细菌是如何从入侵者那里获得间隔序列.docx

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细菌是如何从入侵者那里获得间隔序列

细菌是如何从入侵者那里获得间隔序列

03122015-Nature-Article-CRISPR-Cas-adaptive-immunity

Comments'title:

Howbacteriagetspacersfrominvaders

评论题目：

细菌是如何从入侵者那里获得间隔序列（spacer）的

Comments'abstractBacteriauseCRISPR-Cassystemtodevelopimmunitytoviruses.DetailsofhowthesesystemsselectviralDNAfragmentsandintegratethemintobacterialDNAtocreateamemoryofinvadershavenowbeenreported.

评论摘要细菌会利用CRISPR-Cas系统来对病毒形成免疫作用。

本期Nature有人对这些系统如何选择病毒性DNA并通过将其整合到细菌性DNA中来对入侵者产生记忆进行了详细的报道。

（评论内容）

就在几年前，免疫性记忆还被人们认为是脊椎动物所特有的特征——科学家们会对认为细菌可能具有“记住”攻击过它们的病毒的想法不屑一顾。

然而这种几乎令人难以置信的细菌性免疫记忆的概念已经被人们证实确实存在了。

本期Nature中的两篇文章，一篇由Heler等人完成，另一篇由Nunez等人完成，对这一现象在分子机制方面目前所取得的进程进行了报道。

细菌是通过采集短DNA序列的方法来记住入侵者的，这些DNA序列被称为病毒遗传物质中的间隔序列前体（protospacer）。

这些序列被整合到细菌自身的DNA中，特异性地被整合在被称为常规聚集性间隔性短回文重复序列（CRISPR，图1）的重复性序列排列中；被整合进来的序列称为间隔序列（spacer）。

当细菌被一种已经被认知的病毒再次攻击时，这些间隔序列会从整个序列排列中被转录出来，所形成的转录物被用于对含有CRISPR相关性（Cas）蛋白的复合物进行引导，这种复合物会在病毒的核酸分子中将间隔序列前体切割。

如果转录形成的间隔序列引导Cas蛋白对CRISPR序列排列进行切割的话，是会发生CRISPR序列排列的偶然性破坏事件的，这样会使细菌的遗传物质发生灾难性的降解。

为了阻止这种自身免疫作用发生，一些细菌中含有那些只有当目标DNA两侧由已知的间隔序列前体占据时才会发生DNA切割的CRISPR-Cas系统，这些序列被称为间隔序列前体相邻基序（PAMs）。

而在没有PAMs的CRISPR序列排列中位于间隔序列两侧的重复序列则不会被切割（图1）。

哪一种间隔序列会被选定从而使其只对PAM相关性的间隔序列前体进行作用，这一作用的机制目前还不清楚。

Heler及同事展示了在两种链球菌（Streptococcus）中的Cas9蛋白会对具有正确PAM的间隔序列做出选择。

在此之前，人们已知这种蛋白的主要作用是切割目标DNA。

当作者们将具有不同PAM特异性的Cas9蛋白之间进行互换后，他们发现所形成的间隔序列会按着PAM的序列发生改变。

因此这些CRISPR-Cas系统会有效地利用Cas9的能力而为记忆以及切割等功能来识别PAM序列，而不是从杂乱无章的序列中使具有固定记忆作用的蛋白形成对PAM的识别。

在其他类型的CRISPR-Cas系统中，比如在大肠杆菌中，具有记忆作用的蛋白至少部分具有内在性的、通过一种迄今还不清楚的机制而对PAM编码性间隔序列前体做出选择的能力。

Figure1|Thebacterialimmuneresponse.a,WhenbacteriaareinvadedbyviralDNA,memorizingproteincomplexesoftheCRISPR–Casimmunesystemselectshortsequences（protospacers）oftheforeignDNAandintegratethemasspacersequencesintotheirownchromosome.Thespacersareintegratedintoanarrayofrepeatsequencescalledclusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats（CRISPRs）;differentspacersareshowninorange,pinkandred.b,IfthebacteriumissubsequentlyexposedtopreviouslyencounteredDNA,atranscriptofthespacerguidesacleavageproteincomplextocutouttheprotospacer.InsometypesofCRISPR–Cassystem,cleavageoccursonlyiftheprotospacerisflankedbyaprotospaceradjacentmotif（PAM）,andtheCRISPRarrayisnotcleavedbecausethespacerslackPAMs.Heleretal.andNu?

ezetal.reportdetailsofthemolecularmechanismsbywhichCRISPR–CassystemsselectandintegratespacersintobacterialDNA.

