各种酶活性测定方法.docx

1、各种酶活性测定方法各种酶活性测定方法第一 超氧化物歧化酶SOD测定一、原理超氧物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。而SOD可清除O2，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。二、材料、仪器设备及试剂（一）材料；水稻或小麦叶片

2、（二）仪器设备：1.高速台式离心机；2.分光光度计；3.微量进样器；4.荧光灯（反应试管处照度为4000Lx）；5.试管或指形管数支。（三）试剂1. 0.05mol/L 磷酸缓冲液（）；2. 130mmol/L 甲硫氨酸（Met）溶液：称用磷酸缓冲液定容至100ml；mol/L 氮蓝四唑溶液：称取用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存；4. 100mol/L EDTANa2溶液：称取Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml；5. 20mol/L 核黄素溶液：称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml避光保存。三、实验步骤1. 酶液提取取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的

3、研钵中，1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml。取2ml于1000rpm下离心20min，上清液即为SOD粗提液。2. 显色反应取5ml指形管（要求透明度好）4支，2支为测定管，另2支为对照管，按下列加入各溶液：试剂（酶）用量（ml）终浓度（比色时）L 磷酸缓冲液L Met溶液L 750mol/L NBT溶液mol/L 100mol/L EDTANa2液mol/L 20mol/L 核黄素mol/L 酶液支对照管以缓冲液代替酶液蒸馏水总体积混匀后将1支对照管置暗处，其它各管于4000Lx日光下反应20min（要求各管受光情况一致，温度高时间缩短，低时延长）。3. SOD

4、活性测定与计算至反应结束后，以不照光的对照管做空白，分别测定其它各管的吸光度。四、结果计算已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD活性。SOD总活性(AckAE)V/(AckWVt)上式中，SOD比活力SOD总活性蛋白质含量式中SOD总活性以每克鲜重酶单位表示；比活力单位以酶单位mg蛋白表示Ack照光对照管的吸光度AE样品管的吸光度V样品液总体积（ml）Vt测定时样品用量（ml）W样鲜重（g）蛋白质含量单位为：mg蛋白g鲜重。SOD、POD、CAT、MDA的测定方法-非试剂盒法缩写：SOD：超氧化物歧化酶； CAT：过氧化氢酶； POD：过氧化物酶；

5、MDA：丙二醛；PVP：聚乙烯吡咯烷铜K-30；L-Met：甲硫氨酸；NBT：氮蓝四唑；TBA：硫代巴比妥酸；TCA：三氯乙酸；PBS: 磷酸缓冲液1. SOD的测定方法加样顺序：（V=3ml）磷酸缓冲液： L-Met: NBT: EDTA-Na2: 核黄素： 酶液： 蒸馏水：试剂配制：(1) L PBS：(2) 130mmol/L L-Met: 1.9399g Met用PBS定容至100ml(3) 750mmol/L NBT: 0.06133g用PBS定容至100ml(避光保存)(4) 100umol/L EDTA-Na2: 0.03721g用PBS定容至1000ml(5) 20umol/L

6、核黄素: 0.0753g用蒸馏水定容至1000ml(避光保存)注：（1）对照：以加缓冲液、不照光为空白；照光的为最大还原管(2) 照光后至显蓝色要立即避光放置、迅速测定A560值的测定方法试剂配制：（1）5% TCA： 5g用蒸馏水定容至500ml（2）% TBA：2.5g用TCA定容至500ml方法：酶液1ml%TBA和5%TCA混合后在100度水浴煮沸15min迅速冷却，10000r/min离心10min用蒸馏水调零分别测定上清液在532nm、600nm处的吸收值的测定方法试剂配制：（1）L的醋酸缓冲液：+得到的醋酸缓冲液 AL的HAc溶液)6ml冰醋酸溶到494ml蒸馏水中 BL的NaA

7、c溶液)（2）%愈创木酚溶液125um愈创木酚溶于50ml 50%乙醇中（临用前配制）（3）%H2O2溶液： 30% H2O2定容至50ml（临用前配制）方法：比色杯中依次加入2ml L的醋酸缓冲液1ml %愈创木酚溶液xml酶液（5min值为500-800即可） %H2O2溶液迅速巅到混匀把A460调零并开始计时1次/30s,连续读取3min的测定方法试剂配制：(1) 50mmol/L的PBS（） (2) % H2O21ml H2O2定容至100ml方法：(1)以不加H2O2的50mmol/L的PBS（）为空白把A240调零(2)50ul酶液3ml 50mmol/L的PBS（） % H2O2

8、迅速颠倒混匀，开始计时1min后在240nm下比色，1次/1min(连续读取5min)。2010年06月22日 星期二 19:331 叶绿素含量测定：80的丙酮液的配制：4L丙酮 + 1L蒸馏水。称0.5g左右的叶片放在50ml的离心管（做三个重复），加入25ml浓度为80的丙酮液，放在黑暗处浸提大约36小时后取出，稀释4倍后分别在波长663nm、645nm、652nm和470nm下测定光密度，以80的丙酮液为空白。（参考陈建勋，王晓峰主编的植物生理学实验指导,P3536）也可用95%乙醇溶液，在665、649、470nm处有最大吸收峰Ca= 抗氧化酶活性的定：（2.5g样）L磷酸缓冲溶液 (

