5生物化学实验指导书.docx
《5生物化学实验指导书.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《5生物化学实验指导书.docx（45页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
5生物化学实验指导书
生物化学
实
验
指
导
书
生物化学教研室
2011、2、1
目录
实验须知
实验内容
实验一蛋白质的两性电离和等电点的测定
实验二血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳
实验三血清总蛋白测定（双缩脲法、Folin—酚法）
实验四PH与温度对酶活性的影响
实验五激活剂和抑制剂对酶活性的影响
实验六酶的特异性
实验七琥珀酸脱氢酶活性的抑制
实验八分光光度计的使用
实验九血糖的测定（葡萄糖氧化酶法）
实验十肝中酮体生成作用
实验十一血清胆固醇测定（酶法）
实验十二ALT的测定
实验十三血红蛋白与核黄素的凝胶柱色谱分离
实验十四肝组织核酸的提取、分离和鉴定
实验十五血清尿素氮的测定
实验十六血清胆红素测定
实验十七：
总糖的测定---蒽酮比色法
实验十八：
饥饿与饱食对肝糖元含量的影响
实验十九：
乳酸脱氢酶活力测定
生物化学实验须知
一、实验目的
1．培养学生科学的思维方法和学习作风，独立工作能力。
2．学习基础生物化学实验方法，为今后的学习与研究准备更好的条件。
3．培养学生爱护国家财物、爱护集体、团结互助的优良道德品质。
4．培养学生的书面及口头表达能力。
二、实验的总要求
1．按教研室予先公布的实验进度表，了解各次实验的具体内容，并认真做好预习。
弄清各步骤的意义，避免教条或机械式做实验。
未预习者不得进实验室。
2．进行实验不仅要求结果良好，而且要求敏捷高效。
一切步骤都按正规操作方法进行；样品与试剂勿过量取用；注意力集中，避免差错。
3．实验中观察要仔细，记录要详尽、及时与客观。
无论实验成功与失败，都应直接记录在实验报告本中，不得于实验后追记。
对于失败的实验，要分析其原因。
4．实验室是集体学习与工作的场所，实验时应保持肃静，不得大声喧哗，以免影响他人的工作与思考。
5．注意保持实验室内的整洁。
实验用器具、试剂等应排列整齐有序。
实验时切勿将试剂、标本溅洒于实验台面、地面及衣物上，如果有溅出应及时处理。
实验后应清洗用过的仪器及清理自己的实验场所。
实验所用的器材、设备不得随意乱动。
实验室内的一切器材物品严禁携出。
6．实验时使用水、电、火、易燃易爆试剂、化学毒剂及传染标本等应注意安全，防止燃烧或爆炸，防止中毒等事故之发生。
7．对师长尊敬，对同学要团结友爱。
三、实验报告
实验报告的书写是培养学生书面表达能力和科学作风的重要手段之一，实验者应该重视。
实验报告的内容包括下列各项：
实验名称、实验日期、实验目的、实验原理、实验步骤，实验记录、计算、讨论或小结。
实验记录应包括随做随记的原始记录。
书写实验报告要字迹工整，语句通顺。
书写工整的实验报告，是尊师的重要表现之一。
四、组织与分组
1．每一实验室推选一名学生课代表，负责下列工作：
①实验报告的收集与分发；②安排清扫值日名单；③反映同学学习情况及对教学工作的意见；④其它临时性的工作。
2．一般每个学生单独进行实验。
有的实验要两人一组，由相邻两学生组成固定小组。
