学年高中生物 专题1 基因工程 12 基因工程的基本操作程序 122 目的基因的导入检测与鉴定学案.docx

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学年高中生物专题1基因工程12基因工程的基本操作程序122目的基因的导入检测与鉴定学案

1．2.2　目的基因的导入、检测与鉴定

[学习目标]　1.理解目的基因导入受体细胞的方法。

2.掌握检测与鉴定目的基因的方法。

方式一　通过前面的学习，我们了解了基因工程中目的基因的获取和基因表达载体的构建。

在目的基因与载体连接成重组DNA分子以后，下面的重要工作主要是将其导入受体细胞进行扩增和筛选，获得大量的重组DNA分子，这就是外源基因的无性繁殖，即克隆（cloning）。

方式二　目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。

这是基因工程的第四步工作。

在完成将目的基因导入受体细胞这一步骤后，在全部的受体细胞中，真正能够摄入重组DNA分子的受体细胞是很少的。

因此，必须通过一定的手段对受体细胞中是否导入了目的基因进行检测。

检测的方法有很多种，例如，大肠杆菌的某种质粒具有青霉素抗性基因，当这种质粒与外源DNA组合在一起形成重组质粒，并被转入受体细胞后，就可以根据受体细胞是否具有青霉素抗性来判断受体细胞是否获得了目的基因。

重组DNA分子进入受体细胞后，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达过程。

一、将目的基因导入受体细胞

1．转化的含义

目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。

2．转化的方法

（1）导入植物细胞

①农杆菌转化法：

将目的基因导入双子叶植物和裸子植物时最常用方法。

a．土壤农杆菌的特点：

植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌侵染，其Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞的染色体的DNA上。

b．方法步骤：

目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→转入农杆菌→导入植物细胞→目的基因插入植物细胞中的染色体DNA上→目的基因表达。

②基因枪法：

将目的基因导入单子叶植物常用的方法。

目的基因包裹在微小的金粉粒子或钨粉粒子表面→用基因枪高速射入受体细胞或组织中→目的基因表达。

③花粉管通道法

在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，滴加目的基因，使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。

（2）导入动物细胞

①方法：

显微注射技术。

②常用受体细胞：

受精卵。

③步骤：

目的基因表达载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的转基因动物

（3）导入微生物细胞

①原核生物的特点：

繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等。

②常用的方法：

a．用Ca2＋处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态（这种细胞称为感受态细胞）。

b．感受态细胞和重组表达DNA分子在缓冲液中混合，细胞吸收重组表达载体DNA分子。

归纳总结

1．上述方法中，在将目的基因导入受体细胞之前，都必须进行基因表达载体的构建，也就是说导入受体细胞的必须是重组DNA分子，而不是直接导入目的基因。

2．对于植物来说，受体细胞可以是受精卵或体细胞，因为植物细胞具有全能性。

3．对于动物来说，受体细胞一般是受精卵，因为受精卵的全能性高，而高度分化的动物体细胞的全能性受到抑制。

4．大肠杆菌和酵母菌在基因工程中都可以作为受体细胞，但又有所不同。

大肠杆菌为原核细胞，而酵母菌为真核细胞（具有多种细胞器），所以酵母菌在用于生产需要加工和分泌的蛋白质时比大肠杆菌有优势。

例1

　农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下感染植物，因而在植物基因工程中得到了广泛的运用。

下图为农杆菌转化法的示意图，试回答下列问题：

（1）一般情况下农杆菌不能感染的植物是____________，利用农杆菌自然条件下感染植物的特点，能实现____________________________________________________________________

________________________________________________________________________的目的。

具体原理是在农杆菌的Ti质粒上存在T-DNA片段，它具有可转移至受体细胞并整合到受体细胞____________上的特点，因此只要将携带外源基因的DNA片段插入到____________（部位）即可。

