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学生拷贝质谱

第五章质谱（MS）massspectrometry

质谱法是将样品离子化，变为气态离子混合物，并按质荷比（m/z）分离的分析技术。

质谱仪是实现上述分离分析技术从而测定物质的质量与含量及其结构的仪器。

在有机混合物的分析研究中证明了质谱分析法比化学分析法和光学分析法具有更加卓越的优越性，当代研究有机化合物已经离不开质谱仪。

一、仪器概述

1.基本结构

质谱仪由以下几部分组成：

数据及供电系统进样系统离子源质量分析器检测接收器真空系统

（1）进样系统

把分析样品导入离子源的装置。

包括：

直接进样，GC，LC接口，加热进样，参考物进样。

（2）离子源

使被分析样品的原子或分子离子化为带电粒子（离子）的装置，并对离子进行加速使其进入分析器，根据离子化方式的不同，有机常用的有以下几种，其中EI，ESI最常用。

EI（ElectronImpactIonization）：

电子轰击电离------硬电离。

CI（ChemicalIonization）：

化学电离------核心是质子转移。

FD（FieldDesorption）：

场解吸------目前基本被FAB取代。

FAB（FastAtomBombardment）：

快原子轰击-----或者铯离子（LSIMS，液体二次离子质谱）。

ESI（ElectrosprayIonization）：

电喷雾电离------属最软的电离方式。

APCI（AtmosphericPressureChemicalIonization）：

大气压化学电离------同上，更适于做小分子。

APPI（AtmosphericPressurephotosprayIonization）：

大气压光喷雾电离------同上，更适于做非极性分子。

MALDI（MatrixAssistedLaserDesorption）：

基体辅助解吸基质辅助激光解吸电离。

EI（ElectronImpactIonization）：

电子轰击电离------最经典常规的电离方式，其它均属软电离。

EI使用面广，峰重现性好，碎片离子多。

缺点：

不适合极性大、热不稳定化合物，且可测定分子量有限，一般≤1000

MALDI（MatrixAssistedLaserDesorption）：

基质辅助激光解吸离子化-----是一种用于大分子离子化的方法，利用对使用的激光波长范围具有吸收并能提供质子的基质（一般常用小分子液体或结晶化合物），将样品与其混合溶解并形成混合体，基体吸收激光能量，并传递给样品，从而使样品解吸离子化。

