.00µg·mL-1）、双硫腙四氯化碳溶液；

要准确量取的溶液体积：

牛奶的用量、EDTA（0.01mol·L-1）、蛋白质标准液、待测蛋白样品、0.9%NaCl、双缩脲试剂、铁标准溶液、盐酸羟胺溶液、邻二氮菲溶液、醋酸钠溶液、铁标准溶液、四氯化碳、缓冲溶液、硫代硫酸钠溶液。

3.1.3仪器

试管、移液管（1mL、2mL、5mL10mL、20mL）、l0mL容量瓶、烧杯、表面皿、250mL锥形瓶、1000mL棕色试剂瓶、10mL具塞比色管×8和比色管架、试管、试管架、50mL离心管×2、容量瓶（100mL、250mL若干）、烧杯（150mL、250mL若干）

分析天平（内置2个称量瓶）、可见光分光光度计、离心机、抽滤装置、酸度计、精密pH试纸（可测pH4.7）、电炉、温度计、水浴箱。

3.2牛奶中酪蛋白的提取

3.2.1酪蛋白的粗提

50mL鲜牛奶加热至40℃。

在搅拌下慢慢加入预热至40℃、pH4.7的醋酸缓冲液（40mL左右），用精密pH试纸或酸度计调pH至4.7。

（pH调不好，出不来沉淀）

将上述悬浮液冷却至室温。

（7楼734）离心15分钟（3000r·min-1）。

弃去清液，得酪蛋白粗制品。

3.2.2酪蛋白的纯化

用水洗涤沉淀3次，离心10分钟（3000r·min-1），弃去上清液。

在沉淀中加入30mL乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。

用乙醇-乙醚混合液洗沉淀2次。

最后用乙醚洗沉淀2次，抽干（抽滤困难）。

将沉淀摊开在表面皿上，风干；得酪蛋白纯品。

3.2.3准确称重，计算含量和得率

含量：

酪蛋白g/（100mL）牛乳

3.3酪蛋白含量的测定

3.3.1标准曲线的绘制与样品的测定

取试管8支，按下表操作。

表1酪蛋白含量的测定

测定管1

测定管2

蛋白质标准液（mL）

－

0.40

0.80

1.20

1.60

2.00

－

待测蛋白样品（mL）

－

2.00

0.9%NaCl（mL）

2.00

1.60

1.20

0.80

0.40

－

双缩脲试剂（mL）

8.00

吸光度A

蛋白质浓度（g/100mL）

各管混匀、放置37℃水浴中保温20min。

540nm比色，以空白管（1号管）调零点，读取各管吸光度值。

3.3.2计算

在电脑上以吸光度值为纵坐标，以蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。

从标准曲线中查出待测样本的蛋白质浓度（g·L-1），并求出牛奶中蛋白质浓度。

由此浓度计算出100mL鲜牛奶中酪蛋白的真实含量。

3.4钙含量的测定

3.4.1EDTA溶液浓度的标定

准确移取20.00mLCaCO3标准溶液3份分别于250mL锥形瓶中，加入2mLNaOH溶液，铬蓝黑R指示剂3~4滴（视指示剂的有效浓度而定），用EDTA溶液滴定至溶液由红色变为蓝色即为终点，根据滴定用去EDTA毫升数和CaCO3标准溶液的浓度，计算EDTA溶液的浓度。

表1EDTA浓度的标定

实验序号

Ca2+标液体积/mL

EDTA/mL

初始读数

终点读数

消耗体积

EDTA浓度/mol·L-1

EDTA平均浓度/mol·L-1

3.4.2钙制剂钙含量的测定

准确移取50.00ml（20.00ml，仪器里面最大是20.00ml移液管）的鲜牛奶和钙奶，分别转移到100mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。

准确移取上述试液20.00mL，加入三乙醇胺溶液5mL，5mol·L-1NaOH4mL，加入水20mL，摇匀，加铬蓝黑R3~4滴，用0.01mol·L-1EDTA标准溶液滴定，接近终点时再补加2～3滴铬蓝黑R，当溶液由红色变为蓝色即为终点，根据消耗EDTA的体积，计算出鲜奶和钙奶中钙的含量（mg/100mL），并与包装上注明的含量作比较。