（2）根据T-DNA这一转移特点，推测该DNA片段上可能含有控制______________________酶合成的基因。

（3）图中c过程中，能促进农杆菌向植物细胞转移的物质是__________类化合物。

（4）植物基因工程中除了农杆菌转化法之外，还可采取____________________________（至少写出两种）。

答案　

（1）单子叶植物　将目的基因导入植物细胞　染色体的DNA　T-DNA片段（内部）　

（2）DNA连接酶、限制　（3）酚　（4）基因枪法、花粉管通道法

解析　

（1）一般农杆菌不能感染的植物是单子叶植物，可感染双子叶植物和裸子植物。

利用其感染性，可实现目的基因导入植物细胞的目的。

真正可转移至受体细胞并整合到受体细胞染色体的DNA上的是农杆菌T-DNA片段，因此目的基因必须插入到该部位才能成功。

（2）根据T-DNA这一转移特点，可以推测该DNA片段能控制合成DNA连接酶、限制酶以实现与双子叶植物细胞染色体DNA的整合。

（3）植物细胞受伤后可产生酚类物质，促进农杆菌向植物细胞转移。

（4）植物基因工程中除了农杆菌转化法之外，还有基因枪法和花粉管通道法等。

易错易混

　农杆菌转化法中两次拼接、两次导入的辨析

第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA的中间部位，第二次拼接（非人工操作）指被插入目的基因的T-DNA被拼接到受体细胞染色体的DNA上；第一次导入是将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌，第二次导入（非人工操作）是指含目的基因的T-DNA导入受体细胞。

例2

　下列关于目的基因导入受体细胞的描述，不正确的是（　　）

A．基因枪法导入植物体细胞的方法比较经济和有效

B．显微注射技术是转基因动物中采用最多的方法

C．大肠杆菌最常用的转化方法，是使细胞的生理状态发生改变

D．农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞最常用的方法

答案　A

解析　不同受体细胞导入目的基因的方法不同，每种方法都有利弊。

目的基因导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法，该方法比较经济和有效；目的基因导入动物细胞常用的方法是显微注射技术；目的基因导入大肠杆菌细胞最常用的转化方法就是用钙离子处理细胞，使细胞的生理状态发生改变，完成转化。

