一氧化碳系统在百令胶囊水提物对抗STZ损伤大鼠胰岛细胞的作用.docx

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一氧化碳系统在百令胶囊水提物对抗STZ损伤大鼠胰岛细胞的作用

血红素加氧酶/一氧化碳系统在百令胶囊水提物对抗STZ损伤大鼠胰岛细胞的作用

（作者:

___________单位:

___________邮编:

___________）

作者：

兰海涛，郑倩，王亚平，刘红

【摘要】目的观察百令胶囊（CorbrinCapsule,CC）水提物对胰岛细胞的保护作用及其机制与血红素加氧酶/一氧化碳系统的关系。

方法Wistar大鼠腹腔注射链脲佐菌素（Streptozotocin,STZ）建立Ⅰ型糖尿病模型，腹腔注射CC水提物和（或）HO的特异抑制剂锌原卟啉（ZincprotoporphrinIX,ZnPP），分糖尿病组（DM）、正常对照组（NC）、CC水提物组、CC水提物组+ZnPP，28d后检测血糖，血清胰岛素分泌量、CO含量、HO-1活性。

离体培养乳鼠的胰岛细胞，检测STZ、CC以及ZnPP作用后细胞活性、细胞培养上清液中胰岛素的基础、高糖刺激分泌量，细胞HO-1以及CO的变化，同时设立正常对照组。

结果经CC水提物作用后，STZ糖尿病大鼠血清中血糖降低，胰岛素增加，CO、HO-1水平升高（P0.01）。

ZnPP作用后血清HO-1水平降低，CO含量减少。

STZ与胰岛细胞孵育20h后与ZnPP加入CC组，均表现出细胞活性降低，基础和高糖刺激胰岛素分泌减少;细胞HO-1活性降低，CO生成减少（P0.01）。

与CC共同孵育细胞活性显著升高，胰岛素基础和高糖分泌量增多，HO-1活性水平和CO生成量显著提高（P0.01）。

结论通过实验证实CC水提物对STZ损伤的胰岛细胞有保护作用，机制与增加HO-1活性，CO生成增多有关。

【关键词】虫草菌丝;糖尿病模型;胰岛;血红素加氧酶;一氧化碳

　　Abstract：

ObjectiveToobservetheprotectiveeffectofwaterextractofCorbrinsCapsule（CC）onpancreaticisletcellinjuryinducedbystreptozocin（STZ）mechanisms.MethodsThepancreasesoftheratswereremovedtocollectisletcells.ThecellswereincubatedwithSTZwith/orCCorZnPP.Cellactivity,insulinsecretion,HO-1activity,COcontentweredetected.Type1diabeticratsmodelwasinducedbyinjectionoftheSTZ,andwaterextractofCCand/orZnPPweregivenbyinjectionfortwentyeightdays.Bloodglucoselevelwasmeasuredbyglucometer.HO-1activity,COcontentweredetected.ResultsWaterextractofCCobviouslyimprovedtheisletcellactivitydamagedbySTZ,andtheamountofbasicinsulinsecretionandstimulatedbyhighglucosewereimproved（P0.05）.ThecontentofCOandactivityofCcosynthaseinsupernatantwereobviouslyincreasedintheSTZdamagedgroupandintheserumofdiabeticrats,andthereweresignificantdifferencesbetweentheCCgroupsandSTZdamagedgroups.ActivitiesofHO-1andCOweredecreasedinSTZdamagedgroupanddiabeticratsascomparedtonormalcontrolgroup,andthewaterextractofCCcouldsignificantlyelevatedtheabrivitiesofhotaualCoascomparedtoSTZdamagedgroupanddiabeticrats.ConclusionWaterextractofCCplaysaprotectiveroleinthepancreaticisletcelldamageinducedbySTZ,andtheprotectivemechanismmaybecorrelatedwithelevationofHO-1-1activityandgenerationofCO.

　　Keywords：

Cordycepssinensis;Isletsoflangerhan;Type1diabets;Cytoprotction;Hemeoxygenase-1;Carbonmonoxide