小组的成员在指导教师的同意下，可作适当的调整。
五、仪器
1．每次实验前，实验者应根据本实验使用的仪器种类与数目，检查分发在实验桌上的各种仪器，如有缺损应于清洗前立即向准备室负责老师补换。
实验中如有破损，则必须登记，按学院规定处理。
实验后应将完整仪器洗涤清洁，点交管理人员。
2．公用仪器（包括贵重仪器，如分光光度计、电动离心机等）使用时间不宜过长，以免妨碍他人工作。
设有使用登记薄的仪器，使用后必须登记，以示负责。
对于不熟悉之仪器，应请教师指导，切勿随意乱动。
六、试剂
1．每2~6人合用一份试剂。
在一般情况下，使用的试剂应该固定。
2．取试剂瓶塞与量取用具（如吸管或滴管）不应分开，用后应立即放回原处，量取用具应按规定放置。
瓶塞与量具一旦弄错，试剂即受损坏、污染，实验就可能失败。
3．标准试剂不应用潮湿之吸管与之直接接触，取出后不得再放入原瓶。
七、玻璃仪器的洗涤
一般玻璃仪器用肥皂或去污粉以毛刷洗涤即足以满足要求，洗后应将肥皂或去污粉仔细冲掉，将水倾去后，器壁不挂水珠，视为合格。
铬酸洗液仅用于毛刷不能洗净的仪器，切勿滥用普通玻璃仪器之洗涤。
使用铬酸洗液时，仪器应干燥；过多的水份将使洗液迅速失效。
用过之铬酸洗液须加以保存以反复使用，直至为绿色后方可舍弃；其舍弃法与浓硫酸液相同。
用洗液浸洗过的玻璃仪器，应先用自来水冲洗，然后再用蒸馏水或去离子水清洗，清洗时，宜采用“少量多次”原则以节约蒸馏水，同时清洗的效率也高。
八、舍弃物的处理
舍弃物必须依照其性质作适当的处理。
以免造成实验材料的浪费，损坏水槽及下水管道，或污染实验环境。
1．所有固体舍弃物（例如用过的滤纸、损坏的软木塞及橡皮物、玻璃渣、火柴梗等）。
必须放入废物筒或篓中，切勿丢入水槽中。
2．废硫酸或洗液，应先倾入大量水中，再倒入水槽中，并以大量水冲走。
3．实验完成后的沉淀或混合物，若含有可提取或收回的贵重物品者，不可随意舍弃，应放入教师指定的回收器中。
实验一：
血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳
实验目的：
1.掌握血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳的方法及实验原理。
2.了解血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳的临床意义及影响因素。
实验原理：
带电粒子在电场中移动的现象称为电泳。
血清蛋白质的等电点均低于pH7.4，因此，在pH比其等电点高的缓冲液中它们都电离成负离子，在电场中都会向正极移动。
因各种血清蛋白质等电点不同，在同一pH下所带电荷数量不同，加上分子量的差别等因素，它们在电场中的运动速度就不同。
蛋白质分子小而带电荷多的运动较快；分子大而带电荷少的运动较慢。
所以可利用电泳将血清蛋白质按其在电场中运动的速度快慢分为白蛋白、α1－球蛋白、α2－球蛋白、β－球蛋白及γ－球蛋白等五条区带。
可用分光光度法定量检测出五种蛋白质的含量和百分数，也可将染色后的膜条直接用光密度计测定。
实验器材：
【仪器】
1．试管、试管架、吸量管
2．电泳仪：
包括直流电源整流器和电泳槽两个部分，电泳槽内装有两个电极（用白金丝制成）。
3．醋酸纤维薄膜（2.5×8㎝）：
【试剂】
1．pH8.6，离子强度0.075的巴比妥缓冲液：