MALDI的特点是准分子离子峰很强。

通常将MALDI用于飞行时间质谱和FTMS，特别适合分析蛋白质，多肽等大分子。

（3）质量分析器：

是质谱仪中将离子按质荷比分开的部分，离子通过分析器后，按不同质荷比（M/Z）分开，将相同的M/Z离子聚集在一起，组成质谱。

（4）检测接收器

接收离子束流的装置。

有：

二次电子倍增器光电倍增管微通道板

（5）数据及供电系统

将接收来的电信号放大、处理并给出分析结果及控制质谱仪各部分工作。

从几伏低压到几千伏高压。

（6）真空系统：

由机械真空泵（前极低真空泵），扩散泵或分子泵（高真空泵）组成真空机组，抽取离子源和分析部分的真空。

只有在足够高的真空下，离子才能从离子源到达接收器，真空度不够则灵敏度低。

2.分类

按质量分析器，常见下列几种：

双聚焦扇形磁场-电场串联仪器（sector）。

四极质谱仪（Q）。

离子肼质谱仪（TRAP）。

飞行时间质谱仪（TOF）。

傅立叶变换-离子回旋共振质谱仪（FT-ICRMS）。

串联式多级质谱仪（MS/MS）---（混合型如四极+TOF等；三重四极；TOF+TOF）

3.分析原理

四极分析器（quandrupole）：

由两组对称的电极组成。

电极上加有支流电压和射频电压（ρ（U+VcosZt）。

相对的两个电极电压相同，相邻的两个电极上电压大小相等，极性相反。

带电离子射入高频电场中在场半径限定的空间内震荡。

在一定的电压和频率下，只有一种质荷比的离子可以通过四极杆达到检测器，其余离子则因振幅不断增大，撞在电极上而被过滤掉。

利用电压或频率扫描，可以检测不同质荷比的离子。

优点是扫描速度快，比磁式质谱仪便宜，体积小，场作为台式进入常规实验室，缺点是质量范围和分辨率有限。

飞行时间质谱仪（TOF）：

利用相同能量的带电粒子，由于质量的差异而具有不同速度的原理，不同质量的离子以不同时间通过相同的漂移距离到达接收器。

公式：

M/Z=2E/v2v=d/t代入M/Z=Kt2

E：

离子动能v：

离子速度d：

飞行距离t：

飞行时间

K：

常数=2E/v2

优点：

扫描速度快，灵敏度高，不受质量范围限制，结构简单，造价低廉等；

缺点：

定量较差。

以及前分辨率较低，最近新仪器分辨率大幅度提高如MALDI-TOF，GC-T，LC-T可得高分辨率结果。

串联质谱仪（MS/MS或Tamdem）：

离子源→第一分析器→碰撞室→第二分析器→接收器

MS1MS2

串联多级质谱仪（MS/MS）{

进行MS/MS的仪器从原理上可分为两类：

第一类仪器利用质谱在空间中的顺序，是由两台质谱仪串联组装而成。

即前面列出的串联式多级质谱仪。

第一类仪器利用了一个质谱仪时间顺序上的离子储存能力，由具有储存离子的分析器组成，如离子回旋共振仪（ICR）和离子肼质谱仪。

但不能进行母离子扫描或中性丢失。

选择一定质量的离子作为母体离子，进入碰撞室，室内充有靶子反应气（碰撞气体：

N2、He、AR、Xe、CH4等），发生离子-分子碰撞反应，从而产生子离子，再经MS2的分析器及接受器得到子离子质谱（productionionspectrum）。

一般称做CID（collision-induceddissociation）谱，或者称为MS/MS谱。

最常用的就是三重四极型MS/MS。

另外，也有子找母离子的MS/MS谱，（MS/MSprecursorionspectrum）研究MS/MS谱（一般指子离子质谱，与在源内裂解产生的正常碎片质谱类似，但有区别，现不能检索），可以了解到被分析样品的混合物性质和成分，对一些混合物不必进行色谱分离可直接分析，与色谱法相比，有很快的响应速度，省时省样品省费用，具有高灵敏度和高效率的优点。