　　冬虫夏草是一种名贵强壮滋补中药，为麦角菌科真菌冬虫夏草寄生在蝙蝠蛾科昆虫上的子座及其幼虫尸体的复合体。

其味甘、性温，归肺、肾经，有补虚填精、保肺益肾、止血化痰等作用。

现代药理学证明其有抗氧化、调节免疫、抗瘤、抑菌、抗病毒的作用。

但由于天然虫草有严格的寄生性和特殊的生长地理环境，药缺价高，限制了天然虫草的使用。

人工虫草是人工发酵培养得到的菌丝，其成分和药理作用与天然虫草基本一致。

已有研究证实人工虫草对中枢神经系统、呼吸系统、心血管系统及免疫系统有一定作用。

近年来其对糖尿病的防治作用受到了广泛关注，有报道认为它可以降低血糖的浓度[1]，提高肝纤维化大鼠的胰岛细胞基础胰岛素分泌量[2]，但具体机制的研究并不深入。

CO是体内发现的继NO之后又一气体信号分子，血红加氧酶分解血红素生成。

HenningssonR等[3]认为HO表达增多，CO生成增加，可促进胰岛素和胰高血糖素分泌，提出HO/CO系统对胰岛具有明显的保护功能。

百令胶囊是人工虫草制剂，其成分为冬虫夏草菌菌丝体，本实验通过建立I型糖尿病模型和离体胰岛细胞培养，采用百令胶囊水提物探讨虫草菌丝对STZ损伤的胰岛细胞的分泌功能是否具有保护作用以及其机制与HO/CO系统的关系。

　　1材料和仪器

　　出生1～3d的Wistar大鼠20只;体质量200～220g的健康雄性Wistar大鼠50只，均由川北医学院实验动物中心提供。

百令胶囊购自杭州中美华东制药有限公司（批号：

061140），百令胶囊水提物由川北医学院药物研究所提取，使其含量按生药计算为1g/ml，胰岛素放免检测试剂盒为华西生物制剂公司产品。

胶原酶V型、STZ均为美国Sigma公司产品。

倒置相差显微镜（olympus，日本），全自动酶标仪（BIO-RAD，2550型，美国），紫外分光仪（RF-540，日本岛津），台式冷冻高速离心机（日立himacCF-15型，日本）。

　　2方法

　　2.1胰岛细胞分离与培养出生1～3d的Wistar大鼠20只，仰卧固定，腹部常规消毒，无菌取出胰腺，置4℃Hanks液中清洗3次，剪碎胰腺，放于含有V型胶原酶溶液（0.5mg/ml）的锥形瓶中，再置于38℃的恒温水浴摇床中振荡30min后（摇床转速200r/min），用Hanks液终止消化，取悬浮细胞离心（500r/min，5min），经用Hanks液清洗离心后，再加入含15%胎牛血清的RPMI-1640培养液，制成细胞悬液，37℃,5%CO2孵育箱内培养24h后，去除成纤维细胞，收集胰岛细胞，制成新的细胞悬液，调节细胞浓度至1×105/ml，置96孔板培养，每孔内加入细胞悬液200μl。

随机分组：

①正常对照组;②STZ组;③STZ+CC组;④STZ+CC组+ZnPP组。

每组平行孔为6孔。

正常对照组以含15%胎牛血清的RPMI-1640培养液培养，在STZ组和STZ+CC、STZ+CC组+ZnPP组以1.0mmol/L的STZ作用20h后，再分别加入浓度CC20mmol/L或（和）10μmol/L的ZnPP继续培养30h，进行各项检测。

　　2.2四唑盐比色法（MTT法）检测细胞活性将处理完毕的各组细胞用MTT法进行检测。

检测方法如下：

将各组细胞离心（500r/min，5min），小心吸取细胞培养上清液，于细胞中加200μl的培养液（不含小牛血清）和5mg/ml的MTT　20μl，放入CO2孵育箱培养4h后，再离心（1000r/min，×10min），弃上清，加入二甲基亚砜200μl，振荡5min，在全自动酶标仪上比色，测出每孔光密度值（OD值）进行比较，检测波长为600nm，OD值越高表明细胞活性就越强。

　　2.3细胞培养上清液胰岛素分泌量测定各组待测标本细胞培养上清液，用放免法检测胰岛素的基础分泌量;各组细胞中加入含16.7mmol/L的葡萄糖培养液培养2h，离心提取上清液，按放免法进行高糖刺激胰岛素分泌量检测。

　　2.4STZ糖尿病模型的建立和分组体质量200～220g的健康雄性Wistar大鼠50只，随机分为糖尿病组组（DM）40只和正常对照组（NC）10只。

禁食12h后DM组一次性腹腔注STZ65mg/kg（用0.1mol/LpH4.5的缓冲液配成2%的溶液），3d后选择尿糖强阳性，血糖≥12.7mmol/L者为DM大鼠。

NC组注射等体积柠檬酸缓冲液，将成模的DM大鼠随机分4组，DM组、CC组和CC+ZnPP组。

CC组给予CC水提物5mmol/kg，1次/d鼠腹腔注射;CC+ZnPP组给予CC水提物同时腹腔注射ZnPP0.5mmol/kg;DM组腹腔注射等体积柠檬酸溶液。