巴比妥钠15.45g，巴比妥2.76g，蒸馏水700～800ml，加热溶解，冷后补足蒸馏水至1000ml。
2．氨基黑10B染色液：
氨基黑10B0.5g，甲醇50ml，冰醋酸10ml，蒸馏水40ml，混合使溶解。
3．漂洗液：
甲醇45ml，冰醋酸5ml，蒸馏水50ml，混匀，分装甲乙丙三瓶备用。
4．新鲜血清
5．0.4mol/L氢氧化钠溶液
6．透明液：
冰醋酸25ml，无水乙醇75ml，混匀备用。
实验内容与方法：
1.电泳槽的准备：
将缓冲液加入电泳槽的两槽内，并使两槽液面在同一水平。
两槽内侧边各贴挂四层滤纸或纱布，浸入缓冲液中构成盐桥。
2．薄膜的准备与点样：
取2.5×8cm的膜条
（1）薄膜有光泽面向下，放入培养皿中的巴比妥缓冲液中使膜条充分浸透下沉，约浸泡10－20分钟，即膜条无白斑时。
（2）将充分浸透的膜条取出，用干净滤纸吸去多余的缓冲液，于薄膜的无光泽面距一端1.5cm处作为点样线。
（3）用点样器在盛有血清的表面血中蘸一下，点样器下端粘上薄层血清，然后将点样器竖直，使其沾有血清的顶端紧贴在薄膜点样线上，待血清全部渗入膜内后，移开点样器，注意点样的两端不可到边。
2．电泳：
将点样后的膜条置于电泳槽的盐桥上，放置时膜条无光泽面（即点样面）向下，以防薄膜干燥，点样端置于负极，槽架上以四层滤纸作桥垫，膜条与滤纸需贴紧。
盖好电泳槽的盖，待平衡5分钟后，即可通电。
调节电泳仪，使两极间距（指膜条与滤纸桥总长度）的电压为8～10V/cm长，或电流0.4～0.6mA/cm宽，通电50分钟左右关闭电源。
3．染色与漂洗：
通电完毕后，用镊子将薄膜取出，直接浸于盛有氨基黑10B的染色液中，染3分钟取出，立即浸于漂洗液中，分别在漂洗液甲、乙、丙三瓶中各漂洗5'，直至背景漂净为止。
用滤纸吸干薄膜，即得五条蛋白区带，从阳极至阴极端依次为白蛋白、α1－球蛋白、α2－球蛋白、β－球蛋白及γ－球蛋白，。
实验注意事项：
1．点样是实验成功的关键，点样不可太多或太少。
2．电泳和漂洗时不要拿错膜条。
实验报告：
血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳
思考题：
血清蛋白质在pH8.6的巴比妥缓冲液中带什么电荷?
它们泳动的先后顺序如何?
为什么？
实验二蛋白质两性电离与等电点的测定
实验目的：
1.了解蛋白质两性电离与等电点的测定原理。
2.熟悉蛋白质两性电离与等电点测定的操作方法。
3.培养学生严谨的作风和准确地进行实际操作的能力，提高分析问题的能力。
实验原理：
蛋白质是两性电解质,其电离过程取决于溶液的PH值。
若当PH大于蛋白质的PI时，蛋白质带负电荷，不易沉淀。
反之，当PH小于蛋白质的PI时，蛋白质带正电荷，也不易沉淀。
当溶液处于某一PH值时，蛋白质所带的正、负电荷数量相等，净电荷为零，呈兼性离子状态，此时溶液的PH值称为这种蛋白质的等电点（PI）；这时的蛋白质在电场中既不向负极也不向正极移动；溶解度最低，容易析出。
所以当溶液处于PI时，沉淀最多。
实验器材：
【仪器】
试管、试管架、吸量管
【试剂】
⒈5g/L酪蛋白醋酸钠溶液:
称取纯酪蛋白0.5g，加蒸馏水40ml及1.00mol/L氢氧化钠溶液10.0ml，振摇使酪蛋白溶解，然后加入1.00mol/L醋酸溶液10.0ml，混匀后倒入100ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，混匀。
