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翻译论文培养温度对淡水栅藻生长及油脂积累特性的影响

生物资源技术102（2011）3098—3102

培养温度对淡水栅藻生长及油脂积累特性的影响

李鑫，胡洪营*，张玉平

（清华大学环境科学与工程学院，环境模拟与污染控制国家重点联合实验室，中国北京100084）

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摘要：

微藻细胞中的油脂是一种很有前途的生物柴油生产原料。

培养温度对栅藻LX1的生长及油脂积累特性的影响已经有所研究，栅藻LX1能够在较宽的温度范围（10~30℃）内生长，它的生长活化能是49.3kJ﹒moL-1，微藻生物量生产和产油脂的最佳温度为20℃。

培养15天之后，批次生长的微藻生物质量可达313.3g﹒（gP）-1，其中含脂质为112g﹒（gP）-1，TAGs为14.7g﹒（gP）-1。

多不饱和脂肪酸的含量随着培养温度的升高而降低，在10℃与20℃活性氧（ROS）水平含量比高温下ROS水平高。

最重要的是培养温度、ROS水平、微藻生长速率和单位脂肪含量呈正相关。

2010ElsevierLtd保留所有权利。

关键词：

淡水微藻栅藻培养温度生长活性油脂积累

1.简介

由于人类社会活动快速发展以及化石燃料的过度消耗，能源危机已成了21世纪最大的挑战。

据估计地球上石油和天然气分别会在40与64年之后消耗殆尽（VasudevanandBriggs,2008）。

同时伴随着化石燃料的过度消耗大量的温室气体被释放出，加剧全球变暖（Bruce,2008）。

因此，可持续发展和绿色能源需要被用来解决化石燃料的枯竭。

生物柴油是一种可再生的，无毒的，可生物降解的和CO2-中性能源（MiaoandWu,2006）。

因此，在最近几年，它在为开发可再生能源和环境友好的能源形式上成为一个热门话题（Groometal.,2008）。

相对于传统的油料作物，微藻具有高的光合效率和脂肪含量，因此成为生产生物柴油更具吸引力的原料，微藻中油脂/生物量（干重）约为传统农作物的15~300倍（Chisti,2008）。

此外，微藻还具有吸收氮和磷（KhanandYoshida,2008;Lietal.,2010b）和固定CO2（Fernándezetal.,2008）等功能，在未来的生物能源生产和污水处理相耦合过程中，微藻技术会成为一种很有前途的技术（Lietal.,2010c）。

因此，以微藻为原料生产生物柴油的技术越来越多的引起了全世界的关注。

然而较高的生物柴油生产成本是其商业化应用的主要瓶颈（BehzadandFarid,2007）。

为了相对减少生物柴油的生产总成本，微藻单位油脂含量增加是实现这一目的的有效方法之一。

最近，在这一领域的很多研究工作都已经完成。

当能源（光照）与碳源（CO2）充足时，限制养分是提高微藻细胞油脂积累的一种最有效的因素（Courchesneetal.,2009），但是在低浓度营养成分、低微藻生长力的情况下高油肪含量与高油脂生产率是相矛盾的（Lietal.,2010a）。

向异养的微藻生长环境中添加有机碳既可以增加脂含量又可以提高微藻生物量（Hanetal.,2006），但是它增加了额外的原料成本，能源转换效率也很低（Lietal.,2010c）。

其他因素对微藻细胞油脂积累的影响也进行了研究，如光条件（Solovchenkoetal.,2008）、三价铁离子（Liuetal.,2008）、温度（Convertietal.,2009）、乙基-2-甲基乙酰乙酸酯（EMA，抗藻类化感物质）（Lietal.,2010d）等。

在上面提到的所有因素中，温度对于藻细胞的生长和代谢​​活动是一个非常敏感的因素，同时在实际操作中它也是一个易于控制的因素。

在Converti等人（2009）研究中，通过增加培养温度从20升至25℃，绿球藻的油脂含量增加了一倍（从7.9％到14.9％），从而可以证明，控制温度可能是提高油脂含量的一个有效途径。