图1细菌性免疫应答

a，当细菌受到病毒DNA的侵袭时，CRISPR-Cas免疫系统的记忆作用蛋白复合物就会选择外源性DNA中较短的序列（间隔序列前体）并将作为间隔序列整合到细菌自身的染色体中。

这些间隔序列被整合到一种被称为聚集型正常间隔性短回文重复序列（CRISPRs）的重复性序列排列中；图中对不同的间隔序列以桔黄、粉红和红色来显示。

b，如果细菌再次暴露在之前遇到过的DNA中时，这些间隔序列的转录物会引导蛋白复合物进行一次切割，将间隔序列前体切割掉。

在某些类型的CRISPR-Cas系统中，切割作用只会在当间隔序列前体的两侧是由间隔序列前体临近基序（PAM）组成时才会发生，而在间隔序列两侧没有PAMs时CRISPR排列不会被切割。

Heler等人及Nunez等人对CRISPR-Cas系统选择并将间隔序列整合到细菌DNA中的分子机制的细节进行了报道。

Heler及同事接着展示了Cas9不仅是所形成的间隔序列中确定PAM序列所必需的，而且还是将间隔序列整合到CRISPRs中所必需的。

这种特征是Cas9所特有的，Cas9指的是可以切割核酸的一类蛋白，在所研究的其他类型的CRISPR-Cas体系中对外源性DNA整合中Cas9对核酸的切割作用并不是必需的，但在某种条件下Cas9的切割会对整合起促进作用。

这些发现为由体内条件下研究所揭示的分子性记忆作用的机制增加了重要的细节性内容。

每一个间隔序列都会整合到带有一个新重复序列的CRISPR排列中；我们已经知道新整合的重复序列会在新的间隔序列的另一侧维持原有的重复序列，而新间隔序列的整合可能会通过这个重复序列上两股DNA的分隔作用而发生。

