各种酶活性测定方法.docx
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各种酶活性测定方法
各种酶活性测定方法
第一超氧化物歧化酶SOD测定
一、原理
超氧物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。
本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。
在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。
而SOD可清除O2，从而抑制了甲腙的形成。
于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。
据此可以计算出酶活性大小。
二、材料、仪器设备及试剂
（一）材料；水稻或小麦叶片
（二）仪器设备：
1.高速台式离心机；2.分光光度计；3.微量进样器；4.荧光灯（反应试管处照度为4000Lx）；5.试管或指形管数支。
（三）试剂 1.0.05mol/L磷酸缓冲液（）；2.130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：
称用磷酸缓冲液定容至100ml；μmol/L氮蓝四唑溶液：
称取用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存；4.100μmol/LEDTA－Na2溶液：
称取－Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml；5.20μmol/L核黄素溶液：
称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml避光保存。
三、实验步骤
1.酶液提取 取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml。
取～2ml于1000rpm下离心20min，上清液即为SOD粗提液。
2.显色反应 取5ml指形管（要求透明度好）4支，2支为测定管，另2支为对照管，按下列加入各溶液：
试剂（酶）用量（ml）终浓度（比色时）L磷酸缓冲液LMet溶液L750μmol/LNBT溶液μmol/L100μmol/LEDTA－Na2液μmol/L20μmol/L核黄素μmol/L酶液支对照管以缓冲液代替酶液蒸馏水总体积混匀后将1支对照管置暗处，其它各管于4000Lx日光下反应20min（要求各管受光情况一致，温度高时间缩短，低时延长）。
3.SOD活性测定与计算 至反应结束后，以不照光的对照管做空白，分别测定其它各管的吸光度。
四、结果计算
已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50％为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD活性。
SOD总活性＝（Ack－AE）×V/（Ack××W×Vt）
上式中，SOD比活力＝SOD总活性蛋白质含量式中SOD总活性以每克鲜重酶单位表示；比活力单位以酶单位／mg蛋白表示Ack照光对照管的吸光度AE样品管的吸光度V样品液总体积（ml）Vt测定时样品用量（ml）W样鲜重（g）蛋白质含量单位为：
mg蛋白／g鲜重。
SOD、POD、CAT、MDA的测定方法-非试剂盒法
缩写：
SOD：
超氧化物歧化酶；CAT：
过氧化氢酶；POD：
过氧化物酶；MDA：
丙二醛；PVP：
聚乙烯吡咯烷铜K-30；L-Met：
甲硫氨酸；
NBT：
氮蓝四唑；TBA：
硫代巴比妥酸；TCA：
三氯乙酸；PBS:
磷酸缓冲液
1.SOD的测定方法
加样顺序：
（V=3ml）磷酸缓冲液：
L-Met:
NBT:
EDTA-Na2:
核黄素：
酶液：
蒸馏水：
试剂配制：
（1）LPBS：
（2）130mmol/LL-Met:
1.9399gMet用PBS定容至100ml
（3）750mmol/LNBT:
0.06133g用PBS定容至100ml（避光保存）
（4）100umol/LEDTA-Na2:
0.03721g用PBS定容至1000ml
（5）20umol/L核黄素:
0.0753g用蒸馏水定容至1000ml（避光保存）
注：
（1）对照：
以加缓冲液、不照光为空白；照光的为最大还原管
（2）照光后至显蓝色要立即避光放置、迅速测定A560值
的测定方法
试剂配制：
（1）5%TCA：
5g用蒸馏水定容至500ml
（2）%TBA：
2.5g用TCA定容至500ml
方法：
酶液1ml—%TBA和5%TCA—混合后在100度水浴煮沸15min—迅速冷却，10000r/min离心10min—用蒸馏水调零分别测定上清液在532nm、600nm处的吸收值
的测定方法
试剂配制：
（1）L的醋酸缓冲液：
+得到的醋酸缓冲液
AL的HAc溶液）—6ml冰醋酸溶到494ml蒸馏水中
BL的NaAc溶液）—
（2）%愈创木酚溶液—125um愈创木酚溶于50ml50%乙醇中（临用前配制）
（3）%H2O2溶液：
30%H2O2定容至50ml（临用前配制）
方法：
比色杯中依次加入2mlL的醋酸缓冲液—1ml%愈创木酚溶液—xml酶液（5min值为500-800即可）—%H2O2溶液—迅速巅到混匀把A460调零并开始计时—1次/30s,连续读取3min
