《发酵工程实验》教案米曲霉的培养及蛋白质分析.docx
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《发酵工程实验》教案米曲霉的培养及蛋白质分析
米曲霉固态发酵生产中性蛋白酶
1、实验目的及要求：
通过固态三角瓶培养曲霉，使学生掌握固态培养微生物原理和技术，并掌握蛋白酶活性的分析方法：
2、实验原理、过程和方法
2.1原理
固态培养微生物，是我国传统发酵工业的特色之一，具有悠久的历史。
在黄酒、白酒、酱油、酱类等领域广泛应用。
固态培养方法：
（Solidstatecultivation）：
主要有散曲法和块曲法。
部分黄酒用曲，红曲及酱油米曲霉培养属散曲法；而黄酒用曲及白酒用曲一般采用块曲法。
固态制曲设备：
实验室主要采用三角瓶或茄子瓶培养；种子扩大培养可将蒸熟的物料置于竹匾中，接种后在温度和湿度都有控制的培养室内进行培养；工业上目前主要是厚层通风池制曲，转式圆盘式固态培养装置正在试验推广之中；日本、台湾已大规模化，机械化。
固态培养微生物：
主要用于霉菌的培养，但细菌和酵母菌也可采用此法。
其主要优点是节能，无废水污染。
单位体积的生产效率较高。
我国广泛使用的厚层通风固态法培养法，空气一般不经过除菌处理，培养环境也无法做到严格无菌。
故染菌问题未得到根本解决。
本实验所用的米曲霉的生长特性及菌落特征：
米曲霉（Aspergillus）属曲霉菌（Aspergillus）。
菌落初为白色，黄色，继而变为黄褐色至淡绿褐色，反面无色。
2.2过程
米曲霉菌种的纯化（单菌落分离），制成斜面，将斜面菌种接入250ml三角瓶培养成种曲，再将种曲扩大培养（500ml）三角瓶。
米曲霉培养物经水溶液萃取，制得粗酶制剂，取粗酶制剂进行蛋白酶活力的测定。
2.3方法
米曲霉的培养
本实验分为斜面种子培养及三角瓶培养两个阶段。
三角瓶培养物在工厂常作为一级种子。
试管斜面培养基：
豆饼浸出汁：
100克豆饼粉，加水500ml，浸泡4小时，煮沸3-4小时，纱布自然过滤，取液，调整至5波美度。
每100ml豆汁中加入可溶性淀粉2克，磷酸二氢钾0.1克，硫酸镁0.05克，硫酸铵0.05克，琼脂2克，自然pH。
或采用马铃薯培养基：
马铃薯200g葡萄糖20g琼脂15-20g加水至1000mlpH自然。
三角瓶培养基制备：
米曲霉的培养其1：
麸皮80g，面粉（或小麦粉）20g，水80ml；
2、豆粕粉10g，麸皮90g，水110ml；
装料厚度：
1cm左右；
灭菌：
120℃，30-60min；
接种及米曲霉的培养条件：
米曲霉固态培养主要控制条件：
温度、湿度，装料量，基质水分含量。
固态培养前，原料的蒸熟及灭菌是同时进行的。
实验室一般是在高压灭菌锅中进行；但在工厂，则原料的煮熟和灭菌与发酵分别在不同的设备中进行。
这点与液态发酵是不同的。
28-30℃，培养20小时后，菌丝应布满培养基，第一次摇瓶，使培养基松散，每隔8小时检查一次，并摇瓶。
培养时间一般为48-70小时。
3、实验仪器、设备和材料
恒温培养箱或固态培养室，负压式超净工作台，显微镜，计数器，水浴锅，分光光度计，试管，茄子瓶，平板及500ml三角瓶等。
米曲霉菌种（酱油生产用米曲霉）
4、实验分析项目和方法
米曲霉孢子计数（显微镜观察）；通常每克曲（干基）孢子数可达100亿以上；
米曲霉蛋白酶活力的测定方法简介：
（1）称取充分研细的成曲5g，加入100ml水，40℃水浴间断搅拌1hr，过滤，滤液用适当的缓冲液稀释一定的倍数。
（2）样品的测定：
取试管3支，编号，每管加入样品稀释液1ml，40℃水浴中预热2分钟，再加入同样预热的酪蛋白1ml，精确保温10分钟，立即加入0.4mol/L的三氯乙酸2ml，以终止反应，继续保温20分钟，使残余蛋白质沉淀后离心或过滤。