但我们需要更多的信息，我们一直期待有一种能够揭示出更多机制性细节的体外检测系统。

Nunez及同事就建立了一套这样的系统：

它是由大肠杆菌的记忆性蛋白、一个作为间隔序列受体分子的超螺旋质粒DNA以及一个作为间隔序列供体分子的双链DNA所组成。

研究人员们首先通过使用这一系统证实许多CRISPR记忆作用进程特征的方式说明了这套系统的有效性。

接着他们对体外条件向插入的间隔序列的高通量测序结果进行了分析，并展示了记忆性蛋白通过对PAM中特异性核苷酸碱基的识别将间隔序列以正确的方向进行整合的过程。

重要的是，这一体系可以使间隔序列的供体很容易地被不同序列、不同末端修饰和双链组成的DNA所替换，从而可以对DNA这些特征对间隔序列整合作用的影响进行研究。

通过这种方法，Nunez等人展示了双链DNA底物上3'末端的羟基（OH）基团是整合作用所必需的。

基于这样一种需求，以及研究人员们在体内条件下所找到的整合作用中间产物的特点，作者们针对间隔序列插入作用提出了一种看起来非常合理的模型。

在这种模型中，记忆作用酶会催化间隔序列所在DNA链的3'末端与重复序列末端一个特定DNA链之间成键。

这一共价键形成后会接着在间隔序列的互补链3'末端与重复序列另一端互补链之间成键（参见原文图5）。

体外条件下对生物系统进行研究的好处是所有的组分都可以通过人工的方式加入到反应中；因此我们可以确定和操控反应所需的每一种组分以及它们的特征。

但反应过程中有可能会出现由于生理活动而形成的差异，这种差异可能会由于使用了与体内条件下不同的化学环境或者由于调节性元件的缺乏而形成的。

这样的元件可能不是一个反应末端产物形成所必需的，但它可能在生理过程中起到关键性的作用。

Nunez及同事正是对这样一种差异进行了报道。

体内水平研究的结果显示间隔序列的整合主要会发生在CRISPR排列的第一个重复序列上。

但与之相反的是，作者们发现在他们的体外系统中间隔序列的整合还会在其他重复序列附近发生，甚至在CRISPR排列之外发生。

研究人员们认为这一现象可能代表了一种形成新排列的生理性方式。

这是有可能的，但体内条件下的调节性元件或者生理条件可能通常会限制这种作用而使直接的整合作用发生在特异性位置上。

作者们还报道了PAM编码性间隔序列的供体在体外条件下并不是整合作用的理想底物，这与体内条件下所见到的相反。

还有，他们发现被整合的间隔序列的长度之间可能会相差很多，而在自然条件下被整合的间隔序列则会收到严格的长度限制。

这些差异可以通过这样的事实来解释，即这种体外系统只是模拟了间隔序列整合作用的最后一步；在自然过程中更早的各个步骤可能会在体内条件下形成对PAM的偏好性以及对限制性间隔序列长度的确定。

然而体内和体外条件下研究结果的差异对这个主要问题进行了强调，即在体内条件下是什么确定了新形成的间隔序列不变的长度。

这是由将受处理的间隔序列递交给记忆作用酶的蛋白复合物决定的吗？

如果是这样的话，这些蛋白又是什么样的呢？

我们需要一种由所有组分构成的体外系统来解决这些问题，这些构成体系的组分可以催化反应中的每一步。

PAMs会针对CRISPR排列阻止自身免疫性作用的发生，但如果CRISPR-Cas系统偶然性地对其他DNA序列进行切割的话，自身免疫性作用还是会发生。

因此这种情况是如何被阻止的？

我们已经知道外源性DNA分子要比宿主的染色体更频繁地被CRISPR-Cas系统所检测。

将来的研究应该对这种选择性检测作用背后的机制进行探索。

（评论完）

03122015-Nature-Article-CRISPR-Cas-adaptive-immunity

Article1Title：

Cas9specifiesfunctionalviraltargetsduringCRISPR-Casadaptation

题目：

CRISPR-Cas系统进行免疫适应时Cas9对有功能的病毒性作用目标进行确定

AbstractClusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat（CRISPR）lociandtheirassociated（Cas）proteinsprovideadaptiveimmunityagainstviralinfectioninprokaryotes.Uponinfection,shortphagesequencesknownasspacersintegratebetweenCRISPRrepeatsandaretranscribedintosmallRNAmoleculesthatguidetheCas9nucleasetotheviraltargets（protospacers）.StreptococcuspyogenesCas9cleavageoftheviralgenomerequiresthepresenceofa5'-NGG-3'protospaceradjacentmotif（PAM）sequenceimmediatelydownstreamoftheviraltarget.ItisnotknownwhetherandhowviralsequencesflankedbythecorrectPAMarechosenasnewspacers.HereweshowthatCas9selectsfunctionalspacersbyrecognizingtheirPAMduringspaceracquisition.Thereplacementofcas9withallelesthatlackthePAMrecognitionmotiforrecognizeanNGGNGPAMeliminatedorchangedPAMspecificityduringspaceracquisition,respectively.Cas9associateswithotherproteinsoftheacquisitionmachinery（Cas1,Cas2andCsn2）,presumablytoprovidePAM-specificitytothisprocess.TheseresultsestablishanewfunctionforCas9inthegenesisofprokaryoticimmunologicalmemory.

摘要聚集型正常间隔性短回文重复序列（CRISPR）的位点及其相关性（Cas）蛋白为原核生物针对病毒性侵袭提供了获得性免疫作用。

当细菌受到病毒的侵袭时，会把被称为间隔序列的病毒的短序列整合到CRISPR重复序列之间，这些序列会被转录形成小RNA分子，这些小RNA分子会引导Cas9核酸酶对病毒性作用目标（间隔序列前体，protospacer）进行作用。

产脓型链球菌（Streptococcuspyogenes）中的Cas9对病毒基因组的切割作用需要在病毒性序列作用目标下游有一个5'-NGG-3'间隔序列前体临近基序（PAM）序列的存在。