的测定方法
试剂配制：
（1）50mmol/L的PBS（）
（2）%H2O2—1mlH2O2定容至100ml
方法：
（1）以不加H2O2的50mmol/L的PBS（）为空白把A240调零
（2）50ul酶液—3ml50mmol/L的PBS（）—%H2O2—迅速颠倒混匀，开始计时—1min后在240nm下比色，1次/1min（连续读取5min）。
2010年06月22日星期二19:
33
1叶绿素含量测定：
80％的丙酮液的配制：
4L丙酮+1L蒸馏水。
称0.5g左右的叶片放在50ml的离心管（做三个重复），加入25ml浓度为80％的丙酮液，放在黑暗处浸提大约36小时后取出，稀释4倍后分别在波长663nm、645nm、652nm和470nm下测定光密度，以80％的丙酮液为空白。
（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P35～36）
也可用95%乙醇溶液，在665、649、470nm处有最大吸收峰
Ca=抗氧化酶活性的定：
（2.5g样）
L磷酸缓冲溶液（PBS）（pH=）溶液的配制：
65.5506gNa2HPO4·12H2O+2.65285gNaH2PO4·2H2O,定容到4L。
（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》，P134）。
取低温保存的鲜样，称2g左右的叶片（或根）放在50ml的离心管，加入20ml浓度为L磷酸缓冲溶液（pH=）（最好是较冷的磷酸缓冲溶液，防止研磨时温度过高使酶失活），研磨（用磨碎机磨），8000r/min的冷冻离心机下离心20分钟，上清液为粗酶液。
丙二醛（MDA）的测定：
20％三氯乙酸（TCA）溶液的配制：
称200g三氯乙酸，用蒸馏水定容到1000ml。
（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P124）；
%硫代巴比妥酸（TBA）溶液的配制：
称5g硫代巴比妥酸（TBA）,用20％三氯乙酸（TCA）溶液溶解并定容到1000ml。
（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P124）（先加少量的氢氧化钠1mol/L溶解）；
酶液（对照用的LpH=的磷酸缓冲液代替酶液）（做三个重复）+3mlTBA――振荡――沸水浴上反应30min――冷却（至少30min）――比色（OD600、OD532、OD450）。
（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》，P124）
超氧化物歧化酶（SOD）的测定：
NBT（400ml）混合反应液:
392mlPBS（Ph=,+0.0206gNBT+0.776g甲硫酸铵+8ml核黄素溶液+EDTA-Na溶液
（100mlPBS缓冲溶液中含0.01204g核黄素）。
（另配）100mlPBS溶液加EDTA-Na
测试时：
取3ml反应液+（根）或ml（叶）粗酶液，于光照培养箱中6-10分钟，OD650下测定吸光度。
过氧化物酶（POD）的测定：
L磷酸缓冲溶液（PBS）（pH=）溶液的配制：
10.9251gNa2HPO4·12H2O+3.042975gNaH2PO4·2H2O,定容到1000ml。
%H2O2溶液的配制：
吸30%H2O2，用LpH=磷酸缓冲溶液（PBS）定容到250ml。
%愈创木酚溶液的配制：
称0.5g愈创木酚，用LpH=磷酸缓冲溶液（PBS）定容到250ml。
2ml%H2O2溶液+%愈创木酚溶液+1mlLpH=磷酸缓冲溶液（PBS）+（原来为）酶液（根加酶液）（对照用L磷酸缓冲溶液代替酶液）（做三个重复），记录470nm处OD降低速度。
将每分钟OD增加定义为1个活力单位。
（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》P121）
比色时加酶液，混合后即刻计时。
脯氨酸的测定
标准曲线的制作：
编号
1
2
3
4
5
6
7
标准脯氨酸的量（ml）
0
H2O（ml）
0
冰乙酸（ml）
2
2
2
2
2
2
2
显色液（ml）
3
3
3
3
3
3
3
脯氨酸含量（μl）
0
1
2
4
6
8
10
酶液（对照用80％乙醇代替）（做三个重复）+1ml冰乙酸+显色液―――混匀，沸水浴15min，冷却后测OD520。
可溶性蛋白的测定（参考赵志杰，史国安，董新纯编的《植物生理学实验指导》）
牛血清白蛋白：
配成100μg/ml和1000μg/ml。
90％乙醇：
90ml乙醇+10ml蒸馏水。
85％（W/V）磷酸：
170ml磷酸+30ml蒸馏水。
考马斯亮蓝G-250:
称0.2g考马斯亮蓝G-250溶于100ml90％乙醇中，加入85％（W/V）磷酸200ml，用蒸馏水定容到2L。
常温下可保存一个月。
标准曲线的制作：
配制0～100μg/ml血清白蛋白血液
管号
1
2
3
4
5
6
100μg/ml牛血清白蛋白（ml）
0
蒸馏水量（ml）
0
蛋白质含量（ml）
0
配制0～1000μg/ml血清白蛋白血液
管号
7
8
9
10
11
12
100μg/ml牛血清白蛋白（ml）
0
蒸馏水量（ml）
0
蛋白质含量（ml）
0
酶液（做三个重复）+5ml考马斯亮蓝G-250―――混匀，放置2min后在595nm下比色。