然后另取三支试管，编号，每管内加入滤液1ml，再加0.4mol/L的碳酸钠5ml,已稀释的福林试剂1ml，摇匀，40℃保温发色20分钟，用分光光度计测定OD值（波长660nm）。
（3）计算：
在40℃下，每分钟水解酪蛋白产生1ug酪氨酸，定义为一个酶活力单位。
样品蛋白酶活力单位（干基）=
A：
由样品测定OD值，查标准曲线得相当的酪氨酸微克数；
4：
4ml反应液取出1ml测定；
n:
稀释倍数；
10:
反应十分钟；
W：
样品水份含量（%）
5、实验报告内容和数据处理
两种培养基米曲霉培养过程中蛋白酶活性变化规律。
6、实验结果和讨论
实验时间：
1周
组织形式：
每班分为6组，每组学生5人，做3×2个三角瓶。
每12小时取样一个，分析测定蛋白酶活性。
比较两种培养基的米曲霉培养物的蛋白酶的活性的高低。
附录1：
固态转轴发酵设备的结构与工作原理
重要说明：
在第一次操作本设备之前请仔细阅读本操作说明书；
设备必须可靠接地；
湿度仪最高使用温度不大于80℃，防水浸；
发酵开始前准备工作（设定为发酵条件，进行DO电极斜率标定、pH电极零点标定）；
发酵结束数据存盘；
关闭总电源前，请将控制器返回主菜单，然后按Ctrl+F6关闭控制程序，然后关电源。
设备运行结束，勿忘关闭自来水阀、空气源、蒸汽发生器。
开始控温前，必须先打开注水开关，直至排水口无气泡为止。
最高工作压力不大于0.20Mp，进罐空气压力应不大于0.20Mp！
最高消毒温度126℃；
公用工程要求：
蒸汽：
0.2~0.4Mpa;水源：
0.1~0.3Mpa
1技术指标
1.1概述
具有温度、转速、空气流量、湿度显示和控制功能。
1.2指标
1.2.1温度：
自动控制范围：
冷却水温+5~50℃（±0.2℃）；显示范围：
0~150℃
1.2.2搅拌转速：
变频调速范围0~30（±5）rpm，时间比例控制正反转
1.2.3空气流量：
显示控制范围0—50L/min
1.2.4湿度控制：
50~100%
1.2.5罐体总体积50L，设计压力3.0kg/c㎡，最高工作压力1.5kg/c㎡，设计工作温度131℃
1.2.6灭菌方法：
手动控制蒸汽消毒灭菌
1.2.7主机功率：
3KW（最大），单相220V
1.28气源要求：
2~4kg/c㎡
1.2.9蒸汽要求：
2~4kg/c㎡
2管路说明
该流程图中空气管路阀门标号为“AXX”，蒸汽管路阀门标号为“SXX”，冷却水管路阀门标号为“WXX”，冷凝水管路阀门标号为“VXX”，电磁阀标号为“CXX”，物料管路阀门标号为“PXX”，冷冻水管路标号为“CWX”，其它气体管路标号为“NXX”。
2.1空气及其净化
来自空压机的压缩空气经净化器（外接减压稳压器、除水、除尘、空气予过滤器）进入发酵罐空气总管，空气阀A01、空气流量计、阀A02、空气过滤器，阀A03到达加湿器内或经电磁阀C02进入发酵罐底部分布器，尾气经阀VT1排出，本管路具有计量、净化作用。
注：
空气流量显示的流量是以过滤器前的压力下的流量，不是标准状态下的流量。
如须测量控制湿度则开VT11关VT1。
2.2蒸汽
2.2.1蒸汽进夹套
蒸汽经阀S01进夹套（上进），经阀V01排出冷凝水。
蒸汽对培养基预热。
（固体物料传热效率低，可以取消本步操作）
2.2.2蒸汽进反应器
蒸汽经阀A02、空气过滤器、阀A03、电磁阀C02进入罐内，由排气口空气阀VT1排出。
蒸汽对过滤器及空气管线消毒
2.3自来水
2.3.1自来水进夹套
当电磁阀大开时，自来水经多功能阀、阀W01进入反应器夹套（下进），由夹套上口、电磁阀C01排出；当电磁阀关闭时，夹套水经W02进入电热器、循环泵、单相阀进入夹套（下口），通过夹套水的循环，将加热器的热能带入夹套，通过夹套的换热加热发酵液。