还不清楚两侧由正确的PAM占据的病毒性序列是否会被选定为新的间隔序列，也不清楚选择的过程是什么。

在此我们展示了Cas9会通过间隔序列形成期间对其PAM的识别来选定功能性间隔序列。

采用缺乏PAM识别作用基序或者识别NGGNGPAM的等位基因来取代cas9会使间隔序列形成过程中PAM的特异性消失或得到改变。

Cas9还与其他间隔序列形成作用机制性蛋白（Cas1、Cas2和Csn2）之间有相互作用，我们认为这些作用为这一进程提供了PAM特异性。

这些结果说明Cas9在原核生物免疫记忆的形成中实施一种新功能。

（正文）

CRISPR位点和Cas蛋白为细菌和古细菌针对病毒的侵袭提供了获得性免疫作用。

为了适应高度变化的病毒群体，CRISPR-Cas位点也经历了快速的进化过程，这个过程包括将被称为间隔序列（spacer）的短噬菌体序列整合到CRISPR重复序列之间从而形成对侵袭的记忆记录。

间隔序列可以被转录成小CRISPRRNAs（crRNAs），这些小RNA分子会通过与侵入的DNA之间形成直接的Watson-Crick配对来找出病毒性作用目标（被定义为间隔序列前体，protospacer）。

基于其cas基因所包括的内容，CRISPR-Cas系统可以分为三种不同的类型：

I型、II型和III型。

每一种CRISPR-Cas类型都有着crRNA生物合成、目标清除以及阻止自身免疫作用发生的不同机制。

在产脓性链球菌中存在的II型CRISPR-Cas系统中，Cas9核酸酶会采用crRNAs作为引导序列将双链DNA断裂引入到病毒基因组中的方法使侵袭的噬菌体失活。

Cas9的切割需要在间隔序列前体下游区域存在一个间隔序列前体临近基序（PAM）。

这一需求避免了对CRISPR排列内对间隔序列的切割，也就是自身免疫作用，因为相邻的重复序列中没有PAM序列。

PAM序列对目标识别和切割的重要性说明存在着这样一种机制，它通过正确的PAM序列来保证新形成的间隔序列与其两侧的间隔序列前体之间形成匹配。

对于大肠杆菌中的I-E型CRISPR-Cas系统来说，过量表达cas1和cas2足以在没有噬菌体侵袭的条件下形成新的间隔序列。

有报道指出以这种方式形成的间隔序列会偏好性地（25-70%）与带有正确PAM的间隔序列前体形成匹配（AWG，W=A/T），这说明Cas1和Cas2足以使间隔序列形成并具有某种对带有正确PAM的间隔序列前体进行识别的内在能力。

在产脓型链球菌的II型系统中，PAM的序列是NGG（低频NAG），其中N可以是任何核苷酸；这一基序可以在目标切割期间被Cas9核酸酶中的一个结构域进行识别和结合。

在这一系统中间隔序列是如何形成的，特别是在这一过程中带有正确PAM序列的间隔序列是如何被选定的我们一无所知。

Cas9是间隔序列形成所必需的

为了研究间隔序列形成时PAM临近的间隔序列前体识别作用的机制，我们将产脓性链球菌的II-A型CRISPR-Cas位点克隆到链球菌载体pC194中，并将得到的质粒引入到金黄葡萄球菌RN4220中（图1a），RN4220菌株中没有CRISPR-Cas位点。

我们选择这套实验体系是因为它很容易进行产脓性链球菌CRISPR-Cas系统的遗传性操控。

我们首先通过使用链球菌噬菌体?

NM4γ4进行感染的方法检测了细菌细胞形成获得性CRISPR免疫作用的能力，?

NM4γ4是?

NM4的溶菌性变异株。

通过将细菌和噬菌体在上层琼脂中混合而进行的检测，我们将对噬菌体具有抗性的细菌克隆挑出来并进行PCR检测，对CRISPR排列的扩增情况进行检测（扩展数据图1a）。

抗性克隆中大概有50%的克隆形成了一个或多个间隔序列（三次独立实验中分别为8/13、5/11、7/16），而其余的抗性克隆则是通过非CRISPR机制而对噬菌体侵袭形成存活的，这些非CRISPR机制很可能包括噬菌体受体的突变（扩展数据图2a）。

为了最大限度地捕获新间隔序列的序列，我们在液体中进行了同样的检测，并在噬菌体侵染的最后阶段重新收集那些存活下来的细菌。

这些细菌我们通过PCR对其CRISPR排列进行分析，发生了扩增的位点上的PCR扩增产物则通过IlluminaMiSeq序列测定来确定间隔序列形成的程度。

对296万个测序阅读进行的分析检测出在病毒基因组中的2687个NGG序列中有2083个是间隔序列临近序列，虽然每个序列的形成频率中存在一定的变异（扩展数据图1b）。