淡水栅藻LX1在生物柴油生产和污水处理系统中相耦合的作用机制已被课题组研究出来。

本文中进行了新的研究：

温度对栅藻LX1的生长及油脂积累特性的影响研究，并且第一次将活性氧（ROS）的水平研究用来解释在不同的培养温度下藻细胞油脂含量的变化。

2.方法

2.1藻种

栅藻LX1（编号CGMCC3036中国普通微生物菌种保藏中心），由课题组在前期研究中分离出来（Lietal.,2010a）。

2.2实验装置

微藻培养在含有200mL改良的50%BG11营养盐的锥形瓶（容量500mL）中。

培养液中用NO3-N作为氮源，浓度为15mg·L-1；PO4-P为磷源，浓度为1.5mg·L-1。

培养液中其他元素均与50%BG11营养盐相同。

最初的藻细胞密度大约是6.5×105个·mL-1。

培养条件：

光照强度55~60μmoL光子·m-2·s-1，光暗比14h：

10h，相对湿度75%。

培养温度设置四个梯度，分别是10、20、25、30℃，并且每一梯度设置3个平行试验。

2.3分析方法

2.3.1微藻生长特性

每天测定藻细胞密度OD650（藻细胞在650nm处的光密度吸收）。

藻细胞密度D（个·mL-1）和OD650的关系（Lietal.,2010a）：

Li等人（2010c）发表的一篇文章中指出了用悬浮固体（SS）的方法可以测定藻细胞的生物量干重。

Logistic模型是被用来描述微藻的生长速率关系的模型（Lietal.,2010）：

其中，N：

t（h）时刻的藻细胞密度（个·mL-1）；K：

承载量（种群所能达到的最大密度）（个·mL-1）；a：

Logistic常数，表示曲线对原点的相对位置；r：

种群的内禀比生长速率（d-1）；Rmax：

微藻最大增长速率（个·（mL·d）-1）。

Arrhenius模型是被用来研究微藻特定生长速率与培养温度的关系的模型（公式（4））。

式中，μ为对数增长期的比生长速率（d-1），它可以通过公式（5）计算出来；A为Arrhenius常数（d-1）；Ea为生长活化能（kJ·moL-1）；R为通用气体常数（J·（moL·K）-1）；T为热力学温度（K）。

其中t1和t2分别为对数增长期的开始和结束时间，Nt1和Nt2分别为t1和t2时刻对应的藻细胞密度（个·mL-1）。

公式（4）可以转化为线性公式（6）。

在特定的温度范围时，

与1/T是线性关系，回归直线的斜率等于-Ea/R并且可以计算得到。

2.3.2油脂积累特性

Li等人（2010a）已成功将总油脂（干重）的测定方法研究描述出来。

Li等人（2010d）在总油脂测定之后，干燥的油脂会溶解在0.4mL的异丙酮中，这样三酰基甘油的量就可以估算出来。

对于脂肪酸的分析，向大约20mg的冻干微藻粉末样品中添加2mL含6%KOH的甲醇溶液（甲醇：

水=4：

1）和0.2mL氯仿，超声波处理20分钟，然后在80℃恒温水浴下皂化2小时。

向皂化后的微藻样品中加入1mL饱和NaCL溶液，使用HCl将溶液的PH值调整至小于1，然后向样品中添加2mL提取液（氯仿：

正己烷=1：

4），将萃取的液体通过氮气流吹至干性。

然后将0.5mL含有HCl的甲醇溶液（2moL·L-1）添加到样品中，在有氮气流的70℃水浴下酯化大约20分钟。

之后向样品中加入1mL饱和的NaCl溶液，再加入2mL石油醚用于萃取。

然后这些被萃取的脂肪酸甲酯可以通过GC-MS（QP2010,SHIMADZU）设备进行分析，设备中配备FID使用HP-5MS毛细管柱（30m×0.25mm内径×0.25μm膜厚度），温度从80升到280℃的速率是6℃·min-1。

通过比较色谱分析图示与NIST文库图示就可以确定脂肪酸甲酯。

2.3.3流式细胞仪分析的活性氧（ROS）水平

流式细胞仪可以通过使用2’,7’-二氯乙酰乙酸（DCFH-DA）（Fluka公司）测定温度对ROS的水平影响。

DCFH-DA是一种检测细胞内ROS生成的通用指标因素，ROS在微藻细胞中促进DCFH氧化生成2’,7’-二氯（DCF）。

Hong等人（2008）研究了微藻细胞与活性氧ROS水平的关系。

这种流式细胞仪在FACSCalibur（美国BectonDickinson公司）的FL-1参数上进行过测量，DCF荧光（波长530nm）可以被氩离子激光（激发波长488nm）激活。