特别提示：
温度自动前必须对夹套注水。
2.3.2自来水进排气冷凝器
自来水经阀W03进入排气冷凝器，对发酵尾气进行冷却尽可能减少培养基的水分蒸发
2.4冷冻水（选配）（消毒后降温应优先采用自来水）
冷冻水经切换阀T02（关T01）进入自来水管线、经切换阀T04（关T03）返回了冷冻水回路。
2.8纯氧管线（选配）
纯氧管线：
纯氧进入流量计、电磁阀C03、切断阀A21进入空气过滤器。
纯氧流量调节：
开C03、A21后调节流量计的调节手柄。
2.9空气流量检测与控制：
空气热质量流量计：
与空气玻璃转子流量计并联安装且在热质量流量计前后安装切断阀。
热质量流量计内通道必须保持干燥无尘，因此只有在发酵过程中才开质量流量计的前后切断阀A11、A12,发酵结束后应及时关闭A11、A12。
2.10补氨水管线
氨水经电磁阀C04、切断阀A31、补料针进入发酵罐，电磁阀由控制器控制
3实罐灭菌操作
3.1准备
3.1.1盖紧罐盖上各种盖帽，旋紧罐盖上压紧螺栓。
3.2培养基预热
3.2.1准备工作
预先启动蒸汽发生器及空气压缩机
将控制器中的温度控制设定为手动
开排气阀VT1，关闭其它阀门
湿度仪不耐高温和不可水浸，消毒后必须关闭排气旁通阀VT11。
3.2.2开排气阀VT1，开夹套冷凝水阀V01排夹套水，关闭其它阀门。
3.2.3启动反应器搅拌马达。
调转速20~30Rpm
3.2.4蒸汽进夹套（固体物料可以取消本操作）缓缓开夹套蒸汽阀S01蒸汽夹套（注意：
此时有轻微爆炸声属正常，如声音过响，则开阀的速度应减慢）。
待排水总口排出蒸汽时调节冷凝水阀V01，控制蒸汽排出量以有少量蒸气冒出即可。
并控制夹套内压力不超过0.2Mpa。
当培养基预热至98℃时，进入实罐灭菌操作。
在培养基温度在80~90℃时可以适当的减慢升温速度，在本温度的区域内可以杀死大部分的微生物。
3.3实罐灭菌
3.3.1蒸汽进过滤器：
微开过滤器上排冷凝水阀V02，开过滤器前蒸汽阀S02，微加湿器底阀排冷凝水阀V03，缓缓开切断阀A03，蒸汽经过滤器进入反应器，同时在控制器F5“空气”子画面中设定控制方式为“手动”并按F3输入“-100”后按“ENTER”，电磁阀C02在消毒过程中始终是开着的，以保正空气管线消毒彻底。
当冷凝水阀V02、V03出口冷凝水很少时，调节冷凝水阀V02、V03以有少量蒸汽排出为宜。
当排气口有蒸汽排出或罐温达到100℃两分钟后，关闭排气阀VT1。
调节切断阀A03和蒸汽阀S02，维持过滤器前蒸汽压力为0.12~0.16Mpa，同时必须保证切断阀有一定开度，不得关死。
3.3.2当达到预定温度或罐压，开排气阀VT1至有少量蒸气排出，关紧或微开夹套蒸汽阀S01，根据罐压或温度的变化趋势，及时调节蒸汽阀S02、S03。
阀门调节宜微调应避免大幅度开关。
当反应罐罐压或罐温维持在预定的范围内开始计时。
3.3.3（略）
3.3.4保温阶段应旋松接种口盖至有少量蒸气冒出
3.3.5移种管线消毒（适用于多级发酵）
在保温过程中开移种管线阀P03及受种阀前排水阀V04，保温结束前关闭V03。
3.4灭菌完成及降温（先开后关，后开先关）
3.4.1保温结束首先旋紧接种口盖。
3.4.2关紧冷凝水阀V03，关紧过滤器前蒸汽阀，全开空气阀A01、A02，用空气吹过滤器，当过滤器冷凝水阀V02排尽冷凝水后就可以关闭。
3.4.3关夹套蒸汽阀S01、冷凝水阀V01，开夹套进水阀W01和循环管线切断阀W02。
在控制器中将温度控制方式设定为“自动”并对温度进行设定，发酵罐进行自动降温。
按下搅拌开关，设定搅拌转速并“自动”控制。
3.4.5在降温过程中，始终监视罐压，严禁压力掉零。