各组大鼠28d后处死。

　　2.5糖尿病大鼠血清标本以0.5%戊巴比妥钠1ml/kg体质量腹腔注射，待动物麻醉后，体外心脏采血5ml，血液凝固后，取血清1～2ml，4℃冰箱保存待检。

　　2.6糖尿病大鼠血清胰岛素水平的测定放免法测定血清胰岛素水平。

　　2.7细胞培养液和血清HO-1活性测定方法参照文献[4]取血清20μl,加入2mmol/L正铁血红素40μl，4.5mmol/LNADPH40μl,0.1mol/lKH2PO4（ph7.4）1.8ml及正常标准的肝组织匀浆上清夜20μl,混匀后，37°C振荡水浴避光反应2h，置冰上终止反应。

用分光光度计在463nm和530nm双波长测吸光度值，并计算出反应生成的胆红素生成量。

胆红素摩尔吸光系数为40nm/cm，以生成的胆红素量表示HO-1活性，单位为pmol/（mg·h）,上清液蛋白含量测定采用考马斯亮蓝法。

　　2.8细胞培养液和血清CO含量测定以血清中碳氧血红蛋白（COHb）含量作为内源性CO产生的指标。

各组均加入氯红血红素10μmol/L作为底物，孵育24h,实验结束前1h加入牛血红蛋白50μmol/L,570nm检测COHb消光数。

　　2.9统计学处理实验结果以±s表示,α=0.05，采用方差分析。

整个统计资料采用SAS软件处理完成。

　　3结果

　　3.1胰岛细胞活性的变化表1结果表明STZ组与正常对照组比较光密度值OD值降低，表明细胞活性下降（P0.01）;损伤后加入CC共同孵育可使OD值较损伤组均有提高，具有显著意义。

ZnPP对于STZ单独作用的细胞活性降低，具有统计学意义。

ZnPP加入CC组后，细胞活性下降，与未加ZnPP的CC组比较具有意义。

　　3.2细胞培养上清液基础和高糖刺激胰岛素分泌量的测定结果见表1。

加入STZ作用后胰岛细胞基础分泌胰岛素量和葡萄糖刺激分泌量显著下降（P0.01），在损伤的基础上与CC或ZnPP共同培养30h后，测试培养液中胰岛素分泌量和葡萄糖刺激分泌量，ZnPP对于STZ单独作用胰岛素分泌下降，具有统计学意义。

CC作用后，细胞的分泌功能增强，基础和高糖刺激的胰岛素分泌增多，有显著意义。

加入ZnPP于CC组后分别与未加ZnPP组比较胰岛素分泌量显著减少（P0.01）。

表1细胞活性、基础胰岛素分泌量和葡萄糖刺激胰岛素分泌量

　　与正常对照组比较，﹡﹡P0.01;与STZ组比较，△△P0.01;与STZ+CC组比较，※※P0.01

　　3.3胰岛细胞培养上清液HO-1活性、CO含量的检测结果见表2。

加入STZ作用后胰岛细胞HO-1活性降低，CO的生成减少，与正常组相比有统计学意义（P0.01）。

加入CC后，HO-1的活性增强，CO生成显著增多，与STZ组相比有统计学意义（P0.01）。

CC组加入ZnPP后，HO-1的活性减弱，CO含量降低，分别与CC组比较有差别（P0.05）。

　表2细胞HO-1活性、CO含量与正常对照组比较，P0.01;与STZ组比较，△△P0.01;与STZ+CC组比较，※※P0.05;n=6

　　3.4糖尿病模型血糖、血清胰岛素水平测定从表3看出糖尿病模型组血糖显著升高，胰岛素水平降低，与正常组相比P0.01，注射不同浓度CC水提物后，与模型组相比血糖降低，胰岛素水平升高，有统计学意义。

表3糖尿病大鼠血糖、血清胰岛素水平与NC组比较，﹡﹡P0.01,﹡P0.05;与DM组比较，△P0.05，△△P0.01;n=10

　　3.5糖尿病模型血清HO-1活性、CO含量的检测结果见表4，糖尿病大鼠HO-1活性降低，CO的生成减少，与正常组相比有统计学意义（P0.01），腹腔注射CC后，HO-1的活性增强，CO生成显著增多，有统计学意义。