二、目的基因的检测与鉴定

1．分子水平的检测

（1）检测目的基因是否插入受体细胞的DNA中：

DNA分子杂交技术。

用放射性同位素标记的含有目的基因的单链DNA片段制成基因探针。

将转基因生物的基因组DNA提取出来，和基因探针进行杂交，如果出现杂交带，说明目的基因已插入受体细胞的DNA中。

（2）检测目的基因是否转录：

分子杂交技术。

将转基因生物提取出来的mRNA和基因探针进行杂交，如果出现杂交带，说明目的基因已经转录。

（3）检测目的基因是否翻译：

抗原－抗体杂交技术。

从转基因生物提取出来的蛋白质和相应的抗体进行杂交，如果出现杂交带，说明目的基因已经翻译。

2．个体水平的鉴定

（1）抗虫或抗病的接种实验。

（2）有的基因工程产品需要与天然产品的功能进行活性比较。

归纳总结

1．目的基因的检测与鉴定归纳

2．不同分子检测原理的异同

（1）在DNA分子、mRNA分子上检测目的基因是否插入、目的基因是否转录时，用的探针都是放射性同位素等标记的含有目的基因的DNA片段。

检测原理都是碱基互补配对原则，只是被检测的物质不同，一个是转基因生物的基因组DNA，一个是转基因生物细胞内的mRNA。

（2）进行翻译水平的检测，则是利用抗原与抗体特异性结合的原理。

例3

　目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过鉴定和检测才能知道。

下列属于目的基因检测和鉴定的是（　　）

①检测受体细胞的染色体上是否有目的基因　②检测受体细胞是否有致病基因　③检测目的基因是否转录出了mRNA　④检测目的基因是否翻译出了蛋白质

A．①②③

B．②③④

C．①③④

D．①②④

答案　C

例4

　利用外源基因在受体细胞中表达，可生产人类所需要的产品。

下列选项中能说明目的基因完成了在受体细胞中表达的是（　　）

A．棉花二倍体细胞中检测到细菌的抗虫基因

B．大肠杆菌中检测到人胰岛素基因及其mRNA

C．山羊乳腺细胞中检测到人生长激素DNA序列

D．酵母菌细胞中提取到人干扰素蛋白

答案　D

解析　基因表达的产物是蛋白质，因此，只有在受体细胞中检测或提取到了相应蛋白质才能证明目的基因在受体细胞中完成了表达，A、C项只能说明完成了目的基因的导入，B项只能说明完成了目的基因的导入和目的基因的转录过程。

名师点拨

　关注基因工程操作过程的四个易误点

（1）限制酶剪切目的基因与质粒的次数不同：

获取一个目的基因需限制酶剪切2次，共产生4个黏性末端或平末端，切割质粒一般只需要限制酶剪切1次，产生2个黏性末端或平末端，因为质粒是环状DNA分子，而目的基因在DNA分子链上。

（2）切割目的基因和载体并非只能用同一种限制酶：

如果用两种不同限制酶切割后形成的黏性末端相同时，在DNA连接酶的作用下，目的基因与载体也可以连接起来。

（3）目的基因的插入点不是随意的：

基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入到启动子与终止子之间的部位。

（4）基因工程操作过程中只有第三步“将目的基因导入受体细胞”没有碱基互补配对现象。

1．将目的基因导入玉米茎尖分生区细胞和小鼠受精卵，应分别采用的方法是（　　）

A．显微注射技术　农杆菌转化法

B．基因枪法　花粉管通道法

C．农杆菌转化法　显微注射技术

D．基因枪法　显微注射技术

答案　D

解析　玉米是单子叶植物，对单子叶植物来说，常用的方法是基因枪法；对于动物细胞来说，常用的方法是显微注射技术。

2．（2017·福建厦门一中期中）下列关于目的基因导入微生物细胞的叙述中，不正确的是（　　）

A．常用原核生物作为受体细胞，是因为原核生物繁殖快，且多为单细胞，遗传物质相对较少等

B．受体细胞所处的一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态称为感受态

C．感受态细胞吸收DNA分子需要适宜的温度和酸碱度

D．常用生理盐水处理细胞，使其处于感受态

答案　D

解析　因为原核生物繁殖快，且多为单细胞，遗传物质相对较少，故常用原核生物作为受体细胞；Ca2＋处理后细胞处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态称为感受态，感受态细胞吸收DNA分子需要适宜的温度和酸碱度；常用Ca2＋处理细胞，使其处于感受态。

3．（2017·广东潮南实验学校高二月考）在基因诊断技术中，所用的探针DNA分子中必须存在一定量的荧光分子或放射性同位素，后者的作用是（　　）

A．为形成杂交DNA分子提供能量

B．引起探针DNA产生不定向的基因突变

C．作为探针DNA的示踪元素

D．增加探针DNA的相对分子质量

答案　C

解析　DNA探针是指用放射性同位素或荧光分子等标记的DNA分子，放射性同位素的作用是作为探针DNA的示踪元素，C项正确。

4．检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因的常用方法是（　　）

A．DNA分子杂交技术B．荧光分子标记技术

C．放射性同位素标记技术D．显微注射技术

答案　A

解析　检测目的基因常采用DNA分子杂交技术，即在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素进行标记，以此作为基因探针，并使基因探针与基因组DNA杂交，若显示出杂交带，则表明目的基因已插入染色体DNA中。

5．（2016·海南，31）基因工程又称为DNA重组技术，回答相关问题：

（1）在基因工程中，获取目的基因主要有两大途径，即___________和从____________中分离。

（2）利用某植物的成熟叶片为材料，同时构建cDNA文库和基因组文库，两个文库相比，cDNA文库中含有的基因数目比基因组文库中的少，其原因是________________________