2．0.1g/L溴甲酚绿指示剂：
该指示剂变色范围为PH3.8－5.4。
酸色型为黄色，碱色型为蓝色。
3．0．02mol/L盐酸溶液
4．0．02mol/L氢氧化钠溶液
5．1.00mol/L醋酸溶液
6．0.1mol/L醋酸溶液
7．0.01mol/L醋酸溶液
实验内容与方法：
一.蛋白质两性电离实验
1．取试管一支，加入5g/L酪蛋白醋酸钠溶液0.3ml，0.1g/L溴甲酚绿指示剂1滴，混匀，观察溶液呈现的颜色。
2．用乳头滴管缓慢滴加0．02mol/L盐酸溶液，随滴随摇，直到有明显的大量沉淀发生。
观察溶液颜色的变化。
3．继续滴入0．02mol/L盐酸溶液，观察沉淀与溶液颜色的变化。
4．再滴入0．02mol/L氢氧化钠溶液，随滴随摇，使之再度出现明显的大量沉淀，再继续滴入0．02mol/L氢氧化钠溶液，沉淀又溶解，观察溶液颜色的变化。
二酪蛋白等电点的测定：
1．取试管5支，按下表操作：
加入物（ml）12345
蒸馏水1.6－3.01.53.38
1.00mol/L醋酸溶液2.4－－－－
0.10mol/L醋酸溶液－4.01.0－－
0.01mol/L醋酸溶液－－－2.50.62
5g/L酪蛋白醋酸钠溶液1.01.01.01.01.0
溶液的最终PH3.24.14.75.35.9
2．静置20分钟，观察各管沉淀出现情况。
并以“－、＋、＋＋、＋＋＋”记录沉淀多少。
实验注意事项：
仔细观察并记录蛋白质两性游离实验中沉淀及沉淀消失的现象。
实验报告：
⒈蛋白质两性电离
⒉酪蛋白等电点的测定
思考题：
1.讨论蛋白质两性电离实验中沉淀及沉淀消失的原因？
2.酪蛋白等电点是多少?
为什么？
实验三血清总蛋白测定
————双缩脲法
实验目的：
1.熟悉血清总蛋白测定的原理及基本操作。
2.掌握血清总蛋白测定的临床意义。
实验原理：
蛋白质分子中的肽键（-CONH-）在碱性条件下能与Cu2+作用形成紫红色络合物。
此呈色反应与双缩脲（H2N-OC-NH-CO-NH2）在碱性溶液中与Cu2+作用产生紫红色的反应相似，故称为双缩脲反应。
反应中溶液颜色的深浅与蛋白质的含量成正比，可用分光光度法定量检测蛋白质的含量。
凡具有两个以上肽键结构的化合物均有此反应，因此双缩脲反应广泛用于肽及蛋白质定性、定量检测。
实验器材：
恒温水浴箱、分光光度计、刻度吸管、试管、试管架。
【试剂】
1．6mol／L（24%）NaOH溶液称取NaOH（优级纯）240g，溶解于新鲜蒸馏水中并加至1000ml。
置聚乙烯瓶内盖紧室温保存。
2.双缩脲试剂 精确称取结晶硫酸铜（CuSO4·5H20）3.0g，酒石酸钾钠（NaKC4H4O6·4H2O）9.0g，碘化钾（KI）5.0g，分别溶解于是25m1蒸馏水中。
将酒石酸钾钠和碘化钾溶液倒入1000ml容量瓶中，加入6mol／L氢氧化钠溶液100ml，混匀，再加硫酸铜溶液，边加边摇，最后加蒸馏水稀释至1000ml。
置聚乙烯瓶内盖紧，室温保存。
3．10g/L酪蛋白标准液 酪蛋白要预先用微量凯氏定氮法测定蛋白质含量，再根据其纯度称量，用0.05mol/L氢氧化钠溶液配置，冰冻保存。
4.人血清用蒸馏水稀释10倍，使其蛋白质浓度在标准曲线测试范围内。
实验内容与方法：
取3支试管，按表操作：
加入物（ml）
测定管标准管空白管
血清稀释液
酪蛋白标准液
双缩脲试剂