另外一个特点是通过子。

母或母。

子MS/MS谱可以掌握一定的结构信息，作为目前有利的结构解析手段。

4.仪器性能指标

（1）质量范围：

例如：

2-3000Da

（2）分辨率

R=M/△M

M为相邻两峰之一的质量数。

△M为差，例如：

500与501两个峰刚好分开，则R=500/1=500。

若R=50000则可区别开500与500.01。

对于四极杆仪器，通常做到单位分辨，高低质量区R数值不同。

（3）灵敏度

有多种定义方法，粗略的说是表示所能检查出的最小量，一般可达10-9~10-12克甚至更低，实际还应看信噪比。

二、质谱的表示法及解析

谱图法：

列表法：

质量数、相对丰度……

高分辨表示法：

列表、元素组成

1.几个术语：

质荷比M/Z

在质谱中不能用平均分子量计算离子的化学组成，例如：

不能用氯的平均分子量35.5，而用35和37。

同理，溴也是如此，79和81，无80。

相对丰度

基峰

总离子流（TIC）

动态范围：

本底（BG）

质量色谱图/Masschromatogram（MC）：

又叫提取离子色谱图/extractionchromatography（XIC）是质谱法处理数据的一种方式。

以指定离子的强度为纵坐标，以时间为横坐标，表示质量与时间的关系。

2.离子的种类

（1）分子离子M+

在ESI中，往往生成质量大于分子的离子，如M+1，M+23，M+39，M+18……称准分子离子，表示为：

〔M+H〕+，〔M+Na〕+等。

（2）碎片离子：

碎片峰的数目及丰度则与分子结构有关，数目多表示该分子较容易断裂，

丰度高的碎片峰表示该离子较稳定，也表示分子比较容易断裂生成该离子。

（3）多电荷离子

指带有两个或更多个电荷的离子，有机质谱中，单电荷离子是绝大多数，只有那些不容易碎裂的基团或分子结构，如共轭体系结构才会形成多电荷离子。

它的存在说明样品是较稳定的。

采用电喷雾的离子化技术，可产生带很多电荷的离子，最后经计算机自动换算成单质/荷比离子。

（4）同位素离子

各种元素的同位素，基本上按其在自然界的丰度比出现在质谱中，这对于利用质谱确定化合物及碎片的元素组成有很大方便，在前面M/Z提到过，如氯35和37，还可利用稳定同位素合成标记化合物，如氘等标记化合物，再用质谱法检出这些化合物，在质谱图外貌上无变化，只是质量数的位移，从而说明化合物结构，反应历程等。

同位素峰CL13

（5）负离子

同常碱性化合物适合正离子，酸性化合物适合负离子，某些化合物负离子的灵敏度很高，可提供很有用的信息。

3.由质谱推断化合物结构

质谱是一种语言，但需要翻译。

与其他类型谱图比较，学习如何由质谱图识别一个简单分子要容易得多。

质谱图直接给出分子及其碎片的质量，因此化学家不需要学习任何新的知识。

如何看质谱图

（1）确定分子离子，即确定分子量

氮规则：

含偶数个氮原子的分子，其质量数是偶数，含奇数个氮原子的分子，其质量数是奇数。

与高质量碎片离子有合理的质量差，凡质量差在3~8和10~14，21，25之间均不可能，则说明是碎片或杂质。

（2）确定元素组成，即确定分子式或碎片化学式低分辨，利用元素的同位素丰度。

例

（3）峰强度与结构的关系丰度大反映离子结构稳定

在元素周期表中自上而下，自右至左，杂原子外层未成键电子越易被电离，容纳正电荷能力越强，S＞N＞O，n＞σ＞π，含支链的地方易断，这同有机化学基本一致，总是在分子最弱的地方断裂。

不同类型有机物有不同断裂方式，相同类型有机物有相同的裂解方式，只是质量数的差异，需要经验记忆，很有用。

4.质谱解析的一般步骤（适于低分辨小分子图谱，若已经高分辨得到元素组成更好）

（1）核对获得的谱图，扣除本底等因素引起的失真，考虑操作条件是否适当。

（2）综合样品其他知识：

例如熔点、沸点，溶解性等理化性质，样品来源，光谱，波谱数据等。

（3）尽可能判断出分子离子。

（4）假设排列可能的结构归属：

高质量离子所显示的，在裂解中失去的中性碎片，如M-1，M-15，M-18，M-20，M-31……意味着失H，CH3，H2O，OCH3……

（5）假设一个分子结构，与已知参考谱图对照，或取类似的化合物，并做出它的质谱进行对照。

三、有机质谱的特点与应用

1.优点：

（1）定分子量准确，其他技术无法比。

（2）灵敏度高，常规10-7~10-8g，单离子检测可达10-12g。

（3）快速，几分甚至几秒。

（4）便于混合物分析，LC/MS，MS/MS对于难分的混合物特别有效，其他技术无法胜任。

（5）多功能，广泛适用于各类化合物。

2.局限性：

（1）异构体，立体化学方面区别能力差。

（2）重复性稍差，要严格控制操作条件。

所以不能像低场NMR，IR等自己动手，须专人操作。

（3）有离子源产生的记忆效应，污染等问题。

（4）价格稍显昂贵，操作有点复杂。

3.应用

（1）有机化工

a．合成中原料及产品杂质分析---LC/MS

b．中间步骤监测

c．反应机理的研究

（2）石油

（3）环保

a．农药残毒检测

b．大气污染

c．水分析

d．特定成分定量测定

（4）食品、香料

a．酒：

判断真酒假酒，有无害。

b．化妆品

（5）生化、医药

a．蛋白质，多肽研究，前沿生命科学，

b．天然产物

（6）法医、毒化

液相色谱/质谱联用技术

色谱是快速灵敏分离有机物的有效手段，各种检测器中，除了应用最广泛的FID（GC）外，质谱（MS）尽管价格较昂贵，但是其选择性、灵敏度、分子量及结构信息等优势，已被公认为高级的通用型检测器，