过氧化氢酶（CAT）的测定：
%H2O2溶液的配制：
吸5ml30%H2O2，用LpH=磷酸缓冲溶液（PBS）定容到500ml。
1ml%H2O2溶液+H2O+ml酶液，测定240nm处OD降低速度。
将每分钟OD减少定义为1个活力单位。
（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》P121）
抗坏血酸（ASA）的测定：
（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P125）
5％三氯乙酸（TCA）溶液的配制：
25g三氯乙酸，用蒸馏水定容到500ml。
10％三氯乙酸（TCA）溶液的配制：
25g三氯乙酸，用蒸馏水定容到250ml。
150mmol/LNaH2PO4（pH）溶液的配制：
100ml。
44％H3PO4溶液的配制：
250ml。
4％2,2-二联吡啶溶液的配制：
250ml。
3％FeCl3溶液的配制：
100ml。
首先标制作准曲线。
粗酶液的提取：
取低温保存的鲜样，称0.5g左右的叶片（或根）放在50ml的离心管，加入15m5％三氯乙酸（TCA）溶液（最好是较冷的三氯乙酸（TCA）溶液，防止研磨时温度过高使酶失活），研磨（用磨碎机磨），15000r/min的冷冻离心机下离心10分钟，上清液为粗酶液，用于抗坏血酸（ASA）含量的测定。
（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》P125～126）
测定：
粗酶液+150mmol/LNaH2PO4（pH）溶液+H2O，混匀（振荡），至少30秒后，再依次分别加入：
ml10％三氯乙酸（TCA）溶液+ml44％H3PO4溶液+ml4％2,2-二联吡啶溶液+3％FeCl3溶液，混合后在37℃水浴中保温60min，测定OD525处的值。
（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》P125～126）
谷胱甘肽的测定：
4g新鲜材料+2mlL醋酸汞+2ml30％醋酸钠后研磨匀浆，转移到离心管中，以蒸馏水冲洗残渣，并以玻璃棒搅拌，净置10min，使之充分沉淀，离心后弃去上清液，沉淀以水（每次10ml）在摇动情况下冲洗2次。
向沉淀中加入10ml1mol/L盐酸以溶解其中的谷胱甘肽，以玻璃棒搅拌5min后加入1ml20％的碘化钾溶液，混匀，离心。
上清液转入供滴定用的100ml玻璃管中，沉淀在搅动情况下以10ml水冲洗。
离心后溶液与第一次离心液合并。
向得到的溶液中加入淀粉液，用1mmol/LKIO3滴定，直至出现不消失的蓝色为止。
1ml1mmol/L的KIO3相当于谷胱甘肽。
（参考《现代植物生理学实验指南》，中国科学院上海植物生理研究所编）。
天冬酰胺合成酶（AS）的测定：
天冬酰胺转氨酶（AspAT）的测定：
3硝酸还原酶（NR）的测定采用离体法：
（1g样）（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P27～29）
亚硝酸钠标准溶液（1μg/ml）：
称NaNO20.9857g,定容到1000ml，再吸5ml定容到1000ml。
mol/L的磷酸缓冲溶液：
30.0905gNa2HPO4·12H2O+2.4965gNaH2PO4·2H2O，加蒸馏水定容到1000ml。
3mol/LHCl：
125ml浓盐酸加蒸馏水定容到500ml。
1％磺胺溶液：
5.0g磺胺溶于500ml3mol/LHCl中。
％a-萘胺溶液：
1.0ga-萘胺溶于125ml冰醋酸后用蒸馏水定容到500ml，贮于棕色瓶中。
LKNO3溶液：
5.055gKNO3溶于500mlnmol/L的磷酸缓冲溶液。
L的磷酸缓冲溶液：
Na2HPO4·12H2O8.8640g+NaH2PO4·2H2O0.0570g，加蒸馏水定容到1L。
提取缓冲液：
1.211g半胱氨酸+0.372gEDTA，溶于1Lmol/L的磷酸缓冲溶液。
2mg/mlNADH溶液：
0.5gNADH溶于250mlmol/L的磷酸缓冲溶液（临用前配制）。
首先标制作准曲线:
取7支洁净烘干的15ml刻度试管加试剂，即配成0～μg的系列标准亚硝态氮溶液。
摇匀后在30℃保温箱或恒温水浴中保温30min，然后在540nm波长下比色。
以亚硝态氮（μg）为横坐标（x），光密度值为纵坐标（y）绘标准曲线或建立回归方程。
各试剂加入顺序
管号
1
2
3
4
5
6
7
亚硝酸钠标准液（ml）
0
蒸馏水（ml）
0
1％磺胺溶液（ml）
4
4
4
4
4
4
4
%α-萘胺（ml）
4
4
4
4
4
4
4
每管含NO2-（μg）
0
1g材料+15ml提取缓冲液后研磨匀浆，转移到离心管中于4℃、4000r/min下离心15min,上清液即为粗酶提取液，用于硝酸还原酶（NR）的测定。
+LKNO3溶液+溶液后混匀（对照不加NADH溶液，而以LpH磷酸缓冲液代替），在25℃水浴中保温30min。
保温结束后立即加入1ml磺胺溶液终止酶反应，再加1ml％a-萘胺溶液，显色反应15min后于4000r/min下离心5min，取上清液在540nm下比色测定吸光度。
根据回归方程计算。
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