完整word版荧光分析法.docx
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完整word版荧光分析法
教案首页
教案完成时间：
2006年1月
课程名称
仪器分析
授课年级及专业
药学2004级
教学内容
授课题目
（章、节）
第十二章荧光分析法
教材名称
《分析化学》（第五版），李发美主编，人民卫生出版社
教材起止页码
229~242
计划学时
3
教学要求
掌握内容
1．荧光分析法的基本原理（荧光的产生、荧光光谱的特征）；
2．荧光定量分析方法（荧光强度与物质浓度的关系、荧光定量分析条件及方法）；
熟悉内容
1．分子结构与荧光的关系；
2．影响荧光强度的外界因素。
了解内容
1．荧光分析仪器；
2．荧光分析新技术。
教学要点
重点
荧光分析法的基本原理
难点
影响荧光强度的内外因素
教学进程
第一节荧光分析法的基本原理（1。
5学时）
第二节荧光定量分析方法（0.5学时）
第三节荧光分光光度计和荧光分析新技术（1学时）
教学方法
采用多媒体教学方式,以教师课堂讲授为主，辅以提问、讨论等多种方式，部分内容学生课后自学.
参考资料
1．《分析化学》（第四版）下册，孙毓庆主编，人民卫生出版社
2．湖南大学化学主干课程系列教材《分析化学》,张正奇主编，科学出版社
3．北京大学化学科学译丛《分析化学》,R。
KellnerJ.–M.MermetM。
OttoH.M.Widmer等编著，北京大学出版社
4．《仪器分析》（第二版），朱明华主编，高等教育出版社
教研室审阅意见：
______________（教研室主任签名）
年月日
（教案续页）
第8次课授课时间：
2006年3月31日授课地点：
第32教室
教学主要内容
教学要求、方法
及时间分配
第十二章荧光分析法
计划学时数：
3学时
内容提要：
本章属于发射光谱分析，主要介绍了荧光分析法的基本原理、定量分析方法及仪器与技术.
概述
[副板书］吸收某种波长的光后发射出比原来吸收波长更长的光的现象称为光致发光，最常见的光致发光现象是荧光和磷光。
根据物质的分子荧光光谱进行定性分析，以荧光强度进行定量分析，这就是通常讲的荧光分析法。
荧光根据分析对象分为原子荧光和分子荧光；根据激发光的波长范围又可分为紫外-可见荧光、红外荧光和X射线荧光（本章主要介绍分子紫外-可见荧光）。
荧光分析法与UV-vis的主要区别在于：
紫外-可见分析是利用紫外光照射物质后产生吸收，测其吸光度;而荧光是在透射光的垂直方向测发射荧光的强度,以免透射光干扰.简单的说，二者的区别主要在于光路不同.
第一节基本原理
计划学时数：
1.5学时
内容提要：
本节介绍荧光分析法的基本原理，主要讲解荧光产生的原理、光谱特征、强度及其影响因素。
本节为本章重点、难点.
一、分子荧光的产生
㈠荧光和磷光
1．单重态与三重态
通常在室温下，分子处于电子能级的基态（S0），电子成对地填充在能量最低的各个轨道上（P230图12—1A）,根据Pauli不相容原理，这两个电子的自旋方向相反，自旋量子数分别为1/2和—1/2，总自旋量子数s=0，即基态没有净自旋，这样的分子放在磁场中就不会发生能级的分裂，这样的电子能级称为单重态（S），其多重性M=2s+1=1。
［多媒体1：
荧光分析法]（本章内容提要）
[多媒体2:
荧光分析法概述之概念及分类］（简单介绍荧光分析法的基本概念、分类、特点及应用等）
［多媒体3:
荧光分析法概述之与UV—vis的区别及仪器］（【掌握】荧光分析法与UV-vis的区别主要在于光路不同）
［主板书］
［多媒体4：
荧光分析法的基本原理]（本节内容提要）
[主板书]［多媒体5:
单重态与三重态］（【熟悉】概念及区别）
（教案续页）
第次课授课时间：
授课地点：
教学主要内容
教学要求、方法
及时间分配