2.3.4差异分析

通过采用SPSS（13.0版本）可以检验出配对实验组样品与平行独立样品的显著差异。

3结果与讨论

3.1温度对栅藻LX1生长特性的影响

栅藻LX1在不同的培养温度下的生长曲线如图1所示。

栅藻LX1在培养15天后藻细胞进入稳定期，最大藻细胞密度没有显著差异（p>0.12）。

但20、25、30℃组的最大藻细胞密度要高于10℃组（p<0.001）。

10℃组的栅藻LX1在培养的开始阶段生长非常缓慢，然而经过3天的适应后微藻的生长速率开始增加，最终具有与较高温度组同样的最大藻细胞密度，从而可以证明栅藻LX1具有在寒冷地区生长的能力。

通过对图1线性回归分析（Logistic模型）（Lietal.,2010a），栅藻LX1的K、Rmax、r数值都可以获得，如表1。

K（Rmax）与培养温度（从10到30℃）是一种正相关的关系，但是在不同温度下这种关系没有显著差异（K（P>0.12），Rmax（p>0.09））。

r表示物种在没有限制下的理想的生长环境（如足够的食物和空间，没有捕食者或疾病）下的比生长速率。

栅藻LX1的r数值在不同的温度下没有很显著差异（p>0.05）,并且这种微藻的增长潜力也是相同的。

通过公式（5）可以得到栅藻LX1在不同培养温度下对数生长期的特定生长速率μ，如图2。

在10到25℃，μ与培养温度是正相关的关系，当温度升至30℃后，μ数值开始下降，在25℃有最大的μ（0.76d-1）。

通过线性分析回归公式（6），在10~25℃栅藻LX1的生长速率μ符合Arrhenius模型。

下面是Arrhenius参数：

Arrhenius常数A=exp（19.7）d-1，生长活化能Ea=49.3kJ·mol-1（p<0.01）。

因此，在温度范围10~25℃Arrhenius模型可计算为如下公式（7）：

培养温度对微生物生长的影响可能依物种而异。

Converti等人（2009）与Chen等人（2008）通过研究得出：

绿球藻和菱形藻生长的最佳培养温度分别为20和23℃。

同时，Westerhoff等人通过研究栅藻与小球藻，得出比生长率常数（μ=0.03h-1）。

并在27到39℃温度范围内没有变化，但是在42℃下微藻就不能生长（Westerhoffetal.,2010）。

我们在研究时，发现栅藻LX1在25℃有最大的比增长速率μ（图2）；在30℃下有最大的物种承载量K与增长速率Rmax（表1）。

有意义的是在10和30℃培养温度之间，栅藻LX1适应周围环境后生长良好，从而可以证明栅藻LX1是一种能适应较宽温度范围（10~30℃）生长的可开发的微藻。

3.2温度对栅藻LX1油脂积累特性的影响。

栅藻LX1在不同温度下培养15天后每微藻生物量的油脂含量（％，g/g，干重）和单位油脂中脂TAGs含量（％，g/g，干重）如图2所示。

在25℃（正常的培养温度）下单位油脂含量是25％（w/w）。

在较低温度10与20℃，单位油脂含量分别是31％（w/w）与35％（w/w），很明显（独立样品实验组）高于在25℃时的油脂含量25％（p<0.02），同样高于42％（p<0.05）。

在高温30℃，单位油脂含量为22％（w/w），但与25℃时的油脂含量（p>0.15）区别不是很明显。

单位油脂中TAGs含量与培养温度有一种正相关关系，尤其在20℃以上更显著，但是这种关系趋势在p>0.06时就不明显了。

栅藻LX1在不同培养温度时干重条件下的微藻生物量和产油脂率如表2。

在实验结果中，培养温度为10℃的微藻生物总量最低，并且由于低微藻生物总量，油脂含量也比较低。

培养温度分别是20、25、30℃的微藻生物量与油脂含量基本相同，虽然很明显的是25℃与30℃培养的微藻油脂含量分别增加了31％与50％（p<0.05），但相比较20℃培养的微藻油脂含量最高。