ZnPP腹腔注射后，HO-1的活性减弱，CO含量降低，与CC组比较有差别（P0.05）。

表4血清HO-1活性、CO含量的检测与NC组比较，﹡P0.05;与DM组比较，△P0.05;与CC组，△△P0.05;n=10

　　4讨论

　　STZ能破坏胰岛细胞诱发实验性糖尿病，作为实验模型制备的工具药已被广泛应用。

本实验结果也表明STZ作用大鼠后血糖升高，血清胰岛素以及细胞培养液中基础分泌量和葡萄糖刺激胰岛素的分泌量明显降低。

STZ诱导的大鼠糖尿病模型是模拟人I型糖尿病的典型动物模型，作为含亚硝基的STZ破坏胰岛细胞的机制可能与产生NO和自由基，DNA受损、NAD的耗竭、阻止活性Ca2+转运以及CaM依赖性蛋白激酶丧失等机制有关，本实验结果显示STZ作用的离体胰岛细胞上清液中HO-1活性降低，从而引起CO减少，糖尿病模型中HO-1活性降低，从而引起CO减少。

AbrahamNG[5]等在对STZ致高血糖的大鼠内皮细胞的研究中发现HO-1/CO系统的抑制，证实STZ损伤胰岛细胞与HO/CO系统活性降低有关。

　　实验观察到经腹腔注射CC水提物的糖尿病大鼠血清中血糖浓度降低，胰岛素水平显著提高。

CC水提物可保护胰岛细胞，提高细胞活性，增强胰岛细胞分泌功能，表明CC可保护STZ破坏的胰岛细胞功能。

实验结果显示在血清和细胞上清液中HO-1活性增强，CO生成增多，证实CC保护机制与可提高HO-1/CO系统的活性有关。

Tobiasch等[6]也认为HO-1可保护胰岛细胞功能，其机制与降低凋亡有关，而GuntherL等[7]认为HO-1的保护作用是通过CO来介导的，CO可增强胰岛的存活率来增强功能。

　　HO是催化血红素降解的起始酶和限速酶，能催化血红素最终生成等分子的胆绿素/胆红素、一氧化碳、游离铁。

胆绿素/胆红素是一种强力的抗氧化剂，CO既是重要的气体信使分子，又可以抑制NO的活性，减轻其损害;游离铁可以刺激细胞表达铁蛋白,隔离游离铁,达到保护细胞的作用。

HO有三种同工酶：

HO-1、HO-2、HO-3，分别是3种不同基因编码的产物。

HO-2为结构性酶，不易被诱导。

HO-3与HO-2在结构上十分相似，但活性较弱，其中HO-3仅在大鼠脑组织中发现，HO-2广泛存在于胰岛的A、B、D、PP细胞中。

HO-1（32KD）是诱导酶,可被多种因素诱导,如氧化应激、热休克、紫外线辐射、缺血再灌注、重金属、炎性细胞因子（如IL-1、TNF-a）、NO、血红素等。

　　ZnPP是HO-1酶活性的特异性抑制剂，ZnPP剂量小于10μmol/L时，对NOS活性、可溶性鸟苷酸环化酶活性无影响，因此实验采用的剂量为10μmol/L。

ZnPP加入STZ作用胰岛细胞以及在糖尿病模型中，HO-1、CO低于未处理组，存在统计学意义，而且在离体细胞中，细胞活性降低，胰岛素的分泌受抑制，在糖尿病模型中，血糖升高和血清胰岛素下降，结果证明ZnPP反转了CC对细胞的保护作用，提示COHO-1/CO系统参与了胰岛细胞的保护作用。

而CO保护机制可能和提高激活鸟苷酸环化酶活性，提高cAMP水平;抗氧自由基，抑制NOS的活性，减少NO的生成，以及抑制P38分裂素激活蛋白酶途径等多个途径相关，其具体机制是本课题组下步研究工作。

　　通过离体和在体实验可以证实HO-1/CO系统活性的增强是CC水提物保护胰岛细胞功能的途径。

但是实验仅初步证实CC可以通过提高HO-1/CO系统作用改善STZ对胰岛细胞损伤的影响，从而有效的降低糖尿病的发生以及提高对糖尿病的防治作用。

其具体机制的阐明将有助于为临床提供可靠的实验研究资料，本研究为糖尿病的中药治疗提供了广泛的研发领域。

【参考文献】

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　　[2]张霞,刘玉侃,郑倩，等.虫草菌丝对实验性肝纤维化大鼠胰岛β细胞功能的影响[J].中华肝脏病杂志,2003,11

（2）:

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　　[3]HenningssonR,AlmP,EkstromP,etal.Hemeoxygenaseandcarbonmonoxide:

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　　[4]MotterliniR,ForestiR,IntagliettaM,etal.NO-mediatedactivationofhemeoxygenase-endogenouscytoprotectionagainstoxidativestresstoendothelium[J].AmJPhysiol,1996,39:

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　　[7]GuntherL,BerberatPO.Carbonmonoxideprotectspancreaticbeta-cellsfromapoptosisandimprovesisletfunction/survivalaftertransplantation[J].Diabetes.2002,51（4）:

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