基态分子的成对电子吸收光能后，可被激发到高能级：
若电子跃迁后，电子的自旋仍处于配对状态，自旋方向相反（s=0）,这种情况称为激发单重态（M=2s+1=1）（P230图12—1B）；若电子跃迁后，发生自旋反转，自旋方向平行,总自旋量子s=1时，多重性M=2s+1=3,这样的电子能级称为三重态（T）,这种情况称为激发三重态（P230图12—1C）.因为在两个未占满的电子轨道中，电子自旋不受Pauli不相容原理的限制，自旋方向可以相同。
激发三重态的能量略低于相应激发单重态。
2．荧光的产生
处于激发态的分子返回基态的几种途径：
图中S0表示分子的基态，S1*表示第一电子激发单重态，S2*表示第二电子激发单重态，T1*表示第一电子激发三重态。
⑴振动弛豫激发态的分子在很短时间内（约10—12秒），通过与溶剂分子间的碰撞，将过剩的振动能量以非辐射的形式传递给溶剂分子,释放振动能量后,从较高的振动能级下降至同一电子激发态的最低振动能级上，这一过程叫振动弛豫（P230图12—2b），属于无辐射跃迁。
S1＊（V=1,2，3……）→S1*（V=0）
S2＊（V=1,2,3……）→S2＊（V=0）
⑵内部能量转换如果受激分子以无辐射跃迁方式从较高电子能级的较低振动能级转移至较低电子能级的较高振动能级上,这个过程叫内部能量转换,简称内转换。
内转换在激发态与基态之间不易发生,而在两电子激发态能级非常靠近以至其振动能级有重迭，能量相差较小时容易发生。
[主板书]［多媒体6:
激发态→基态途径（图）］（本章重点、难点）
[多媒体7：
激发态分子返回基态的途径]（【掌握】六种途径，【熟悉】基本概念）
[主板书］[多媒体8]（强调两点:
同一电子能级和无辐射跃迁）
[主板书］[多媒体8：
激发态分子返回基态的途径之内转换]
（教案续页）
第次课授课时间:
授课地点:
教学主要内容
教学要求、方法
及时间分配
⑶荧光发射当激发分子通过振动弛豫达到第一电子激发单重态的最低振动能级后,再以辐射形式发射光量子而返回至基态的各个振动能级时,所发射的光量子即为荧光。
荧光：
S1＊（V=0）→S0（V=1,2，3……）
由于振动弛豫和内转换损失了部分能量，荧光的能量小于原来吸收紫外光（激发光）的能量，所以发射的荧光波长总比激发光波长更长.
⑷外部能量转换如果溶液中激发分子通过碰撞将能量转移给溶剂分子或其它溶质分子（常以热能的形式放出），而直接回到基态的过程叫作外部能量转换，简称外转换。
⑸体系间跨越处于激发单重态较低振动能级的分子有可能发生电子自旋反转而使分子的多重性发生变化，经过一个无辐射跃迁转移至激发三重态的较高振动能级上，这一过程称为体系间跨越。
分子中有重原子（I或Br），由于自旋-轨道的强偶合作用,电子自旋可以逆转方向，发生体系间跨越从而使荧光减弱.
⑹磷光的产生受激分子经激发单重态到三重态体系间跨越后,很快发生振动弛豫，到达激发三重态的最低振动能级,分子在三重态的寿命较长（10-4~10S），所以可延迟一段时间，然后以辐射跃迁返回基态的各个振动能级,这个过程所发射的光即为磷光.
S1*体系间跨越T1＊（V=1，2，3……）振动弛豫T1＊（V=0）辐射S0（V=1，2,3……）
荧光和磷光的主要区别在于：
就发光机制而言，荧光是由单重态→单重态的跃迁产生的；而磷光是由三重态→单重态的跃迁产生的;如用实验现象加以区别,对荧光来说，当激发光停止照射时,发光过程随之消失（10—9～10—6秒）；而磷光则将延续一段时间（10-3~10秒）。
磷光的能量比荧光小（因三重态的能量比单重态的低）,波长较长，发光的时间也较长。
㈡激发光谱与荧光光谱（荧光物质分子的两个特征光谱）
由光源发出的紫外光，通过激发分光系统分光后照射到样品，样品受激发射荧光，在垂直方向检测荧光信号，以免透射光的干扰。
这部分荧光再通过发射分光系统后进入检测器.