9、PBS)（pH=）溶液的配制：65.5506g Na2HPO412H2O + 2.65285g NaH2PO42H2O, 定容到4L。（参考陈建勋，王晓峰主编的植物生理学实验指导，P134）。取低温保存的鲜样，称2g左右的叶片（或根）放在50ml的离心管，加入20ml浓度为L磷酸缓冲溶液（pH=）（最好是较冷的磷酸缓冲溶液，防止研磨时温度过高使酶失活），研磨（用磨碎机磨），8000r/min的冷冻离心机下离心20分钟，上清液为粗酶液。丙二醛（MDA）的测定：20三氯乙酸（TCA）溶液的配制：称200g三氯乙酸，用蒸馏水定容到1000ml。（参考陈建勋，王晓峰主编的植物生理学实验指导,P124）

10、；% 硫代巴比妥酸（TBA）溶液的配制：称5g硫代巴比妥酸（TBA）,用20三氯乙酸（TCA）溶液溶解并定容到1000ml。（参考陈建勋，王晓峰主编的植物生理学实验指导,P124）（先加少量的氢氧化钠1mol/L溶解）；酶液（对照用的L pH=的磷酸缓冲液代替酶液）（做三个重复）+ 3mlTBA振荡沸水浴上反应30min冷却（至少30min）比色（OD600、OD532、OD450）。（参考陈建勋，王晓峰主编的植物生理学实验指导，P124）超氧化物歧化酶（SOD）的测定：NBT(400ml)混合反应液:392mlPBS(Ph=,+0.0206g NBT+ 0.776g甲硫酸铵+8ml核黄素溶液

11、+ EDTA-Na溶液（100mlPBS缓冲溶液中含0.01204g核黄素）。（另配）100ml PBS溶液加EDTA-Na 测试时：取3ml反应液+(根)或 ml(叶)粗酶液，于光照培养箱中6-10分钟，OD650下测定吸光度。过氧化物酶（POD）的测定：L磷酸缓冲溶液(PBS)（pH=）溶液的配制：10.9251g Na2HPO412H2O + 3.042975g NaH2PO42H2O,定容到1000ml。%H2O2溶液的配制：吸 30%H2O2，用L pH=磷酸缓冲溶液(PBS)定容到250ml。%愈创木酚溶液的配制：称0.5g愈创木酚，用L pH=磷酸缓冲溶液(PBS)定容到250m

12、l。2ml %H2O2溶液 + %愈创木酚溶液 + 1ml L pH=磷酸缓冲溶液(PBS) + （原来为）酶液（根加酶液）（对照用L磷酸缓冲溶液代替酶液）（做三个重复），记录470nm处OD降低速度。将每分钟OD增加定义为1个活力单位。（参考陈建勋，王晓峰主编的植物生理学实验指导P121）比色时加酶液，混合后即刻计时。 脯氨酸的测定标准曲线的制作：编号1234567标准脯氨酸的量（ml）0H2O（ml）0冰乙酸（ml）2222222显色液（ml）3333333脯氨酸含量（l）01246810酶液（对照用 80乙醇代替）（做三个重复） + 1ml冰乙酸 + 显色液混匀，沸水浴15min，冷却后

13、测OD520。可溶性蛋白的测定（参考赵志杰，史国安，董新纯编的植物生理学实验指导）牛血清白蛋白：配成100g/ml和1000g/ml。90乙醇：90ml乙醇 + 10ml蒸馏水。 85（W/V）磷酸：170ml磷酸 + 30ml蒸馏水。考马斯亮蓝G-250:称0.2g考马斯亮蓝G-250溶于100ml 90乙醇中，加入85（W/V）磷酸200ml，用蒸馏水定容到2L。常温下可保存一个月。标准曲线的制作：配制0100g/ml血清白蛋白血液管号123456100g/ml牛血清白蛋白(ml)0蒸馏水量(ml)0蛋白质含量（ml）0配制01000g/ml血清白蛋白血液管号789101112100g/m

14、l牛血清白蛋白(ml)0蒸馏水量(ml)0蛋白质含量（ml）0 酶液（做三个重复） + 5ml考马斯亮蓝G-250混匀，放置2min后在595nm下比色。过氧化氢酶（CAT）的测定：%H2O2溶液的配制：吸5ml 30%H2O2，用L pH=磷酸缓冲溶液(PBS)定容到500ml。1 ml %H2O2溶液 + H2O + ml 酶液，测定240nm处OD降低速度。将每分钟OD减少定义为1个活力单位。（参考陈建勋，王晓峰主编的植物生理学实验指导P121） 抗坏血酸（ASA）的测定：（参考陈建勋，王晓峰主编的植物生理学实验指导,P125）5 三氯乙酸（TCA）溶液的配制：25g三氯乙酸，用蒸馏水定