因此最适合栅藻LX1生长与提高生物总量与油脂含量的培养温度是20℃。

Converti等人（2009）发现高温（20到25℃）有助于绿球藻细胞油脂的积累。

Chen等人（2008）研究发现培养温度对微藻生物中油脂含量是有影响的，并且随着温度的降低油脂含量也减少。

本文中研究的温度对栅藻LX1生物量中油脂含量的影响不同于上面所研究的结果。

在我们的研究中，低温能够诱导栅藻LX1中油脂的积累并且导致生成一个高的油脂含量。

然而随着温度的降低单位油脂含量也在减少，这和Chen等人（2008）的研究结果相同。

除了温度影响外，其他的很多方法或因素也被用来研究提高微藻中的油脂含量。

Li等人通过研究栅藻LX1生长在N和P营养缺陷的环境下，获得了高的单位油脂含量，但是由于较低的生物总量，油脂总量也较低（Lietal.,2010a）。

在Li等人的另一篇研究中，微量的乙基-2-甲基乙酰乙酸酯（EMA）可以促使栅藻LX1细胞中油脂的积累，并且生物总量不受影响，因此既可以获得高的单位油脂含量，也可以获得高的油脂总量（Lietal.,2010d）。

温度对于微藻的生长和代谢活动是一个敏感的参数，在废水处理和微藻生物柴油生产相耦合系统中可通过调节温度提高油脂含量，并且优点是：

原来的废水混合物成分不需要被改变或添加的其他化学品，操作简单而且生态无污染。

不同的培养温度下，栅藻LX1的脂肪酸组成成分如图3所示。

当培养温度升高时，饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸的比例增加，多不饱和脂肪酸的比例下降。

在相对较低温度（10℃）或者相对较高温度（30℃）时，栅藻LX1细胞中脂肪酸几乎100％是由长链（C16~C18）组成；在中间温度范围（20与25℃），脂肪酸（C22）的链长更长。

饱和脂肪酸可影响生物柴油的特性。

Hu等人（2008）研究发现使用饱和脂肪酸生产生物柴油具有良好的氧化稳定性并且可生成高碳的十六烷，但是低温效果不好（发生凝胶现象）。

以多不饱和脂肪酸为原料生产生物柴油具有好的抗低温效果，但是易被氧化。

在我们的研究中，相对较低的培养温度（≤25℃），栅藻LX1的脂肪酸主要是由多不饱和脂肪酸组成的，在高的培养温度（30℃）的脂肪酸的主要成分为饱和脂肪酸与单不饱和脂肪酸。

栅藻LX1脂肪酸能使细胞更好的适应不同培养温度下的环境。

还可以使以微藻为原料制成的生物柴油根据不同温度下获得的微藻而适应冷或暖的区域。

3.3温度对栅藻LX1活性氧ROS水平的影响

栅藻LX1在不同的培养温度下，藻细胞中的荧光强度如图4所示。

在25或者30℃，大多数微藻细胞的荧光强度（Fmain，与ROS水平相关）是相同的（1.5×102AU）。

当培养温度降至20℃时，Fmain（4×102AU）增加了一点，在最低温度（10℃），Fmain（30×102AU）增长了很明显。

这表明较低的培养温度可以诱导栅藻LX1细胞中ROS的积累。

据我们所知，以前微藻细胞中油脂的积累并没有与ROS水平相联系过。

栅藻LX1的培养温度、活性氧（ROS）水平、生长率和单位油脂含量如图5所示。

ROS众所周知有着压力反应信号转导通路中的作用，当微藻暴露于不同的环境压力下，ROS就会在细胞中积累，如果超过了细胞承受ROS积累的范围就会导致细胞死亡（Hongetal.,2008）。

低培养温度下栅藻LX1细胞中ROS水平会上升，表明了低温对栅藻LX1是一特定的环境压力因素。

因此，在这种环境因素下，栅藻LX1的生长速率降低，但单位油脂含量却升高（图2）。

油脂含量的增加正好证明了环境作为一种有效的调节因素可促使微藻细胞中油脂的积累（Huetal.,2008）。

然而，微藻细胞的高生长率与高油脂含量是相矛盾的，它们很难同时兼备，这个矛盾问题也是微藻产油研究领域的一个难题（Sheehanetal.,1998）。

4结论

栅藻LX1能够在一个较宽的温度范围（10~30℃）内生长，并且它的生长活化能Ea是49.3KJ·moL-1。

栅藻LX1生长及产油的最适培养温度为20℃。

其能够生产获得313.3g生物量·（gP）-1,其中112g油脂·（gP）-1和14.7gTAGs·（gP）-1。

低温（10与20℃）能够提高微藻细胞中ROS水平，并且最重要是在低培养温度下的高油脂含量与高ROS水平是正相关的。

感谢

这项研究是由中国国家自然科学基金杰出青年学者（NO.50825801）的支持。

参考文献：

〔1〕Behzadi,S.,Farid,M.M.,2007.Review:

examiningtheuseofdifferentfeedstockfortheproductionofbiodiesel.Asia-Pac.J.Chem.Eng.2,480–486.

