离子交换色谱法标准操作程序.docx

1、离子交换色谱法标准操作程序离子交换色谱（Ion Exchange Chromatography, IEC）以离子交换树脂作为固定相5树脂上具有 固定离子基团及可交换的离子基团。当流动相带着组分电离生成的离子通过固定相时，组分离子 与树脂上可交换的离子基团进行可逆变换。溶液pH低于C产品组分等电点PI时，组分带正电 荷，可以跟固定相上的阳离子交换，吸附在固定相上，用盐浓度梯度洗脫时，组分按照表面正电 荷从少到多的顺序被洗脱下来。紫外检测器检测280nm处的响应值，根据组分峰面积计算纯度。范围:适用于本公司生产出的C产品的中间产品、原液、成品及稳定性样品的电荷异质性分析。职责:操作人员：严格按照此

2、规程要求进行操作。岗位主管：起草文件，并确保操作程序的准确性、技术内容的完整性及文件的及时更新；监督操作规程是否与实际过程一致，资源是否满足要求；培训，确保此操作规程的正确实施。程序:1术语解释无2试剂和材料色谱柱：阳离子交换色谱柱5例如MabPac SCX-10, 4.0x250mm, 10pm （Thermo）试剂：N-（2乙酰胺基）2氨基乙磺酸（ACES,分析纯），氯化钠（NaCl,色谱纯），盐酸（HC1,分 析纯），磷酸氢二钠（Na2HPO4,色谱纯），磷酸（H?PO4,色谱纯），纯 化水（自制） 滤膜：孔径为0.45pm或以下注：所用试剂可被同等或更高级别的试剂替代，但应证明适用：所

3、有材料遵循厂家有效期。3仪器设备液相色谱仪:例如Agilent 1260天平，精确到mg pH计溶剂过滤装置离心机（转速10000 rpm以上）移液器（101000pl）4溶液配制4.1流动相配制4.1.1流动相 A： 20 mM ACES, pH 6.20称取ACES 3.64 g,加入1000 ml水搅拌至完全溶解，HC1调pH 6.20+0.02；经0.45 pm滤膜过滤，室温保存，有效期3天，使用前超声脫气15mino4.1.2流动相 B： 20 mM ACES, 500 mM NaCl, pH 6.20称取 ACES 3.64 g, NaCl 29.22 g加入 1000 ml 水搅

4、拌至完全溶解，HC1 调 pH 6.20+0.02：经0.45 pm滤膜过滤，室温保存，有效期3天，使用前超声脫气15min 注：流动相调pH时，确认溶液温度在2327C。4.1.3色谱柱保存液：20 mM NazHPOMHsPCU, pH 6.5称量2.84gNa2HPO4加入1000 ml纯水搅拌溶解，用HsPCh调节pH值为6.50+0.02,使 用0.45 滤膜过滤后，2-8C低温保存，有效期1个月。4.2样品溶液配制4.2.1参比品溶液配制取规定的参比品，根据蛋白浓度标示量，用制剂缓冲液稀释至5.0 mg/ml,转移至（J样品瓶。例：参比品CDS20180209,蛋口标示量为22.0

5、 mg/ml,稀释4.4倍（40 pl参比品+136pl制剂缓 冲液）5稀释后浓度为5.0 mg/mlo4.2.2供试品溶液配制稀释方法同421。对于浑浊的样品，需经0.22 pm的滤膜过滤，或者10000 rpm离心lOmin,取上清液至样品 瓶。5检测方法51色谱系统准备5.1.1打开sealwash （清洗液：10%异丙醇冰溶液）；更换洗针瓶（清洗液：水）；5.1.2以检测方法的流动相起始比例（流动相A： 4%,流动相B： 96%） , l.Oml/min的流速平 衡至基 线平稳5至少20mino5.1.3尖键色谱参数和洗脱梯度色谱参数流速1.0 ml/min色谱柱温度40 C样品室温度

6、设置4 C进样量50pg(10pl)检测波长280 nm洗脱梯度Time (min)%流动相A%流动相B0.0092.08.03.0092.08.08.0010.589.540.002&072.040.01100.00.050.00100.00.050.0192.08.060.0092.08.052进样序列样品进样针数备注NA1平衡色谱柱流动相A1NA制剂缓冲液1空白对照参比品3确定系统适应性供试品1样品数10*参比品1确定系统适应性注：*每检测10个供试品，需进参比品1次以确定系统适应性。5.3色谱柱清洗和保存序列运行结束，用100%流动相B以0.5 ml/min的流速冲洗色谱柱不少于30分