一、液相色谱/质谱联用适用范围

首先看看气相色谱/质谱联用的特点：

要求样品气化后进入色谱仪

用电子轰击方式（EI）得到的谱图，可与标准谱库对比

用毛细管色谱柱分离化合物，分离效率高

操作条件稳定，使用方法成熟

适宜分析小分子、易挥发、热稳定的化合物

液相色谱/质谱联用主要可解决以下几方面的问题：

①不挥发性化合物分析测定

②极性化合物分析测定

③热不稳定化合物分析测定

④大分子量化合物（包括蛋白、多肽、多糖、多聚物等）分析测定；

二、液相色谱/质谱接口的发展

起步于70年代，先后研究出27种接口

⒈传送带（MB）

⒉热喷雾（TS）

⒊粒子束（PB）

⒋连续流动快原子轰击（CFFAB）

⒌大气压电离（API）（接口与电离相结合）

目前大气压电离特指：

电喷雾（ESI），离子喷雾（IS）和大气压化学电离（APCI）。

⑴由于产生多电荷离子（ESI和IS下），测定分子量可达到10万道尔顿以上

⑵灵敏度达fg~pg

⑶适用于极性和离子型化合物

⑷进样方式多样灵活

a）直接流动进样

b）与液相色谱联用

c）与毛细管电泳联用

三、接口原理

⒈电喷雾电离（ESI）

电喷雾电离是一种“软”电离技术，ESI-MS既可分析小分子也可分析大分子。

⑴电喷雾机理

“离子蒸发”如图所示。

⑵电喷雾离子源（离子喷雾）IncludesIonSpray，TurboIonspray，NanoSpray

调节锥体电压（DP）可使离子源输出的离子数达最佳条件，它通常以〔M+H〕+或〔M-H〕-是否最佳来衡量。

但是，锥体电压增加越大，离子破碎也越加剧。

这种效应可产生反映样品结构信息的碎片，而且重现性好，还可用碎片离子准确进行物质的定量分析。

由此可产生裂片的功能称为源内CID（碰撞诱导分解）。

⒉大气压化学电离（HeatedNebulizer或APCI）

⒊电喷雾与大气压化学电离的比较

电离机理：

电喷雾采用离子蒸发，而APCI电离是高压放电，发生了质子转移而生成M+H〕+或〔M-H〕-离子。

样品流速：

APCI源可从0.2~2ml/min，而电喷雾源允许流量相对较小。

断裂程度：

APCI源的探头处于高温，对热不稳定的化合物就足以使其分解。

灵敏度：

通常认为电喷雾有利于分析生物大分子及其它分子量大的化合物，而APCI更适合于分析极性较小的化合物。

多电荷：

APCI源不能生成一系列多电荷离子。

⒋NanoFlowAPI接口

专门设计的NanoSpray离子源特别适合于做微量的生化样品，其流速范围可从5nl/min~1Ul/min。

一滴样品就可做数小时的分析。

可在最小的样品消耗量下获得最大灵敏度。

灵敏度可高达fmol。

并可直接与微孔HPLC联用。

技术

流速（ml/min）

提供信息

样品类型

适用的

MW范围

热喷雾（TSP）

1~2

MH+，（M-H）-

极性水溶液如药物，代谢物