激发光谱就是将激发荧光的光源用激发分光系统I分光，测定每一激发波长所发射的荧光强度，然后用F~λex作图。
使激发光的波长和强度不变,而让物质所产生的荧光通过发射分光系统II分光，测定每一发射波长荧光强度F，以F~λem作图,得到的就是荧光光谱。
[多媒体8]（本章重点,【掌握】荧光的概念及产生原理，强调从第一电子激发单重态最低振动能级）
［多媒体9］（与荧光、磷光对比）
[主板书］［多媒体9］
[主板书]［多媒体9]（与荧光对比讲解）
[多媒体10：
荧光与磷光的主要区别］（要求【掌握】，从两个方面讲解）
［主板书］[多媒体11：
激发光谱与荧光光谱］（【掌握】概念及用途）
（教案续页）
第次课授课时间:
授课地点：
教学主要内容
教学要求、方法
及时间分配
溶液荧光光谱通常具有如下特征：
1．斯托克斯位移
荧光发射波长总是大于激发波长的现象。
产生斯托克斯位移的原因，是因为分子受激时可能被激发到各级电子激发态的各个振动能级，而发射荧光时，总是从第一激发态的最低振动能级回到基态，有一部分能量损失。
2．荧光光谱的形状与激发波长无关
因为分子受激时,可能被激发到第一激发态或第二、三激发态,而发射荧光时，只能从第一激发态最低振动能级回到基态的各个振动能级
3．荧光光谱与激发光谱的镜像关系
因为电子从基态跃迁至激发态时，可跃迁至激发态的各个振动能级，而引起的这些小峰,而荧光光谱是从第一激发态的最低振动能级跃迁至基态各个振动能级.两个能级的振动能级相似，所以在激发光谱中跃迁能量最小的与荧光光谱中发射能量最大的相对应，激发光谱是以S0（V=0）→S1*（V=1，2，3，4），荧光光谱是以S1*（V=0）→S0（V=1，2,3,4）。
由于荧光能量小在长波段,激发光谱能量大在短波段,所以它们之间形成镜像。
二、荧光与分子结构
㈠荧光寿命和荧光效率（荧光物质的两个重要发光参数）
1．荧光寿命（τf）
荧光寿命是指当激发光停止照射时，分子的荧光强度降低到激发时最大荧光强度的1/e所需的时间。
当荧光物质受到一个极其短暂的光脉冲激发后,它从激发态到基态的变化可用指数衰减定律表示：
Ft=F0e-Kτ
F0和Ft分别是在激发时t=0和激发后时间t时的荧光强度，K是衰减常数.假定t=τf时，测得Ft=（1/e）F0：
则
如果以Ft/F0~t作图，直线斜率为1/τf,由此可计算荧光寿命。
利用分子荧寿命的差别，可以进行荧光物质混合物的分析。
2．荧光效率（荧光量子产率,φf）指物质发射荧光的量子数与吸收激发光的量子数之比。
φf=发射荧光的量子数/吸收激发光的量子数
这个数字在0~1之间，其数值越大，荧光效率越高。
[主板书]
［多媒体13]
（【掌握】荧光光谱的三个特征，从荧光产生的原理加以讨论）
［主板书]（影响荧光强度的内部因素）
［多媒体16：
荧光寿命和荧光效率]（【熟悉】概念）
[主板书][多媒体17：
荧光寿命和荧光效率]（【熟悉】概念）
（教案续页）
第次课授课时间:
授课地点：
教学主要内容
教学要求、方法
及时间分配
㈡分子结构与荧光的关系
物质分子能发射荧光的两个必要条件是：
①有强的紫外—可见吸收；②有一定的荧光效率。
1．长共轭结构具有长共轭结构的分子都是一些芳香环、稠环或杂环的物质。
这类物质有利于荧光的发射，因为它们的共平面性大，π电子共轭程度也大，荧光效率就大。
所以共轭系统越长，荧光效率越大,激发波长、荧光波长长移。
例如：
λex（激发）λem（激发）φf
苯2052780。
11
萘2863210.29
蒽365400046
四苯3904800。
60
另外稠芳环分子排列的几何形状对荧光也有影响，比如蒽和菲都是三个苯环组成,蒽的荧光波长为400nm,菲的为350nm;又如四苯为480nm，苯并蒽为380nm。
蒽菲苯并蒽