（消耗约25mlEDTA）

表2钙含量的测定

纯牛奶

高钙奶

样品（ml）

20.00

EDTA（ml）

滴定前

滴定后

消耗量

EDTA消耗量平均值（ml）

钙含量（mg/100ml）

103.43

126.98

3.4.3注意事项

量取鲜奶和钙奶的量视钙含量多少而确定，以消耗0.01mol·L-1EDTA体积为20~30mL。

由于牛奶、钙奶均为乳白色，终点颜色变化不太明显，接近终点时再补加2～3滴指示剂。

4.实验结果

4.1酪蛋白含量的测定

表1酪蛋白含量的测定

牛奶管

酪蛋白管

蛋白质标准液（mL）

－

0.40

0.80

1.20

1.60

2.00

－

待测蛋白样品（mL）

－

2.00

0.9%NaCl（mL）

2.00

1.60

1.20

0.80

0.40

－

双缩脲试剂（mL）

8.00

吸光度A

0.000

0.098

0.179

0.266

0.366

0.457

0.153

0.284

蛋白质浓度（g/100mL）

0.000

0.040

0.080

0.120

0.160

0.200

0.067

0.124

图1酪蛋白含量的测定

4.2钙含量的测定

表1EDTA浓度的标定

实验序号

Ca2+标液体积/mL

20.00

EDTA/mL

初始读数

0.00

终点读数

20.20

20.12

20.20

消耗体积

20.20

20.12

20.20

EDTA浓度/mol·L-1

0.0101

0.01006

0.0101

EDTA平均浓度/mol·L-1

0.01008

表2钙含量的测定

纯牛奶

高钙奶

样品（ml）

20.00

EDTA（ml）

滴定前

0.00

滴定后

25.55

25.60

25.66

31.30

31.52

31.48

消耗量

25.55

25.60

25.66

31.30

31.52

31.48

EDTA消耗量平均值（ml）

25.60

31.43

钙含量（mg/100ml）

103.43

126.98

5.分析讨论

5.1了解蛋白质及钙、铁、锌等微量元素与人体健康的关系

答：

（1）蛋白质是荷兰科学家格里特在1838年发现的。

他观察到有生命的东西离开了蛋白质就不能生存。

蛋白质是生物体内一种极重要的高分子有机物，占人体干重的54%。

蛋白质主要由氨基酸组成，因氨基酸的组合排列不同而组成各种类型的蛋白质。

人体中估计有10万种以上的蛋白质。

生命是物质运动的高级形式，这种运动方式是通过蛋白质来实现的，所以蛋白质有极其重要的生物学意义。

人体的生长、发育、运动、遗传、繁殖等一切生命活动都离不开蛋白质。

生命运动需要蛋白质，也离不开蛋白质。

人体内的一些生理活性物质如胺类、神经递质、多肽类激素、抗体、酶、核蛋白以及细胞膜上、血液中起“载体”作用的蛋白都离不开蛋白质，它对调节生理功能，维持新陈代谢起着极其重要的作用。