〔2〕Bruce,E.R.,2008.Opportunitiesforrenewablebioenergyusingmicroorganisms.Biotechnol.Bioeng.100

（2）,203–212.

〔3〕Chen,G.Q.,Jiang,Y.,Chen,F.,2008.VariationoflipidclasscompositioninNitzschialaevisasaresponsetogrowthtemperaturechange.FoodChem.109,88–94.

〔4〕Chisti,Y.,2008.Biodieselfrommicroalgaebeatsbioethanol.TrendsBiotechnol.26（3）,126–131.

〔5〕Converti,A.,Casazza,A.A.,Ortiz,E.Y.,etal.,2009.EffectoftemperatureandnitrogenconcentrationonthegrowthandlipidcontentofNannochloropsisoculataandChlorellavulgarisforbiodieselproduction.Chem.Eng.Process.48,1146–1151.

〔6〕Courchesne,N.M.D.,Parisien,A.,Wang,B.,etal.,2009.Enhancementoflipidproductionusingbiochemical,geneticandtranscriptionfactorengineeringapproaches.J.Biotechnol.141,31–41.

〔7〕Fernández,A.V.,Vargas,G.,Alarcón,N.,etal.,2008.Evaluationofmarinealgaeasasourceofbiogasinatwo-stagedanaerobicreactorsystem.BiomassBioeneg.32,338–344.

〔8〕Groom,M.J.,Gray,E.M.,Townsend,P.A.,2008.Biofuelsandbiodiversity:

principlesforcreatingbetterpoliciesforbiofuelproduction.Conserv.Biol.22（3）,602–609.

〔9〕Han,X.,Miao,X.L.,Wu,Q.Y.,2006.HighqualitybiodieselproductionfromamicroalgaChlorellaprotothecoidesbyheterotrophicgrowthinfermenters.J.Biotechnol.126,499–507.

〔10〕Hong,Y.,Hu,H.Y.,Li,F.M.,2008.Physiologicalandbiochemicaleffectsofallelochemicalethyl2-methylacetoacetate（EMA）oncyanobacteriumMicrocystisaeruginosa.Ecotoxicol.Environ.Saf.71,527–534.

〔11〕Hu,Q.,Sommerfeld,M.,Jarvis,E.,etal.,2008.Microalgaltriacylglycerolsasfeedstocksforbiofuelproduction:

perspectivesandadvances.PlantJ.54,621–639.

〔12〕Khan,M.,Yoshida,N.,2008.EffectofL-glutamicacidonthegrowthandammoniumremovalfromammoniumsolutionandnaturalwastewaterbyChlorellavulgarisNTM06.Bioresour.Technol.99,575–582.

〔13〕Li,X.,Hu,H.Y.,Gan,K.,etal.,2010a.Effectsofdifferentnitrogenandphosphorusconcentrationsonthegrowth,nutrientuptake,andlipidaccumulationofafreshwatermicroalgaScenedesmussp.Bioresour.Technol.101,5494–5500.

〔14〕Li,X.,Hu,H.Y.,Gan,K.,etal.,2010b.GrowthandnutrientsremovalpropertiesofafreshwatermicroalgaScenedesmussp.LX1underdifferentkindsofnitrogensources.Ecol.Eng36,379–381.

〔15〕Li,X.,Hu,H.Y.,Yang,J.,2010c.LipidAccumulationandnutrientsremovalpropertiesinsecondaryeffluentofanewly-isolatedfreshwatermicroalgaScenedesmussp.LX1.NewBiotechnol27

（1）,59–63.

〔16〕Li,X.,Hu,H.Y.,Yang,J.,etal.,2010d.EnhancementEffectofEthyl-2-methylacetoacetateonTriacylglycerolsProductionbyaFreshwaterMicroalga,Scenede