0.1－－
－0.1－
5.05.05.0
充分混匀，置37℃水浴中10分钟（或25℃30分钟），在540nm波长处进行比色，以空白管调零，读取各管吸光度。
【计算】
【临床意义】
1.血清总蛋白降低
（1）合成障碍：
肝功能严重受损时，蛋白质合成减少，其中以清蛋白下降最为明显。
（2）丢失过多：
见于严重烧伤时大量血浆渗出，大失血，肾病综合征时大量蛋白尿，溃疡性结肠炎时肠道长期丢失一定量的蛋白质等。
（3）营养不良或消耗增加:
长期低蛋白饮食、慢性胃肠道疾病所引起的消化道吸收不良，使体内缺乏合成蛋白质的原料，或长期患消耗性疾病，如结核病、恶性肿瘤、甲状腺功能亢进等均可引起血清蛋白浓度降低。
（4）血液稀释：
静脉注射过多低渗溶液或各种原因引起的水钠潴留。
2.血清总蛋白增高
（1）血液浓缩：
急性失水（严重腹泻、呕吐、高热等），休克（毛细血管的通透性增加），慢性肾上腺皮质功能减退,急性失水尿钠增多引起继发性脱水。
（2）合成增加:
主要是球蛋白合成增加，如多发性骨髓瘤。
【正常参考范围】60～80g/L
实验注意事项：
1．由于各种蛋白质的分子量不同，故其浓度不宜用mol/L表示，而用g/L表示。
2.试管、吸管应清洁，否则会有混浊现象出现。
3.高脂、黄疸和溶血标本应作血清空白对照，以保证结果准确。
含脂类极多的血清，加入双缩脲试剂后会出现混浊，可用乙醚3ml抽提后再进行比色。
4.须于显色30分钟内比色，否则可有雾状沉淀产生，同时注意各管从显色到比色的时间应尽可能一致。
5.避免硫酸铜过量，否则生成氢氧化铜，其蓝色将掩盖紫红色，影响测定结果。
实验报告：
血清总蛋白测定（双缩脲法）
思考题：
蛋白质常见的呈色反应有哪些？
本实验结果如何，请分析。
————Folin—酚法
目的要求
（1）学习Folin—酚法测定蛋白质含量的原理和方法；
（2）制备标准曲线，测定未知样品中蛋白质含量。
实验原理
目前蛋白质含量测定有两类方法，一类是利用蛋白质的物理化学性质，如折射率，比重，紫外吸收等测定得知；另一类是利用化学方法测定蛋白质含量，如微量克氏定氮，双缩脲反应，Folin—酚试剂法（Lowry法）。
这两类方法各有优缺点，选用何种方法测定蛋白质含量，可根据实验要求和实验条件进行选择。
目前实验室多用Folin—酚法测定蛋白质含量。
此法的优点是：
操作简单，迅速，不需特殊仪器设备，灵敏度高，较紫外吸收法灵敏10—20倍，较双缩脲法灵敏100倍，反应约在15min内有最大显色，并至少可以稳定几个小时。
其不足之处就是此反应受多种因素干扰。
在测定时应排除干扰因素或做空白试验消除。
此法是在Folin—酚法的基础上引入双缩脲试剂，因此凡干扰双缩脲反应的基团，如-CO-NH2,-CH2-NH2,-CS-NH2以及在性质上是氨基酸或肽的缓冲剂，如Tris缓冲剂以及蔗糖，硫酸铵，巯基化合物均可干扰Folin—酚反应。
此外，所测的蛋白质样品中，若含有酚类及柠檬酸，均对此反应有干扰作用。
而浓度较低的尿素（约0.5%左右），胍（0.5%左右），硫酸钠（1%），硝酸钠（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）对显色无影响，这些物质在所测样品中含量较高时，则需做校正曲线。
若所测的样品中含硫酸铵，则需增加碳酸钠—氢氧化钠浓度即可显色测定。