人体运动系统中肌肉的成分以及肌肉在收缩、作功、完成动作过程中的代谢无不与蛋白质有关，离开了蛋白质，体育锻炼就无从谈起。

　　在生物学中，蛋白质被解释为是由氨基酸借肽键联接起来形成的多肽，然后由多肽连接起来形成的物质。

通俗易懂些说，它就是构成人体组织器官的支架和主要物质，在人体生命活动中，起着重要作用，可以说没有蛋白质就没有生命活动的存在。

每天的饮食中蛋白质主要存在于瘦肉、蛋类、豆类及鱼类中。

　　蛋白质缺乏：

成年人：

肌肉消瘦、肌体免疫力下降、贫血，严重者将产生水肿。

未成年人：

生长发育停滞、贫血、智力发育差，视觉差。

蛋白质过量：

蛋白质在体内不能贮存，多了肌体无法吸收，过量摄入蛋白质，将会因代谢障碍产生蛋白质中毒甚至于死亡。

（2）钙是一种生命必需元素，也是人体中含量最丰富的大量金属元素，含量仅次于C、H、O、N，正常人体内含钙大约1～1.25kg，约占体重的2%。

每千克无脂肪组织中平均含20～25g。

身体的钙大多分布在骨骼和牙齿中，约占总量锝99%，其余1%分布在血液、细胞间液及软组织中。

钙是人体骨骼和牙齿的重要成分，它参与人体的许多酶反应、血液凝固，维持心肌的正常收缩，抑制神经肌肉的兴奋，巩固和保持细胞膜的完整性。

缺钙会引起软骨病，神经松弛，抽搐，骨质疏松，凝血机制差，腰腿酸痛。

膳食中的钙主要在pH较低的小肠上段吸收。

钙的吸收与年龄有关，随年龄增长其吸收率下降，婴儿钙的吸收率超过50%，儿童约为40%，成人仅为20%左右。

一般在40岁以后，钙吸收率逐年下降，老年骨质疏松与此有关。

影响钙吸收的因素有膳食中谷物的植酸和蔬菜（某些）中的草酸；脂肪过多或脂肪消化不良等；以及抗酸药、四环素、肝素等。

有利钙吸收的因素，有维生素D、某些氨基酸、乳糖和适当的钙与磷的比例。

日常生活中，如果钙摄入不足，人体就会出现生理性钙透支，造成血钙水平下降。

当血钙水平下降到一定阈值时，就会促使甲状旁腺分泌甲状旁腺素。

甲状旁腺素具有破骨作用，即将骨骼中的钙反抽调出来，藉以维持血钙水平。

在缺钙初期，缺钙程度比较轻的时候，只是发生可逆性生理功能异常，如心脏出现室性早博、情绪不稳定、睡眠质量下降等反应。

持续的低血钙，特别是中年以后，人体长期处于负钙平衡状态，导致甲状旁腺分泌亢进，首当其冲的是骨骼，由于骨钙持续大量释出，导致骨质疏松和骨质增生。

另一方面，在甲状旁腺持续升高的情况下，由于甲状旁腺素具有促使细胞膜上钙通道开启而关不住，以及阻抑钙泵，使钙泵功能减弱，造成细胞内钙含量升高。

持续的细胞内高钙，激发细胞像失控的野马，无节制亢进，造成细胞能量耗竭。

与此同时，代谢废物又得不到及时消除，便会构成自身伤害，致使细胞趋向反常的钙化衰亡。

由于缺钙，导致骨质疏松、骨质增生、儿童佝偻病、手足抽搐症以及高血压、肾结石、结肠癌、老年痴呆等疾病的发生。

钙对人体的重要作用是不可替代的，钙缺乏病是常见的营养性疾病，为预防缺乏病，在日常生活中我们应注意科学合理地补充钙。

（3）铁是人体需要量最多的微量元素，一个成年人，全身含铁量约3～5克，其中除了70～80％是以血红蛋白的形式，存在于红细胞中外，约10％分布在肌肉和其他细胞中，是肌红蛋白及含铁酶的构成成分之一。

还有一部分称为贮备铁，贮备在肝脏、脾脏、骨髓、肠和胎盘中，约占总量的15～20％。

此外，还有少量的铁，以与蛋白质相结合的形式，存在于血浆中，称为血浆铁，数量约为3毫克。

血红蛋白能将氧气送至全身组织，肌红蛋白和氧的结合力很强，能储备部分氧气，在骨骼肌缺氧时可以释放这部分氧。

铁是血红蛋白的重要组成部分，如果铁供给不足，血红蛋白的合成就会受到影响，就会患贫血，医学上叫营养性缺铁性贫血，是儿童的一种常见病。

对婴儿来说，由于母乳中铁含量较低，胎儿期从母体获得并储存在体内的铁会在生后6个月左右消耗完毕，如果辅食添加不及时，婴儿会在出生6个月左右开始发生铁缺乏症，进而出现贫血症状。

（4）锌是仅次于铁的需要量较大的微量元素，是200多种含锌酶的组成成分，也是酶的激活剂，以锌为主要成员的锌指蛋白在核酸代谢和蛋白质合成中发挥重要作用。

缺锌会引起营养不良，生殖系统失调，还对酶有一定的活性作用和对蛋白质有一定的稳定作用。

科学家研究表明，锌参与了人体内80多种酶的代谢过程，尤其DNA和RNA聚合酶，它直接参与核酸蛋白质的合成，细胞的分化和增殖以及许多代谢，人体内还有一些酶需要锌的激活，而发挥其活性作用，因此，锌是人体生长发育、生殖遗传、免疫内分泌、神经、体液等重要生理过程中必不可少的物质，缺锌会对人体的各系统产生不利影响，所以锌被人们誉为“生命之花”。