15、容到500ml。10 三氯乙酸（TCA）溶液的配制：25g三氯乙酸，用蒸馏水定容到250ml。150mmol/L NaH2PO4（pH ）溶液的配制：100ml。44 H3PO4溶液的配制：250ml。4 2,2-二联吡啶溶液的配制：250ml。3 FeCl3溶液的配制：100ml。首先标制作准曲线。粗酶液的提取：取低温保存的鲜样，称0.5g左右的叶片（或根）放在50ml的离心管，加入15m 5三氯乙酸（TCA）溶液（最好是较冷的三氯乙酸（TCA）溶液，防止研磨时温度过高使酶失活），研磨（用磨碎机磨），15000r/min的冷冻离心机下离心10分钟，上清液为粗酶液，用于抗坏血酸（ASA）含量的

16、测定。（参考陈建勋，王晓峰主编的植物生理学实验指导P125126）测定： 粗酶液 + 150mmol/L NaH2PO4（pH ）溶液 + H2O，混匀（振荡），至少30秒后，再依次分别加入： ml 10三氯乙酸（TCA）溶液 + ml 44 H3PO4溶液 + ml 4 2,2-二联吡啶溶液 + 3 FeCl3溶液，混合后在37水浴中保温60min，测定OD525处的值。（参考陈建勋，王晓峰主编的植物生理学实验指导P125126） 谷胱甘肽的测定：4g新鲜材料 + 2ml L醋酸汞 + 2ml 30醋酸钠后研磨匀浆，转移到离心管中，以蒸馏水冲洗残渣，并以玻璃棒搅拌，净置10min，使之充分沉

17、淀，离心后弃去上清液，沉淀以水（每次10ml）在摇动情况下冲洗2次。向沉淀中加入10ml 1mol/L盐酸以溶解其中的谷胱甘肽，以玻璃棒搅拌5min后加入1ml 20的碘化钾溶液，混匀，离心。上清液转入供滴定用的100ml玻璃管中，沉淀在搅动情况下以10ml水冲洗。离心后溶液与第一次离心液合并。向得到的溶液中加入淀粉液，用1mmol/L KIO3滴定，直至出现不消失的蓝色为止。1ml 1 mmol/L 的KIO3相当于谷胱甘肽。（参考现代植物生理学实验指南，中国科学院上海植物生理研究所编）。天冬酰胺合成酶（AS）的测定： 天冬酰胺转氨酶（AspAT）的测定：3 硝酸还原酶(NR)的测定采用离体

18、法：（1g样）（参考陈建勋，王晓峰主编的植物生理学实验指导,P2729）亚硝酸钠标准溶液（1g/ml）：称NaNO2 0.9857g ,定容到1000ml，再吸5ml定容到1000ml。 mol/L 的磷酸缓冲溶液：30.0905g Na2HPO412H2O + 2.4965g NaH2PO42H2O，加蒸馏水定容到1000ml。3mol/L HCl：125ml浓盐酸加蒸馏水定容到500ml。1 磺胺溶液：5.0g磺胺溶于500ml 3mol/L HCl中。 a-萘胺溶液：1.0g a-萘胺溶于125ml冰醋酸后用蒸馏水定容到500ml，贮于棕色瓶中。L KNO3溶液：5.055g KNO3溶

19、于500mln mol/L 的磷酸缓冲溶液。L 的磷酸缓冲溶液：Na2HPO412H2O 8.8640g + NaH2PO42H2O 0.0570g，加蒸馏水定容到1L。提取缓冲液：1.211g半胱氨酸 + 0.372g EDTA，溶于1L mol/L 的磷酸缓冲溶液。2mg/ml NADH 溶液：0.5g NADH溶于250ml mol/L 的磷酸缓冲溶液（临用前配制）。首先标制作准曲线:取7支洁净烘干的15ml刻度试管加试剂，即配成0g的系列标准亚硝态氮溶液。摇匀后在30保温箱或恒温水浴中保温30min，然后在540nm波长下比色。以亚硝态氮（g）为横坐标（x），光密度值为纵坐标（y）绘标

20、准曲线或建立回归方程。各试剂加入顺序管 号1234567亚硝酸钠标准液(ml)0蒸馏水(ml)01 磺胺溶液(ml)4444444%-萘胺(ml)4444444每管含NO2- (g)01g 材料+15ml提取缓冲液后研磨匀浆，转移到离心管中于4、4000r/min下离心15min,上清液即为粗酶提取液，用于硝酸还原酶(NR)的测定。+ L KNO3溶液 + 溶液后混匀（对照不加NADH溶液，而以 L pH 磷酸缓冲液代替），在25水浴中保温30min。保温结束后立即加入1ml磺胺溶液终止酶反应，再加1ml a-萘胺溶液，显色反应15min后于4000r/min下离心5min，取上清液在540nm下比色测定吸光度。根据回归方程计算。