若样品酸度较高，也需提高碳酸钠—氢氧化钠浓度1—2倍，这样即可纠正显色后色浅的弊病。
Folin—酚试剂由甲试剂和乙试剂组成。
甲试剂由碳酸钠，氢氧化钠，硫酸铜及酒石酸钾钠组成。
蛋白质中的肽键在碱性条件下，与酒石酸钾钠铜盐溶液起作用，生成紫红色络合物。
乙试剂是由磷钼酸和磷钨酸，硫酸，溴等组成。
此试剂在碱性条件下，易被蛋白质中酪氨酸的酚基还原呈蓝色反应，其色泽深浅与蛋白质含量成正比。
此法也适用于测定酪氨酸和色氨酸的含量。
本法可测定范围是25—250ug蛋白质。
试剂和器材
一、试剂
Folin—酚试剂:
试剂甲：
1）4%碳酸钠溶液
2）0.2mol/L氢氧化钠溶液
3）1%硫酸铜溶液
4）2%酒石酸钾钠溶液。
临用前将
（1）与
（2）等体积配制碳酸钠—氢氧化钠溶液。
（3）与（4）等体积配制成硫酸铜—酒石酸钾钠溶液。
然后这两种试剂按50:
1的比例配合，即成Folin—酚试剂甲。
此试剂临用前配制，一天内有效。
试剂乙：
称钨酸钠（Na2WO2•2H2O）100g，钼酸钠（Na2MoO4•2H2O）25g置2000ml磨口回流装置内，加蒸馏水700ml，85%磷酸50ml和浓硫酸100ml。
充分混匀，使其溶解。
小火加热，回流10h（烧瓶内加小玻璃珠数颗，以防溶液溢出），再加入硫酸锂（LiSO4）150g，蒸馏水50ml及液溴数滴。
在通风橱中开口煮沸15min，以除去多余的溴。
冷却后定容至1000ml，过滤即成Folin—酚试剂乙贮存液，此液应为鲜黄色，不带任何绿色。
置棕色瓶中，可在冰箱长期保存。
若此贮存液使用过久，颜色由黄变绿，可加几滴液溴，煮沸几分钟，恢复原色仍可继续使用。
试剂乙贮存液在使用前应确定其酸度。
以之滴定标准氢氧化钠溶液（1mol/L左右），以酚酞为指示剂，当溶液颜色由红→紫红→紫灰→墨绿时即为滴定终点。
该试剂的酸度应为2mol/L左右，将之稀释至相当于1mol/L酸度应用。
二、标准和待测蛋白质溶液
1.标准蛋白质溶液
结晶牛血清白蛋白或酪蛋白，预先经微量克氏定氮法测定蛋白质含量，根据其纯度配制成150ug/ml蛋白溶液
2.待测蛋白质溶液
人血清，使用前稀释150倍。
三、器材
试管及试管架；0.5,1,及5ml移液管，恒温水浴，UV－2000型分光光度计。
操作方法
一、制作标准曲线
取14支试管，分两组按下表平行操作：
试管编号
试剂处理
1
2
3
4
5
6
7
标准蛋白质溶液/ml
0
0.1
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
蒸馏水/ml
1.0
0.9
0.8
0.6
0.4
0.2
0
Folin-酚甲试剂/ml
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
摇匀，于20—25℃放置10min
Folin-酚乙试剂/ml
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
迅速摇匀，30℃（或室温20—25℃）水浴保温30min，以蒸馏水为空白，在640nm*处比色
640
*由于这种显色化合物组成尚未确定，它在可见光红光区呈现较宽吸收峰区。
不同书籍选用不同的波长，有选用500或540nm的，有选用660,700或750nm的。
选用较高波长，样品呈现较大的光吸收。
本实验选用640nm。
绘制标准曲线：