当温度达到工艺要求时，调节搅拌转速、空气流量、罐压、标定溶氧电极斜率及校正pH电极的零点。
注意：
1.如另配冷冻水系统消毒后降温请选用自来水降温（控制箱左侧板N2开关拨向“W”）
2.消毒过程中不得开湿度仪前切断阀VT11。
湿度仪最好使用温度为80℃
4发酵操作
准备
4.2接种
4.2.1摇瓶倒种：
调节进气量至0.2VVM，开排气阀VT1至罐压接近零（不得大于0.02Mpa），予先旋松接种口，在接种口处放好火焰圈并点燃（在火焰圈中放置少量的棉花可以助燃提高火焰的高度），打开接种口，倒入种子，然后旋紧接种盖，立即调高罐压。
4.2.3发酵初始化：
在控制器的发酵罐状态画面输入“发酵批号”，再按“就绪”或“开始”并“确认”，发酵数据才能自动保存。
设定发酵过程参数及适宜的控制模式
4.3湿度控制
4.3.1关阀A03，将经灭菌消毒的补水瓶及输液管放置底座上，用硅胶管将补水瓶上的呼吸过滤器与空气精过滤器阀V02连通。
4.3.2旋下加湿器补料口上闷头，用酒精棉球对补料口内橡胶塞外表面消毒，然后将针头插入并穿透密封盖，并用补料针上的螺母锁紧。
4.3.3开输液管上的弹簧夹，缓缓开阀V02将无菌水压入加湿器内。
关阀V02，拔出针头，盖紧补料口上闷头。
4.3.4湿度控制：
在控制器空气子画面上设定：
F1：
空气50~100（（说明：
这里的“空气”实际上是“湿度”，单位L/min应为%），F2：
控制方式为“自动”。
开阀A03。
当湿度低于设定值时电磁阀自动关闭，空气进入加湿器。
当湿度高于设定值时，电磁阀自动打开，大量空气经过电磁阀直接进入发酵罐。
4.3.5开排气阀VT11，关VT01
4.4取样
4.4.1取样器：
开罐盖N9口上闷头，将取样管垂直于管盖插入罐内（建议取样时关闭搅拌），抽出取样管，盖紧上闷头。
4.5发酵开始前设定发酵参数（详见第五章）
4.6放料放料是通过开罐盖放料
4.7发酵结束
发酵结束必须在控制器在控制器的发酵罐状态画面按“正在发酵”并“确认”，如果需要发酵数据归档请按“可以归档”并确认。
发酵数据将自动整理并保存。
发酵结束后应关紧VT11
4.8搅拌正反转设定：
在时间比例控制器拨动数字盘设定正转时间、反转时间，拨动数字盘上端的时间单位;M-分钟。
S-秒。
设定完成后开时间比例控制器右侧的控制开关（向右开，向左关），任何一次设定后必须重新开关“控制开关”
附录2：
蛋白酶活力的测定方法
1原理
根据福林试剂（磷钼酸与磷钨酸混合物），在碱性情况下极不稳定，可被酞类化合物还原而呈蓝色反应（钼蓝和钨蓝的混合物），由于蛋白质分子中含有酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸及苯丙氦酸等），它使蛋白质或其水解产物也呈这个反应，于是就可利用这个原理来测定蛋白酶活力的强弱，即以酪蛋白为作用底物，在一定pH与温度下，同酶液反应，经一定时间后，加入三氯醋酸，以终止酶反应，并使残余的酪蛋白质沉淀，同水解产物分开，经过滤后取滤液（即含蛋白水解产物的三氯醋酸液）。
用碳酸钠碱化，再加入福林试剂使之发色，用分光光度计或光电比色计测定。
蓝色反应的强弱，同三氯醋酸中蛋白水解产物的多少成正比而水解产物的量又是同酶活力成正比例关系。
因此，根据蓝色反应的强弱就可推测蛋白酶的活力。
2试剂
2.1福林试剂
于2000ml磨口回流装置内加入钨酸钠（Na2WO4·2H2O）100g，钨酸钠（NaMoO4·2H2O）25g，水700ml，85%磷酸50m1，浓盐酸1000ml，文火回流10h．加入硫酸锂（Li2SO4）150g，蒸溜水50m1，混匀取去冷凝器，加入几滴液体溴，再煮沸l5min，以驱逐残溴及除去颜色，溶液应呈黄色而非绿色。
若溶液仍有绿色，需再滴加溴液。
再煮沸除去之。
