离子交换色谱法标准操作程序.docx
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离子交换色谱法标准操作程序
离子交换色谱（IonExchangeChromatography,IEC）以离子交换树脂作为固定相5树脂上具有固定离子基团及可交换的离子基团。
当流动相带着组分电离生成的离子通过固定相时，组分离子与树脂上可交换的离子基团进行可逆变换。
溶液pH低于C产品组分等电点PI时，组分带正电荷，可以跟固定相上的阳离子交换，吸附在固定相上，用盐浓度梯度洗脫时，组分按照表面正电荷从少到多的顺序被洗脱下来。
紫外检测器检测280nm处的响应值，根据组分峰面积计算纯度。
范围:
适用于本公司生产出的C产品的中间产品、原液、成品及稳定性样品的电荷异质性分析。
职责:
操作人员：
＞严格按照此规程要求进行操作。
岗位主管：
＞起草文件，并确保操作程序的准确性、技术内容的完整性及文件的及时更新；
＞监督操作规程是否与实际过程一致，资源是否满足要求；
＞培训，确保此操作规程的正确实施。
程序:
1术语解释
无
2试剂和材料
〉色谱柱：
阳离子交换色谱柱5例如MabPac™SCX-10,4.0x250mm,10pm（Thermo）〉试剂：
N-（2■乙酰胺基）・2■氨基乙磺酸（ACES,分析纯），氯化钠（NaCl,色谱纯），盐酸（HC1,分析纯），磷酸氢二钠（Na2HPO4,色谱纯），磷酸（H?
PO4,色谱纯），纯化水（自制）＞滤膜：
孔径为0.45pm或以下
注：
所用试剂可被同等或更高级别的试剂替代，但应证明适用：
所有材料遵循厂家有效期。
3仪器设备
＞液相色谱仪:
例如Agilent1260
〉天平，精确到mg
＞pH计
＞溶剂过滤装置
＞离心机（转速10000rpm以上）
＞移液器（10・1000pl）
4溶液配制
4.1流动相配制
4.1.1流动相A：
20mMACES,pH6.20
称取ACES3.64g,加入1000ml水搅拌至完全溶解，HC1调pH6.20+0.02；
经0.45pm滤膜过滤，室温保存，有效期3天，使用前超声脫气15mino
4.1.2流动相B：
20mMACES,500mMNaCl,pH6.20
称取ACES3.64g,NaCl29.22g加入1000ml水搅拌至完全溶解，HC1调pH6.20+0.02：
经0.45pm滤膜过滤，室温保存，有效期3天，使用前超声脫气15min<>注：
流动相调pH时，确认溶液温度在23〜27・C。
4.1.3色谱柱保存液：
20mMNazHPOMHsPCU,pH6.5
称量2.84gNa2HPO4加入1000ml纯水搅拌溶解，用HsPCh调节pH值为6.50+0.02,使用0.45滤膜过滤后，2-8°C低温保存，有效期1个月。
4.2样品溶液配制
4.2.1参比品溶液配制
取规定的参比品，根据蛋白浓度标示量，用制剂缓冲液稀释至5.0mg/ml,转移至（J样品瓶。
例：
参比品CDS20180209,蛋口标示量为22.0mg/ml,稀释4.4倍（40pl参比品+136pl制剂缓冲液）5稀释后浓度为5.0mg/mlo
4.2.2供试品溶液配制
稀释方法同421。
对于浑浊的样品，需经0.22pm的滤膜过滤，或者10000rpm离心lOmin,取上清液至样品瓶。
5检测方法
5・1色谱系统准备
5.1.1打开sealwash（清洗液：
10%异丙醇冰溶液）；更换洗针瓶（清洗液：
水）；
5.1.2以检测方法的流动相起始比例（流动相A：
4%,流动相B：
96%）,l.Oml/min的流速平衡至基线平稳5至少20mino
5.1.3尖键色谱参数和洗脱梯度
色谱参数
流速
1.0ml/min
色谱柱温度
40°C
样品室温度设置
4°C
进样量
50pg（10pl）
检测波长
280nm
洗脱梯度
Time（min）
%流动相A
%流动相B
0.00
92.0
8.0
3.00
92.0
8.0
8.00
10.5
89.5
40.00
2&0
72.0
40.01
100.0
0.0
50.00
100.0
0.0
50.01
92.0
8.0
60.00
92.0
8.0
5・2进样序列
样品
进样针数
备注
NA
1
平衡色谱柱
流动相A
1
NA
制剂缓冲液
1
空白对照
参比品
3
确定系统适应性
供试品
1
样品数＜10*
参比品
1
确定系统适应性
注：
*每检测10个供试品，需进参比品1次以确定系统适应性。
5.3色谱柱清洗和保存
序列运行结束，用100%流动相B以0.5ml/min的流速冲洗色谱柱不少于30分钟：
用流动相