________________________________________________________________________

________________________________________________________________________。

（3）在基因表达载体中，启动子是______________识别并结合的部位。

若采用原核生物作为基因表达载体的受体细胞，最常用的原核生物是____________。

（4）将目的基因通过基因枪法导入植物细胞时，常用的携带目的基因的金属颗粒有________和________颗粒。

答案　

（1）人工合成　生物材料

（2）cDNA文库中只含有叶细胞已转录（或已表达）的基因，而基因组文库中含有该植物的全部基因

（3）RNA聚合酶　大肠杆菌（或细菌）

（4）金粉　钨粉

解析　

（1）获取目的基因主要有两大途径，即人工合成和从自然界已有的物种中分离。

（2）在植物的成熟叶片中基因选择性表达，因此由所有RNA反转录形成的cDNA文库中只含有叶细胞已转录（或已表达）的基因，而基因组文库中含有该植物的全部基因。

（3）在基因表达载体中，启动子是RNA聚合酶识别并结合的部位。

采用原核生物作为基因表达载体的受体细胞，由于易于培养，最常选用大肠杆菌（或细菌）。

（4）将目的基因通过基因枪法导入植物细胞时，常用的携带目的基因的金属颗粒有金粉和钨粉颗粒。

[对点训练]

题组一　将目的基因导入受体细胞

1．（2017·河南南阳新野一中高二下学期期中）1982年，世界上第一例体型比普通小鼠大1.8倍的转基因“超级小鼠”培育成功。

下列相关叙述正确的是（　　）

A．将含有目的基因的DNA直接注入到小鼠体内

B．该“超级小鼠”的培育利用到了显微注射技术

C．采用的受体细胞是雌性动物的卵细胞

D．目的基因导入受体细胞前不用提纯

答案　B

解析　转基因“超级小鼠”的培育过程为：

首先将含有目的基因的表达载体提纯，然后利用显微注射技术将含目的基因的表达载体导入受精卵，经胚胎早期培养一段时间后，再移植到雌性动物的输卵管或子宫内，使其发育成为具有新性状的动物。

2．基因工程中因受体细胞不同，目的基因导入的方法也不同，下列叙述不正确的是（　　）

A．将目的基因导入棉花细胞内常用花粉管通道法

B．将目的基因导入老鼠细胞内常用显微注射技术

C．将目的基因导入大肠杆菌内常用感受态细胞转化法

D．将目的基因导入小麦细胞内常用农杆菌转化法

答案　D

解析　小麦是单子叶植物，其受伤后不能分泌酚类物质，农杆菌对它没有感染能力。

3．在基因工程技术中，可能需要用到CaCl2处理的环节是（　　）

A．目的基因的提取和导入

B．目的基因与载体结合

C．将目的基因导入受体细胞

D．目的基因的检测与鉴定

答案　C

解析　将目的基因导入原核生物受体细胞时，首先用Ca2＋处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后在一定条件下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化。

题组二　目的基因的检测与鉴定

4．常用DNA进行亲子鉴定。

其原理是从被测试者的血液或口腔上皮细胞中提取DNA，用限制性核酸内切酶将DNA样本切成特定的小片段，放进凝胶内，用电泳推动DNA小片段分离，再使用特别的DNA探针去寻找特定的目的基因。

DNA探针与相应的基因凝聚在一起，然后，利用特别的染料在X光下，便会显示由DNA探针凝聚在一起的黑色条码。

被测试者这种肉眼可见的条码很特别，一半与母亲的吻合，一半与父亲的吻合。

反复几次该过程，每一种探针用于寻找DNA的不同部位形成独特的条码，用几组不同的探针，可得到超过99.9%的父系分辨率。

请问，DNA探针是指（　　）

A．某一个完整的目的基因

B．目的基因片段的特定DNA

C．与目的基因相同的特定双链DNA

D．与目的基因互补的特定单链DNA

答案　D

解析　根据题干信息“用限制性核酸内切酶将DNA样本切成特定的小片段，放进凝胶内，用电泳推动DNA小片段分离，再使用特别的DNA探针去寻找特定的目的基因”可知，DNA探针不是一个完整的目的基因，A项错误；DNA探针不是目的基因片段的特定DNA，B项错误；“每一种探针用于寻找DNA的不同部位形成独特的条码”，指的是根据碱基互补配对原则形成的杂交带，所以DNA探针是与目的基因互补的特定单链DNA，C项错误，D项正确。