另外，含有长共轭双键的脂肪烃也可能有荧光，但这类化合物为数不多。
λex=327nmλem=510nm
2．分子的刚性和共平面性在共轭系统中，分子的刚性和共平面性越大，越有利于荧光发射。
联苯φf=0.2芴φf=1.0
8-羟基喹啉8-羟基喹啉镁
［主板书］（【熟悉】分子结构对荧光强度的影响）［多媒体18：
物质分子发射荧光的条件]（【掌握】荧光产生的两个必要条件）
（教案续页）
第次课授课时间：
授课地点：
教学主要内容
教学要求、方法
及时间分配
1—二甲氨基萘—7-磺酸盐1—二甲氨基萘—8—磺酸盐
φf=0。
75φf=0。
03
对于顺反结构,顺式共面性差,反式共面性好，如1，2-二苯乙烯几乎无荧光，反式有荧光。
3．取代基
⑴供电子基：
如–NH2、—OH、-NHR、-NR2、-CN等，这些基团存在，使荧光效率增加φf↑,荧光强度增强F↑。
⑵吸电子基：
如—NO2、—COOH、—NHCOCH3、-C=O、-NO、—SH、卤素等，使荧光效率降低φf↓,减小跃迁几率,荧光强度减小F↓，甚至熄灭。
⑶-R、—SO3H、-NH3+:
对φf无影响，因为它们对芳香环π电子影响不大。
三、影响荧光强度的外界因素
1．温度随着温度降低，荧光强度增加。
所以一般尽量在低温下测定，以提高灵敏度。
2．溶剂荧光波长随着溶剂极性的增大而长移，荧光强度也增强。
这是因为在极性溶剂中π→π＊跃迁能量降低,且跃迁几率大，故φf增大，荧光增强，波长长移。
当溶剂粘度减小时，分子间的碰撞几率增加，荧光减弱。
含有重原子的溶剂如四溴化碳和碘乙烷等，也可使化合物的荧光大大减弱。
另外，溶剂如能与分子形成稳定的氢键，将使处在S1*（V=0）的分子减少，从而减弱其荧光.
3．pH值当荧光物质本身是弱酸或弱碱时（即结构中有碱性或酸性基团），溶液的pH对荧光强度有很大的影响。
所以要注意控制一定的pH值。
pH<2pH7~12兰色荧光pH〉13
4．荧光熄灭剂由于荧光物质分子与溶剂分子或其它溶质分子碰撞而引起荧光强度降低或荧光强度与浓度不呈线性关系的现象称为荧光熄灭（荧光猝灭）。
这种现象随物质浓度增加而增加。
引起荧光熄灭的物质称为荧光熄灭剂,如卤素、重金属离子、氧分子以及硝基化合物、重氮化合物、羰基、羧基化合物均为常见的荧光熄灭剂。
5．散射光由于光子与物质分子相互碰撞而产生的，分为两种:
一是瑞利光--光子与分子发生弹性碰撞,不发生能量交换，仅改变光子运动方向，频率不变；另一种是拉曼光——光子与分子发生非弹性碰撞,产生能量交换，光子的运动方向和频率均发生改变.
［主板书]（【熟悉】，简单介绍）
[多媒体24:
影响荧光强度的外界因素之温度、溶剂、pH值]
（教案续页）
第次课授课时间：
授课地点：
教学主要内容
教学要求、方法
及时间分配
较长的拉曼光与荧光接近，所以对荧光测定有干扰,应设法消除干扰.适当选择激发波长可消除拉曼光的干扰，要尽量选择使产生的拉曼光的波长与荧光波长相距较远。
选择激发波长时要考虑最大的荧光强度，又要考虑其纯度，必要时要牺牲一些荧光强度而保证荧光纯度.
6．激发光源荧光物质的稀溶液在激发光照射下，很易分解，使荧光强度逐渐下降,因此测定时速度要快，且光闸不能一直开着。
[多媒体28:
硫酸奎宁的荧光光谱与拉曼光谱］
（教案续页）
第9次课授课时间：
2006年4月4日授课地点:
第38教室
教学主要内容
教学要求、方法
及时间分配
第二节荧光定量分析
计划学时数：
0.5学时
内容提要：
本节为荧光定量分析方法介绍，主要讲解了荧光定量分析的依据—-F与C的关系及定量分析的条件，具体介绍了几种荧光定量分析方法，并与紫外—可见分光光度法的定量分析方法进行比较。
一、荧光强度（F）与物质浓度（C）的关系
一般是激发光的垂直方向去测定荧光.