＜1000

等离子体喷雾（PSP）

0.5~2

MH+，（M-H）-及碎片

极性小于TSP分析的样品

＜1000

粒子数（LINC）

0.2~1

M.+，及碎片EI型谱图

非极性物质如农药，脂肪酸

＜1000

大气压化学电离（APCI）

0.2~2

MH+，（M-H）-及碎片

极性物质如农药，偶氮染料，药物

＜1000

动态快原子/离子轰击（FAB/FIB）

1~10uL/min

MH+，（M-H）-

极性物质如肽类

＜10，000

电喷雾（ESI）

1uL/min~1ml/min

MW＞1000amu，（M+nH）n+，（M-nH）n-及碎片；MW＜1000amu，MH+，（M-H）-及碎片

肽类，蛋白质，寡核苷酸，糖类，药物等。

＜200，000

⒌液相色谱-质谱各种联用技术的比较

⒍LC/MS与LC/UV的比较

四、LC/MS对LC的要求

⒈ESI的最佳流速是1~50Ul/min，应用4.6mm内径LC柱时要求柱后分流，目前大多采用1~2mm内径的微柱。

⒉APCI的最佳流速约1ml/min，常规的直径4.6mm柱最合适。

⒊LC/MS接口避免进入不挥发的缓冲液，避免含磷和氯的缓冲液，含钠和钾的成分必须＜1mmol/L。

含甲酸（或乙酸）＜2%。

含三氟乙酸≤0.5%。

含乙胺＜1%。

含醋酸胺＜10~5mmol/L。

送样前一定要摸好LC条件，能够基本分离，缓冲体系符合MS要求。

⒋总离子流（TIC）可以与UV图相对照，特征离子的质量色谱在复杂化合物分析及痕量分析时是LC/MS测定中最有用的谱图。

为了提高分析效率，常采用＜1ml/min，常规的直径4.6mm柱最合适。

⒌样品的预处理：

⑴为什么要进行样品的预处理

认为LC/MS/MS不需要样品预处理的理解是片面的

防止固体小颗粒堵塞进阳管道和喷嘴

获得最佳的分析结果

从ESI电离的过程分析：

ESI电荷是在液滴的表面样品与杂质在液滴表面存在竞争

不挥发物防碍带电液滴表面挥发

带电离子进入气相

大量杂质防碍带电样品离子进入气相状态

大量杂质离子的存在增加电荷中和的可能。

⑵样品的预处理常用方法

a）超滤

b）溶剂萃取/去盐

c）固相萃取

d）灌注（Perfusion）净化/去盐

e）色谱分离

反相色谱分离

亲和技术分离

五、用大气压电离质谱仪得到的分子量信息

分子离子是最有用的特征离子

⒈测定分子量的方式：

对于极性化合物使用ESI方式正离子扫描负离子扫描

对于中性或弱极性化合物使用APCI方式

正离子方式常出现如下离子：

-Na22Da.HigherthanM+H

-K38Da.HigherthanM+H

-Li6Da.HigherthanM+H

-NH417Da.HigherthanM+H

-ACN40Da.HigherthanM+H

2M+H,2M+Na等

负离子方式常出现如下离子:

-TFA114Da.HigherthanM-H（113and227background）

-Acetate60Da.HigherthanM-H

-Formic46Da.HigherthanM-H

-CI36Da.HigherthanM-H

⒉影响分子量测定的因素：

1）PH的影响

2）气流和温度

3）溶剂和缓冲液流量

4）溶剂和缓冲液的类型

5）选择合适的液相色谱类型

6）合适的电压

7）样品结构和性质

8）杂质的影响

⒊根据多电荷离子计算分子量

有些化合物，如蛋白质类，经常带有多个电荷

质谱仪分析荷质比（m/z），这些离子以“表观”质量数出现在质谱图上既得到M1，M2，M3……

相邻两个质谱峰的电荷数差1，即n，n+1

设样品的真实分子量为M

可列出方程组：

n1=n2+1……

（1）

（M+n1H）/n1=M1

（M+n2H）/n2=M2

M为真实分子量

H为质子的质量

n1，n2，为电荷数

M1，M2为质谱测得的离子“表观”质量数

解方程组，得到电荷数，进而算出分子量M

n2=（M1-H）/（M2-M1），（n2取最接近的整数）

M=n2.（M2-H）

⒋分子量测定中的误判

溶剂中的杂质

来自于塑料添加剂的峰

常见表面活性剂的峰

进样系统污染

样品在源内碎裂，形成碎片离子

LC-MS中常见的本底离子

m/z15-150，溶剂离子，〔（H2O）nH+，n=3-112〕

m/z102，H+乙腈+乙酸，C4H7NO2H+，1020549

m/z149，管路中邻苯二甲酸酯的酸酐，C8H4C3H+，149.0233

m/z288，2mm离心管产生的特征离子

m/z279，管路中邻苯二甲酸二丁酯，C16H22O4H+，289.1591

m/z316，2mm离心管产生的特征离子

m/z384，瓶的光稳定剂产生的离子

m/z391，管路中邻苯二甲酸二辛酯，C24H38O4H+，391.284

m/z358，乙酸+氧+铁（喷雾管），Fe3O（O2CCH3）6，537.879

⒌分子量测定失败的原因

a）流动相不合适

b）不挥发性盐的影响

c）成分复杂，杂质太多

d）样品浓度不够

e）pH值不合适

f）样品在源内分解或碎裂

六、LC/MS/MS

⒈化合物鉴别

⑴全扫描方式

全扫描数据采集用于鉴别是否有未知物，并确认一些判断不清的化合物，如：

合成化合物的质量及结构。

⑵子离子分析

子离子，用于结构判断和选择母离子作多种反应监测（MRM）。

子离子谱图与锥体电压断裂谱图可能十分相似，所不同的是子离子质谱图出知只有一种质量通过MS1，因此也已知所有碎片离子都是由我们所选定的母离子所产生的，所以我们更相信由MS/MS产生的谱图的纯度。

⒉目标化合物分析

⑴选择离子记录（SIR）

SIR用于检测已知或目标化合物，比全扫描方式能得到更高的灵敏度，这种数据采集的方式一般用在定量目标化合物之前，而且往往需要已知化合物的物质。

若几种目标化合物用同样的数据采集方式监测，那么可以同时测定几种离子。

⑵多反应监测（MRM）

MRM操作方式用于检测已知或目标化合物，既有高灵敏度又有高选择性。

MRM可以看作两个SIR而且MRM在许多方面提供的特殊性比SIR还要好。

MRM与SIR相似，得不到普通的质谱图，若要观看谱图，只能见到一种质量的峰；选用MRM代替SIR可以分析那些本底复杂的化合物。

⑶母离子扫描（PAR，Precursor）

母离子分析可用来鉴定和确认类型已知的化合物，尽管它们的母离子的质量可以不同，但在分裂过程中会生成共同的子离子，这种扫描功能在药物代谢研究中十分重要。

⑷中性丢失扫描（NEUTRALLOSS）

中性丢失扫描分析可用来鉴定和确认类型已知的化合物，例如新生儿遗传疾病筛查中某些检测项目。

也可以帮助进行未知物结构判断，例如有中性丢失18Da的意味着-H2O，28-CO，30-HCOH，32-CH.OH，44-CO2等等。

中文参考书：

《有机质谱原理及应用》科学出版社，2001

《分析化学手册（九）-质谱分析》，化学工业出版社，2000

《色谱联用技术》化学工业出版社，2001

《肿瘤蛋白质组学》湖南科学技术出版社，2002

《现代药物分析选论》中国医药科技出版社，2001

《有机化合物的结构鉴定与有机波谱学》科学出版社，2000

《现代有机质谱技术及应用》中国人民公安大学出版社，1999

《中草药现代研究-仪器分析卷》北医/协和联合出版社，1999

《分析仪器手册》化学工业出版社，1997

《现代有机与生物质谱》北京大学出版社，2002

七、应用

APPLICATIONAREA

Pharmaceutical

Drugdiscovery（QualitativeQuantitation）

Clinicaltrials（Quantitation）

Drugproduction（QA/QC）（Quantitation）

Biomolecules（Qualitative）

Protreomics（Qualitative）

Agricultural（Quantitation）

Environmental（Qualitativ