这些数据展现了与带有下游NGGPAM序列的间隔序列前体相匹配的间隔序列的主要选择结果（99.97%，扩展数据图1c）。

在液体培养基中细菌细胞对新间隔序列的这种形成过程被证实是一种简单但高效的过程，说明在一个简单步骤中对上百万的新间隔序列进行检测是可能的。

因此我们在研究中一直使用这一检测方法。

为了确定间隔序列形成所需的遗传性条件，我们将细菌菌株进行了cas1、cas2或csn2的单个缺失性菌株的改造，并将改造后的菌株使用?

NM4γ4噬菌体进行侵染。

在每一种改造后的菌株中间隔序列的形成降低到我们能检测到的范围之外（图1b），这与之前的实验结果相一致。

因此虽然Cas1、Cas2和Csn2在细菌已有间隔序列的条件下并不是细菌形成抗噬菌体免疫作用所必需的（扩展数据图2b，c），但它们是间隔序列形成所必需的。

为了确定这些基因是否足以诱发这一过程，我们在质粒pRH233中通过采用四环素诱导性启动子在cas9缺乏的条件下在细菌中过量表达cas1、cas2和csn2，并在没有噬菌体侵染的条件下使用高敏感度PCR检测方法来检测新间隔序列的整合情况（扩展数据图3）。

我们即使在有诱导剂存在的条件下也检测不到新的间隔序列（图1c）。

但当我们加入第二个从细菌的天然启动子下表达tracrRNA和Cas9的质粒后（扩展数据图3）会在只有诱导剂存在时有间隔序列的形成，所有新形成的间隔序列都与染色体或质粒的序列相匹配（图1c，扩展数据表1）。

尽管很有可能这些间隔序列的形成会分别导致细胞的死亡或者质粒的消除（plasmidcuring），但采用我们高敏感性PCR检测的方法仍然可以在液体培养的条件下检测到间隔序列的形成（扩展数据图3b，c）。

tracRNA（图1a）是一种可以与Cas9结合的小RNA，它是crRNA加工过程和Cas9核酸酶活性所必需的。

我们想知道间隔序列形成中Cas9的参与是否还需要tracrRNA的存在。

在没有噬菌体侵染的条件下，删除tracrRNA会阻止间隔序列的形成（图1c），说明apo-Cas9并不足以促进间隔序列的形成，还需要它保持与其共同作用因子之间的相互作用。

综上，这些数据说明Cas1、Cas2和Csn2是新间隔序列整合的必要但非充分条件，整合作用还需要tracrRNA-Cas9复合物的参与。

这与大肠杆菌的I-E型CRISPR-Cas体系相反，在后者中Cas1和Cas2的过量表达足以导致间隔序列进行整合。

需要提请注意的是在这一检测中所使用的CRISPR排列是由单个重复序列所组成的，没有已知的间隔序列（扩展数据图3）。

因此间隔序列整合作用对Cas9的需求并不是一种已知的“启动后”间隔序列形成作用所造成的结果。

这一结果说明在I型CRISPR-Cas系统中所见到的间隔序列形成的频率有所增加，而这种I型的CRIPSR-Cas系统依赖于带有部分与噬菌体基因组相匹配的已有的间隔序列的存在，而且还要有完整的对目标实施作用的复合物的存在。

Figure1|Cas9isrequiredforspaceracquisition.

a,OrganizationoftheS.pyogenestypeIICRISPR–Caslocus.ArrowsindicatetheannealingpositionoftheprimersusedtocheckfortheexpansionoftheCRISPRarray.

b,PCRbasedanalysisofliquidculturestocheckfortheacquisitionofnewspacersequencesinthepresenceortheabsenceofphage?

NM4γ4infection.Wildtype（WT）aswellasdifferentcasmutantswereanalysed.Imageisrepresentativeofthreetechnicalreplicates.m.o.i.,multiplicityofinfection.

c,CulturesoverexpressingCas1,Cas2andCsn2underthecontrolofatetracycline-induciblepromoterwereanalysedusingPCRforspaceracquisitionintheabsenceof