以A640值为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。
二、未知样品蛋白质浓度测定
取4支试管，分2组，按下表平行操作：
试管编号
试剂处理
空白管×2
样品管×2
血清稀释液/ml
0
0.2
蒸馏水/ml
1.0
0.8
Folin－酚甲试剂/ml
5.0
5.0
摇匀，于20—25℃放置10min
Folin－酚乙试剂/ml
0.5
0.5
迅速摇匀，30℃（或室温20—25℃）水浴保温30min，以蒸馏水为空白，在640nm*处比色
640
三、计算
注意事项
（1）Folin-酚乙试剂在酸性条件下较稳定，而Folin－酚甲试剂是在碱性条件下与蛋白质作用生成碱性的铜－蛋白质溶液。
当Folin－酚乙试剂加入后，应迅速摇匀（加一管摇一管），使还原反应产生在磷钼酸－磷钨酸试剂被破坏之前。
（2）血清稀释的倍数应使蛋白质含量在标准曲线范围之内，若超过此范围则需将血清酌情稀释。
思考题：
1. Folin－酚测定蛋白质的原理是什么？
2. 有哪些因素可干扰Folin－酚测定蛋白含量？
实验四pH与温度对酶促反应的影响
实验目的：
1.通过实验观察pH对酶促反应的影响。
2.提高分析问题和动手能力。
实验原理：
淀粉在淀粉酶催化下水解，其最终产物是麦芽糖和葡萄糖。
在水解反应过程中淀粉的分子量逐渐变小，形成若干分子量不等的过渡性产物，称为糊精。
向反应系统中加入碘液可检查淀粉的水解程度，淀粉遇碘呈蓝色，麦芽糖对碘不显色。
糊精中分子量较大者呈蓝紫色，随糊精的继续水解，对碘呈橙红色。
根据颜色反应，可以了解淀粉被水解的程度。
在不同温度、不同酸碱度下，唾液淀粉酶活性不同，淀粉水解程度也不一样。
进而了解温度及pH对酶促反应的影响。
实验器材：
【器材】：
10mm×100mm试管、试管架、恒温水浴箱、沸水浴、记号笔、一次性杯子
【试剂】：
1．10g／L淀粉溶液：
配制方法：
取可溶性淀粉1克，加5毫升蒸馏水，调成糊状，再加蒸馏水约80毫升，加热，使其溶解，最后用蒸馏水稀释至100毫升，冰箱保存。
2．稀释唾液：
将痰咳尽，用水漱口（洗涤口腔），再含蒸馏水30毫升，作咀嚼动作，2分钟后吐入烧杯中待用。
3．缓冲溶液：
PH6.8磷酸盐缓冲液：
取磷酸氢二钠477mg，磷酸二氢钠397mg，蒸馏水溶解至100ml。
PＨ3.0缓冲液：
取0.2mol/L磷酸二氢钾（KH2PO42.722克加蒸馏水溶解至100ml）50ml，加0.2mol/L盐酸溶液20.3ml,混合后即成。
PＨ9.0缓冲液：
取0.2mol/LNa2HPO4溶液（磷酸氢二钠2.840克加蒸馏水溶解至100ml）60ml,0.2mol/L氢氧化钠溶液20ml,混合后即成。
4．碘溶液取碘化钾4g溶于少量蒸馏水中，再取碘2g，完全溶解后加蒸馏水至300ml，贮于棕色瓶中。
实验内容与方法：
一、PH对酶促反应的影响
取三支试管按下表操作：
表PH对酶促反应的影响
加入物
123
10g／L淀粉溶液
PＨ3.0缓冲液
PH6.8缓冲液
PH9.0缓冲液
10滴10滴10滴
10滴——
—10滴—
——10滴
摇匀后37℃恒温水浴中保温5分钟
稀唾液
5滴5滴5滴
将上面各管摇匀后放入37℃恒温水浴中保温。
放置10分钟后取出，分别向各管加入稀碘液1滴，观察3管中颜色的区别，说明PH对酶促反应的影响。
二
升级会员 