冷却后，定溶至1000ml。
细菌漏斗4~5号过滤，置于棕色瓶中保存。
此溶液使用时加2倍蒸馏水稀释，即成稀释的福林试剂。
2.20.4mol/L三氯醋酸（TCA）溶液
称取三氯醋酸65.4g，定容至1000ml。
2.30.4mol/L碳酸钠溶液
称取无水碳酸钠（Na2CO3）42.4g，定容至1000m1。
2.40.05mol/LpH2.5乳酸-乳酸钠缓冲液
A液：
称取10.6g80-90%乳酸加蒸馏水定容至1000ml。
B液：
称取16克70%乳酸钠加蒸馏水定容至1000ml。
取A液16ml与B液1ml稀释1倍即成0.05mol/LpH2.5乳酸-乳酸钠缓冲液。
2.52%酪蛋白溶液
称取干酪素2g加入0.1mol/L氢氧化钠20ml在水浴中加热使溶解（必要时用小火加热煮沸），然后用pH2.5乳酸-乳酸钠缓冲液定容至1000mI即成。
配制后应及时使用或放入冰箱内保存。
否则极易繁殖细菌，引起变质。
配制酪蛋白溶液定容时，若泡沫过多，则可加1~2滴酒精消泡。
3350酸性蛋白酶酪蛋白溶液的配制，应加弄乳酸2~3滴湿润。
2.6100μg/m1酪氨酸溶液
精确称取在l05℃烘箱中烘至恒重的酪氨酸0.1g，逐步加入0.1mol/L盐酸（HCl）使溶解，加蒸溜水定容至100m1，其浓度为1000μg/m1。
再吸取此液10ml以蒸馏水定容至100ml即配成100μg/m1酪氨酸镕液．此溶液配成后也应及时使用或放入冰箱内保存，以免繁殖细菌而变质。
3操作步骤
3.1标准曲线的绘制
（1）按表配制各种不同浓度的酪氨酸溶液
试剂（ml）
管号
1
2
3
4
5
6
蒸馏水
10
8
6
4
2
0
100μg/m1酪氨酸
0
2
4
6
8
10
酪氨酸最终浓度（μg/m1）
0
20
40
60
80
100
（2）测定步骤
另取6支试管按上表编号分别吸取不同浓度的酪氨酸1ml，各加入0.4mo1/L碳酸钠5m1，再加入已稀释的福林试剂1m1。
摇匀置于水浴锅中，40℃保温发色20min，在于波长660nm处测定吸光度。
一般测3次，取平均值．
以吸光度为纵座标。
酪氨酸的浓度为横座标，绘制成标准曲线。
3.2酶液的制备
准确称取蛋白酶固态发酵的湿曲2g，用10~20ml蒸馏水，30℃浸提半小时，用滤纸过滤。
将滤液稀释一定倍数（使其测定光密度在0.2~0.4范围内为宜）。
3.3测定
取四支试管，分别加入1ml稀释酶液，其中一支为空白管，三支为平行试验管。
置入40℃水浴中预热3~5min，在三支平行试验管中分别加入1ml2%酪蛋白溶液，准确计时保温10min。
立即加入2ml0.4M三氯乙酸溶液，l5min后用滤纸过滤。
分别吸取1ml清液，加5ml0.4M碳酸钠溶液，最后加入1ml福林-酚试剂，摇匀，于40℃水浴中显色20min。
空白管中先加入2ml0.4M三氯乙酸溶液，再加lml2%酪蛋白溶液，15min后用滤纸过滤。
以下操作与平行试验管相同。
见空白管为对照，在680纳米波长下测光密度，取其平均值。
4计算
蛋白酶活力单位定义：
在40℃，pH2.5下，每分钟水解酪蛋白释放1微克酪氨酸的酶量定义为1个蛋白酶单位。
式中K：
标准曲线中O·D值为1所相当的酪氨酸的微克数；OD：
平行试验管的平均光密度；4：
试管中反应液总体积（毫升）；10：
反应10分钟；N：
稀释倍数；W：
曲的称取量（克）
5说明
（1）对于同一台分光光度计与同一批福林-酚试剂，其工作曲线K值可以沿用，当另配福林-酚试剂时，工作曲线应重作。
（2）当用不同产品的酪蛋白对同一蛋白酶测定时，其结果会有差异，故蛋白酶活力表示时应注明所用酪蛋白的生产厂。
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