A和流动相B（92:
8）以0.5ml/min的流速冲洗色谱柱不少于30分钟，色谱柱保存在流动相A和流动相B（92:
8）中。
若色谱柱需保存超过1周，保存在色谱柱保存液中。
6数据分析及报告
6.1典型色图谱及色谱峰定义
典型的C产品的HPLC色谱图应有五个显著的主峰。
主峰区前的峰组为酸区，主峰之后的峰组为碱区。
C产品的HPLC典型图谱和色谱峰定义见图1。
6•2积分
基线撇去方式：
经典；斜率灵敏度：
0.2,峰宽：
0.2,最小峰面积：
2.0；最小峰高：
0.1；积分时
间：
5〜30min；
以上参数仅供参考，可根据样品实际情况调整积分参数以保证基线平稳和积分一致，尽量避免手动积分，手动积分需主管确认和签字。
6.3计算
采用面积归一化法计算，OpenLABCDS软件计算各峰的峰面积以及除溶剂峰和样品
Buffer峰外的总色谱峰面积，计算各组分区峰面积占总峰面积白分比的公式如下：
碱性区纯度％
6.4数字格式
〉保留时间：
小数点后3位；
〉峰面积％:
保留小数点后1位；
>RSD%：
大于等于1・0时，保留小数点后1位；小于1・0时，保留小数点后2位;
〉峰面积：
整数；
6.4接受标准
〉参比品色谱图与L产品典型色谱图一致。
>主峰保留时间的RSD%不大于2.0o
>主峰区总峰面积％的RSD%不大于2.0o
>总峰面积的RSD%不大于2.0°
6.5记录与报告
填写记录《C产品纯度测定离子交换谱法实验记录》（R・A・0021・保存色谱报告，按下表记录报告结果。
系统适用性样品
供试品
酸性区％
主峰区%RSD
酸性区％
主峰区％
主峰保留时间RSD
主峰区％
碱性区％
总峰面积RSD
碱性区％
主峰保留时间
总峰面积
参考文件:
1.《中国药典》2015版第三部通则0512
附件:
1•离子交换色谱法（C项目）实验记录（共3页）R-A-0021-04
历史:
修订号
生效日期
修订内容
01
2014-06-25
新文件
02
2015-01-01
1、适用范围项：
“蛋白原液、制剂、中间产品”变更为“C项口的蛋白原液、制剂及中间产品的分析”。
2、4•溶液配制项：
“流动相有效期为1个星期”变更为“流动相、清洗液、保存液的储存条件为2〜8弋,流动相有效期调整为1个月，每次使用前应重新调pH值，并经0.45pm过滤。
”
3、5.4数据分析及报告项：
新增：
色谱峰的定义，典型的C产品的CEX-HPLC图谱主峰区有5个峰，依次为峰1、峰2、峰3、峰4、峰5。
主峰区之前各峰为酸性区，主峰区之后各峰为碱性区。
4、5.4.1项：
主峰纯度计算公式变更为H标峰纯度计算公式，增加相对保留时间计算公式o
5、543项：
“根据需要选择性打印进样的色谱图，同时打印仪器方法删除“同时打印仪器方法”。
6、附件1中“4样品和对照品检测项”变更为“样品检测”：
内容“每个样品平行检测两次”变更为“制剂及原液平行检测两次”，并增加序列表名称和使用市售对照品、自制对照品、空白对照的批号、厂家、取样日期。
7、附件1中5报告结果项：
增加系统适用性内容，包括色谱峰是否相似性和主峰区各峰保留时间的差异的判断。
8、附件1中5报告结果项：
增加“若样品进行两次检测，取第一针为检测结果。
报告主峰区纯度结果。
”
修订号
生效日期
修订内容
03
1、根据修订后的《文件管理程序》（SMP-QA-001-02）^求修改本文件的形式。
2、2.2仪器设备项：
高效液相色谱仪，添加“Agilent120CT。
3、4.1流动相T&C低温保存，在1个月内使用，但每次使用前需要重新调pH值，并重新过0•45pm滤膜”变更为“室温条件下有效期3天”
4、423“样品经0・45呻的滤膜过滤”变更为“样品经0.22pm的滤膜过滤
5、5.4.2项中的“相对保留时间”公式删除。
6、5.4.3“保留时间记录时保留小数点后两位”变更为“保留时间记录时保留小数点后三位”。
7、5.4.4“根据需要选择性打印进样的色谱图”变更为“保存电子图谱并打印样品的色谱图”。
8、正文及附件中所有的“对照品”统一变更为“参比品”，“空白对照溶液”变更为“制剂缓冲液”o
9、4.1.2增加“注：
调pH时，流动相温度必须恢复到室温；运行序列前确认pH在6.50±0.01范围内，记录最终pHo”
10、4.1.4**在2个月内使用”更改为“在1个月内使用”
04
1、4」流动相配制项中流动相A和B的pH值均变更为6.20O增加调节pH值时的温度控制要求“流动相调pH时，确认溶液温度在23〜27°C”。
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