另外，锌还与大脑发育和智力有关。

美国一个大学发现,聪明、学习好的青少年,体内含锌量均比愚钝者高。

锌还有促进淋巴细胞增殖和活动能力的作用,对维持上皮和粘膜组织正常、防御细菌、病毒侵入、促进伤口愈合、减少痤疮等皮肤病变,及校正味觉失灵等均有妙用。

（5）微量元素在体内的作用

　　①协助普通元素的输送，例如铁是血红蛋白的一个重要部分，血红蛋白之所以能把氧带到全身每一个细胞去，主要是依靠铁。

　　②微量元素为酶的活性不可缺少的因子，有些是酶的激活剂，如锌离子能激活肠磷酸酶及肝、肾过氧化氢酶，为胰岛素合成所必需。

　　③参与激素的作用。

④一些微量元素能影响核酸代谢，儿童正处于生长发育时期，除了需要更多的碳水化合物、脂肪、蛋白质等营养素外，还需要一定量的铁、锌、铜等等。

其中尤为铁、锌最为重要。

铁的摄入量不足，会发生缺铁性贫血，轻度缺铁的儿童注意力会明显降低，进而影响学习。

缺锌会影响骨骼生长和性发育，表现为食欲不振、味觉不灵敏，身高体重都赶不上正常的儿童。

因此，儿童的饮食一定要多样化，以保证充足的营养成分。

5.2本实验中哪些物质质量需要准确称量，那些溶液体积需要准确量取？

答：

本实验中需要准确称量的物质质量：

0.2mol·L-1pH4.7醋酸-醋酸钠缓冲液、蛋白质标准液（10mg·mL-1）、锌标准溶液（1.00µg·mL-1）、双硫腙四氯化碳溶液；

要准确量取的溶液体积：

牛奶的用量、EDTA（0.01mol·L-1）、蛋白质标准液、待测蛋白样品、0.9%NaCl、双缩脲试剂、铁标准溶液、盐酸羟胺溶液、邻二氮菲溶液、醋酸钠溶液、铁标准溶液、四氯化碳、缓冲溶液、硫代硫酸钠溶液、双硫腙四氯化碳。

5.3除本实验选用的方法外，测定蛋白质、钙还有那些方法？

答：

（1）五种蛋白质测定方法比较如下：

方法

灵敏度

时间

原理

干扰物质

说明

凯氏定氮法

（Kjedahl法）

灵敏度低，适用于0.2~1.0mg氮，误差为2％

费时

8～10小时

将蛋白氮转化为氨，用酸吸收后滴定

非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离）

用于标准蛋白质含量的准确测定；干扰少；费时太长

双缩脲法（Biuret法）

灵敏度低

1～20mg

中速

20~30分钟

多肽键＋碱性Cu2＋紫色络合物

硫酸铵；

Tris缓冲液；

某些氨基酸

用于快速测定，但不太灵敏；不同蛋白质显色相似

紫外吸收法

较为灵敏

50～100g

快速

5～10分钟

蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收

各种嘌吟和嘧啶；

各种核苷酸

用于层析柱流出液的检测；核酸的吸收可以校正

Folin－酚试剂法（Lowry法）

灵敏度高

～5g

慢速

40～60

分钟

双缩脲反应；磷钼酸－磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原

硫酸铵；

Tris缓冲液；

甘氨酸；

各种硫醇

耗费时间长；操作要严格计时；颜色深浅随不同蛋白质变化

考马斯亮蓝法（Bradford法）

灵敏度最高

1～5g

快速

5～15分钟

考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时，其max由465nm变为595nm

强碱性缓冲液；

TritonX-100;

SDS

最好的方法；干扰物质少；颜色稳定；颜色深浅随不同蛋白质变化

值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。

每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。

在选择方法时应考虑：

①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。

考马斯亮蓝法（Bradford法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。

（2）钙的测定方法

食品中钙含量的测定通常采用火焰原子吸收光谱法或EDTA滴定法[4-5]。

火焰原子吸收光谱法测定速度快,干扰小,但因仪器昂贵、需要专门的操作技术,基层实验室难以普及。

EDTA滴定法操作简单,但存在干扰因素较多、滴定终点不明显、滴定中使用的高浓度剧毒物（100g/L的氰化钾溶液）污染环境等问题。

采用高锰酸钾滴定法测定奶粉中的钙含量,经过实验发现检测结果的准确度和精密度均有提高,得到满意的效果。

高锰酸钾法测定钙含量属于氧化还原滴定法。

原理是将样品中的钙元素转化为钙离子,加入过量草酸铵得到难溶草酸盐沉淀,再将草酸盐沉淀溶于酸中,最后用高锰酸钾标准溶液来滴定草酸即可间接测定钙含量。

参考文献

[1]杨惠芬.食品卫生理化检验标准手册[M].北京:

中国标准出版社,1997:

25.

[2]祁成华，郑新秀，严香文.双硫腺比色法测定锌实验条件的改进新疆昌吉州环境监测站831100

[3]中国国家标准化管理委员会.食品中钙的测定[S].北京:

中国标准出版社,2003:

35.

[4]王喜明,刘玉欣,常凤启,等.滴定法测定保健食品中的钙[J].中国卫生检验杂志,2006,16（6）:

754-755.

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