7、钟：用流动相A和流动相B (92:8)以0.5ml/min的流速冲洗色谱柱不少于30分钟，色谱柱保存 在流动相A和 流动相B (92:8)中。若色谱柱需保存超过1周，保存在色谱柱保存液中。6数据分析及报告6.1典型色图谱及色谱峰定义典型的C产品的HPLC色谱图应有五个显著的主峰。主峰区前的峰组为酸区，主峰之后 的峰 组为碱区。C产品的HPLC典型图谱和色谱峰定义见图1。6 2积分基线撇去方式：经典；斜率灵敏度：0.2,峰宽：0.2,最小峰面积：2.0；最小峰高：0.1；积分时间：5 30min ；以上参数仅供参考，可根据样品实际情况调整积分参数以保证基线平稳和积分一致，尽量避 免手动积分，手动

8、积分需主管确认和签字。6.3计算采用面积归一化法计算，OpenLAB CDS软件计算各峰的峰面积以及除溶剂峰和样品Buffer峰外的总色谱峰面积，计算各组分区峰面积占总峰面积白分比的公式如下：碱性区纯度6.4数字格式保留时间：小数点后3位；峰面积:保留小数点后1位；RSD%：大于等于10时，保留小数点后1位；小于10时，保留小数点后2位;峰面积：整数；6.4接受标准参比品色谱图与L产品典型色谱图一致。主峰保留时间的RSD%不大于2.0o主峰区总峰面积的RSD %不大于2.0o总峰面积的RSD%不大于2.0 6.5记录与报告填写记录C产品纯度测定离子交换谱法实验记录（RA0021保存色谱报告，按

9、下表记录报告 结果。系统适用性样品供试品酸性区主峰区%RSD酸性区主峰区主峰保留时间RSD主峰区碱性区总峰面积RSD碱性区主峰保留时间总峰面积参考文件:1.中国药典2015版第三部通则0512附件:1 离子交换色谱法（C项目）实验记录（共3页） R-A-0021-04历史:修订号生效日期修订内容012014-06-25新文件022015-01-011、 适用范围项：“蛋白原液、制剂、中间产品”变更为“C项口的蛋白原 液、制剂及中间产品的分析”。2、 4溶液配制项：“流动相有效期为1个星期”变更为“流动相、清洗 液、保存液的储存条件为28弋,流动相有效期调整为1个月，每次使 用前应重新调pH值，

10、并经0.45pm过滤。”3、 5.4数据分析及报告项：新增：色谱峰的定义，典型的C产品的CEX- HPLC图谱主峰区有5个峰，依次为峰1、峰2、峰3、峰4、峰5。主 峰区之前各峰为酸性区，主峰区之后各峰为碱性区。4、 5.4.1项：主峰纯度计算公式变更为H标峰纯度计算公式，增加相对保 留时间计算公式o5、 543项：“根据需要选择性打印进样的色谱图，同时打印仪器方 法删除“同时打印仪器方法”。6、 附件1中“4样品和对照品检测项”变更为“样品检测”：内容“每个样 品平行检测两次”变更为“制剂及原液平行检测两次”，并增加序列表 名称和使用市售对照品、自制对照品、空白对照的批号、厂家、取样 日期。

11、7、 附件1中5报告结果项：增加系统适用性内容，包括色谱峰是否相似 性和主峰区各峰保留时间的差异的判断。8、 附件1中5报告结果项：增加“若样品进行两次检测，取第一针为检 测结果。报告主峰区纯度结果。”修订号生效日期修订内容031、根据修订后的文件管理程序(SMP-QA-001-02)求修改本文件的形 式。2、2.2仪器设备项：高效液相色谱仪，添加“Agilent 120CT。3、 4.1流动相T&C低温保存，在1个月内使用，但每次使用前需要重新调 pH值，并重新过0 45pm滤膜”变更为“室温条件下有效期3天”4、 423 “样品经045呻 的滤膜过滤”变更为“样品经0.22pm的滤 膜过

12、滤5、5.4.2项中的“相对保留时间”公式删除。6、 5.4.3 “保留时间记录时保留小数点后两位”变更为“保留时间记录时 保留小数点后三位”。7、 5.4.4 “根据需要选择性打印进样的色谱图”变更为“保存电子图谱并 打印样品的色谱图”。8、 正文及附件中所有的“对照品”统一变更为“参比品”，“空白对照溶 液”变更为“制剂缓冲液” o9、 4.1.2增加“注：调pH时，流动相温度必须恢复到室温；运行序列前确 认pH在6.500.01范围内，记录最终pHo”10、 4.1.4 *在2个月内使用”更改为“在1个月内使用”041、4流动相配制项中流动相A和B的pH值均变更为6.20O增加调节pH 值时的温度控制要求“流动相调pH时，确认溶液温度在2327C ”。