5．在检测抗虫基因是否成功转入棉花基因组的方法中，不属于分子水平的是（　　）

A．观察害虫吃棉叶是否死亡

B．检测目的基因片段与DNA探针能否形成杂交带

C．检测目的基因转录形成的mRNA与DNA探针能否形成杂交带

D．检测目的基因表达产物蛋白质能否与特定抗体形成杂交带

答案　A

解析　A项属于个体生物学水平的鉴定；B、C两项为分子水平的检测，分别利用DNA分子杂交技术、分子杂交技术，观察目的基因及目的基因转录形成的mRNA能否与DNA探针进行杂交形成杂交带；D项也为分子水平检测内容，利用抗原—抗体杂交的原理，检测基因表达产物能否与特定抗体形成杂交带。

题组三　基因工程基本程序整体分析

6．下图表示一项重要生物技术的关键步骤，X是获得外源基因并能够表达的细胞。

下列有关说法不正确的是（　　）

A．X是能合成胰岛素的细菌细胞

B．质粒是细胞核或拟核外能自主复制的小型环状DNA

C．目的基因与质粒的重组只需要DNA连接酶

D．该细菌的性状被定向改造

答案　C

解析　分析题意和图示可知：

重组质粒导入的是细菌细胞，所以X是能合成胰岛素的细菌细胞，A正确；质粒是一种常用载体，是在细胞核或拟核外能自主复制的小型环状DNA，B正确；基因与载体的重组需要限制性核酸内切酶和DNA连接酶，C错误；基因工程的特点是能够定向改造生物的性状，D正确。

7．下列有关基因工程的叙述，正确的是（　　）

A．基因工程所用的工具酶是限制酶、DNA聚合酶

B．所有的限制酶都只能识别同一种特定的核苷酸序列

C．选用细菌作为重组质粒的受体细胞是因为细菌繁殖快

D．只要目的基因进入了受体细胞就能成功地实现表达

答案　C

解析　基因工程所用的工具酶是限制酶、DNA连接酶，A错误；限制酶能够识别某种特定的核苷酸序列，并在特定位点切割磷酸二酯键，B错误；细菌作为受体细胞原因有多个，如细胞体积小、繁殖周期短、遗传物质少等，C正确；目的基因进入受体细胞中，由于操作失误和不可预测的干扰等，并不是所有受体细胞都能按照预先设计的方案进行重组和表达，真正能有效表达的只是一小部分，D错误。

8．基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。

在基因操作的基本步骤中，无需进行碱基互补配对的步骤是（　　）

A．人工合成目的基因

B．基因表达载体的构建

C．将目的基因导入受体细胞

D．目的基因的检测与鉴定

答案　C

解析　将目的基因导入受体细胞过程中没有进行碱基互补配对。

[综合强化]

9．番茄叶片受害虫的损伤后，叶肉细胞迅速合成蛋白酶抑制剂，抑制害虫的消化作用。

人们尝试将番茄的蛋白酶抑制剂基因导入玉米，以对付猖獗的玉米螟。

下图为培育转基因抗虫玉米的流程图，下列描述正确的是（　　）

A．用限制性核酸内切酶切割番茄的DNA得到的产物就是蛋白酶抑制剂基因

B．用氯化钙处理玉米受体细胞，有利于含目的基因的重组质粒导入

C．重组Ti质粒应有RNA聚合酶识别和结合的部位，以启动蛋白酶抑制剂基因的转录

D．若将目的基因导入玉米花粉细胞，通过花药离体培养可获得稳定遗传的转基因玉米

答案　C

解析　目的基因是用限制性核酸内切酶将DNA酶切后得到的，需筛选；氯化钙用于处理细菌细胞；基因成功表达的前提是能转录和翻译，转录时需RNA聚合酶识别转录的起点才能启动；花药离体培养得到的是玉米的单倍体，需再用秋水仙素处理单倍体，使染色体加倍才能得到稳定遗传的转基因玉米。