设荧光物质溶液的浓度为C，厚度为l，荧光强度正比于吸收光的强度
F=K′（I0–I）（I=I010—ECl）
=K′（I0—I010—ECl）=K′I0（1—10—ECl）
=K′I0（1-e—2。
3ECl）（换以e为底）
根据太劳极数展开式：
ex=1+x/1！
+x2/2！
+x3/3！
+……
当ECl≤0。
05时，后面几项可忽略，则F=2。
3K′I0ECl=KC,这是荧光定量分析的依据.
因此荧光定量分析条件是ECl≤0.05，此时F=KC才成立，否则不成线性关系，所以测定荧光强度时要求样品溶液的浓度要低。
而且稀溶液有利于降低荧光自熄灭（内部猝灭）作用。
另一方面，荧光分析测定的是在很弱的背景上的荧光强度，其测定灵敏度取决于检测器的灵敏度，所以可通过改进检测系统和放大系统，将荧光信号放大，这样即使很稀的溶液（C很小）产生的微弱荧光也能被检测，因此荧光分析法的灵敏度很高.而紫外-可见分光光度法测定的是A=-lg（I/I0），当溶液很稀（C很小）时吸收光强很少，比值I0/I≈1,A≈0，这样吸光度就无法反映浓度，即使将光强信号放大，I0与I也同时放大,比值仍然不变，即无法像荧光分析那样通过提高检测灵敏度来改善方法灵敏度，因此紫外-可见分光光度法的灵敏度受到一定的限制而不如荧光分析高.
［主板书］
[多媒体29：
荧光定量分析]（本节内容提要,本章重点）
[主板书]［多媒体30：
F与C的关系]（强调荧光检测方向及原因）
（用数学太劳极数展开式推导荧光定量公式）
［多媒体31：
荧光定量分析的依据]（【掌握】荧光的定量条件及适用情况，归纳结论:
荧光分析适于稀溶液测定）
［多媒体32：
荧光分析法与UV-vis的灵敏度差异]（讲解荧光分析灵敏度高的原因并与UV-vis比较）
（教案续页）
第次课授课时间：
授课地点:
教学主要内容
教学要求、方法
及时间分配
二、定量分析方法
1．校正曲线法配制一系列浓度为C1、C2、C3……对照品溶液,分别测其F1、F2、F3……值，用F~C作图绘制校正曲线。
然后在同样条件下测定试样溶液的Fx，在校正曲线上查找对应的浓度Cx。
测定时荧光法与紫外-可见分光光度法的区别是：
紫外—可见分光光度法透过光的强度是有标准的，若全部透过（不被吸收）T=100％，A=0；如全部吸收，T=0，A=∞;而荧光强度却没有类似的标准，如不发射荧光，F=0；但F=100％的荧光强度却没有标准，因为实际检测的只是发射的部分荧光（与入射光垂直方向上的），所以只能确定一个相对标准，即选择配制的对照品溶液中浓度最大者作为F=100%的标准,或者以中间浓度作为F=50％的标准来校正仪器，以空白来调零.但在实际工作中,空白调零往往降低测定的灵敏度，因此仪器调零后,先测空白的荧光强度（F0）,再测对照品溶液和试样溶液的荧光强度（Fs和Fx）,所有测定值均须扣除空白后（Fs-F0、Fx—F0）再进行计算.