10．下图表示细胞膜上乙酰胆碱（一种神经递质）受体基因的克隆技术操作过程，下列相关分析正确的是（　　）

A．获得该mRNA的最佳材料是受精卵

B．构建基因表达载体最可能使用的载体是大肠杆菌

C．完成过程①②必不可少的酶分别是反转录酶、DNA聚合酶

D．探针筛选的目的是淘汰被感染的细菌，获得未被感染的细菌

答案　C

解析　该受体基因在神经细胞中表达，获得该mRNA的最佳材料是神经细胞；构建基因表达载体最可能使用的载体是质粒；探针筛选的目的是检测是否存在cDNA。

11．蓝藻拟核DNA上有控制叶绿素合成的chlL基因。

某科学家通过构建该种生物缺失chlL基因的变异株细胞，以研究chlL基因对叶绿素合成的控制，技术路线如下图所示，下列相关叙述错误的是（　　）

A．①②过程应使用不同的限制性核酸内切酶

B．①②过程都要使用DNA连接酶

C．终止密码子是基因表达载体的重要组成部分

D．若操作成功，可用含红霉素的培养基筛选出该变异株

答案　C

解析　限制性核酸内切酶有特异性，①②过程要切割的DNA序列不同，故应使用不同的限制性核酸内切酶；DNA连接酶的作用是连接被切开的磷酸二酯键，使chlL基因、红霉素抗性基因与质粒结合；基因表达载体由目的基因、启动子、终止子、标记基因组成，终止密码子是mRNA上密码子的一种，表示一次翻译的结束；变异株中chlL基因被重组基因替换，重组基因中有红霉素抗性基因，故可用含红霉素的培养基筛选出该变异株。

12．（2015·全国Ⅰ，40节选）HIV属于反转录病毒，是艾滋病的病原体。

回答下列问题：

（1）用基因工程方法制备HIV的某蛋白（目的蛋白）时，可先提取HIV中的________，以其作为模板，在______________的作用下合成________，获取该目的蛋白的基因，构建重组表达载体，随后导入受体细胞。

（2）从受体细胞中分离纯化出目的蛋白，该蛋白作为抗原注入机体后，刺激机体产生的可与此蛋白结合的相应分泌蛋白是________，该分泌蛋白可用于检测受试者血清中的HIV，检测的原理是______________________________________________________________________。

答案　

（1）RNA　反转录酶　cDNA（或DNA）　

（2）抗体　抗原抗体特异性结合

解析　

（1）HIV是RNA病毒，其核酸是单链RNA，而在基因工程中构建目的基因表达载体时，载体一般用的是质粒，为双链DNA，故先用反转录酶催化HIV的RNA反转录为DNA分子再进行基因工程操作。

（2）本题涉及到了免疫学方面知识，抗原进入机体后可以产生特异性免疫反应，产生相应的抗体，抗体与抗原特异性结合。

13．如图是获得转基因抗虫棉的技术流程示意图。

请回答：

（1）A→B利用的技术称为________，其中②过程需要热稳定的_______________酶才能完成。

（2）图中将目的基因导入棉花细胞需要经过③过程，该过程为构建______________，其目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在且可以遗传给下一代，并能表达。

（3）上述流程示意图中，将目的基因导入棉花细胞所采用的方法是________________法，该方法一般__________（填“适宜”或“不适宜”）用于将目的基因导入单子叶植物。

（4）欲确定抗虫基因在G体内是否表达，在个体水平上需要做__________实验。

如果抗虫基因导入成功，且与某条染色体的DNA