2．比例法若荧光分析校正曲线过原点,则可选择其线性范围用比例法测定。
即配制一对照品溶液（Cs）测其荧光强度（Fs），再测定试样溶液（Cx）的荧光强度（Fx）,然后进行比较。
测定时同样要以空白（F0）校正:
3．多组分混合物测定与吸光度一样,荧光强度也有加和性,因此混合物不需经过分离,就可用解联立方程的方法测定。
可选择两物质不同的激发波长处的荧光强度测定，也可选择不同荧光波长处的荧光强度测定，这样选择范围比紫外-可见分光光度法广泛。
[主板书][多媒体33：
荧光定量分析方法之校正曲线法]（【掌握】荧光定量分析方法，强调其与分光光度法的区别）
[主板书］［多媒体34:
荧光定量分析方法之比例法、多组分混合物测定］
（教案续页）
第次课授课时间:
授课地点：
教学主要内容
教学要求、方法
及时间分配
第三节仪器与技术
计划学时数：
1学时
内容提要：
本节主要介绍了荧光分析仪器的类型、主要部件和校正方法，简单介绍了一些较新的荧光分析技术，并就荧光分析在有机及无机化合物研究方面的应用作了简单介绍。
一、荧光分析仪器
1．仪器类型
⑴滤光片荧光计两个分光系统均采用滤光片分光。
激发滤光片让激发光（带通型）通过，发射滤光片常用截止滤光片（截止型），截去所有激发光和散射光,只允许试样荧光通过。
这种荧光计不能测定光谱，但可用于定量分析。
⑵滤光片—单色器荧光计将发射滤光片用光栅代替。
这种仪器不能测定激发光谱，但可测定荧光光谱及用于定量分析。
⑶荧光分光光度计两个分光系统均采用光栅分光。
可固定荧光波长，以不同激发光波长扫描,记录不同的荧光强度，即得激发光谱;也可固定激发光的最大波长，以发射荧光波长扫描，记录不同的荧光强度，即得荧光光谱.光谱中荧光物质的最大激发波长和最大荧光波长是鉴定物质的依据，也是定量测定时最灵敏的条件。
2．仪器主要部件：
激发光源、分光系统、样品池、检测器.
⑴激发光源其激发光源比紫外—可见分光光度计的光源强，通常用汞灯、氢灯、氙灯及卤钨灯。
[多媒体35:
荧光分析仪器与技术]（本节内容提要）
[主板书］[多媒体36、37:
荧光分析仪器类型]（【了解】，仪器作简单介绍）
[主板书］[多媒体38：
荧光分析仪器类型之荧光分光光度计］
[主板书][多媒体39：
荧光分析仪器的主要部件]
（教案续页）
第次课授课时间:
授课地点：
教学主要内容
教学要求、方法
及时间分配
⑵分光系统滤光片型荧光计通常采用两个滤光片，一个是放在光源和样品池之间，称为激发（第一）滤光片，第二是放在样品池与检测器间，称为荧光（第二）滤光片，第一滤光片的作用是把不需要的光线滤去,而让选择的激发光照到样品上;第二滤光片的作用是把所有会干扰测定荧光的杂光（如透射光、反射光、散射光及杂质荧光等）滤去.
滤光片常分为带通型及截止型两种：
带通滤光片只透过或吸收某波长范围的光；截止滤光片只让某波长的光通过，其它的激发光和散射光等截去。
在荧光分光光度计中，都用光栅作为单色器,光栅分出的光不随波长有疏密变化,而且光栅分出的谱线强度比棱镜分出的要强,灵敏度较高，但是色散后的光线有数级，须用前置滤光片加以消除。
⑶样品池测定荧光用的样品池必须用低荧光材料或石英材料，其形状是四面透光的方形（因要在与入射光垂直方向上测荧光），手拿时应拿棱角处。
⑷检测器紫外—可见荧光为紫外光或可见光，可用光电倍增管检测，其输出信号可用高灵敏度的微电流计测定,或经放大再输入记录器中，自动描绘光谱图（荧光分光光度计）。
3．仪器校正（荧光分光光度计）
⑴灵敏度校正荧光分光光度计的灵敏度与光源强度、单色器的性能、放大系统的特征和光电倍增管的灵敏度有关，还与选用的波长及狭缝有关，还与空白溶剂的拉曼光、激发光、杂质荧光等有关.须用被测荧光标准溶液中浓度最大者来校正F=100%,或用中间浓度校正F=50%.如被测物的荧光不稳定，就须另选稳定的荧光物质配制成浓度一致的对照品溶液来校正仪器.最常用的是硫酸喹啉，用0。
001g的喹啉标准品,溶于硫酸液（0.05mol/L）使成1μg/ml的浓度，将此溶液进行不同稀释后校正仪器.
⑵波长校正汞灯标准谱线校正。
⑶激发光谱与荧光光谱的校正目前多为双光束光路，故可用参比光束抵消光学误差。
✓荧光分光光度计与紫外—可见分光光度计的区别：
紫外
荧光
光路
升级会员 