分子杂交的概念及基本原理.docx

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分子杂交的概念及基本原理

分子杂交的概念及基本原理

主要内容：

一、分子杂交的概念

二、分子杂交基本原理

（一）DNA变性：

1、DNA变性的方法

2、增色效应

3、溶解曲线

4、融解温度

5、影响Tm值的因素。

（二）复性：

退火

一、分子杂交的概念：

分子杂交（molecularhybridization）指具有一定同源序列的两条核酸单链（DNA或RNA），在一定条件下按碱基互补配对原则经过退火处理，形成异质双链的过程。

利用这一原理，就可以使用已知序列的单链核酸片段作为探针，去查找各种不同来源的基因组DNA分子中的同源基因或同源序列。

二、分子杂交基本原理：

（一）DNA变性：

DNA变性是指双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，形成单链无规则线团，因而发生性质改变（如粘度下降，沉降速度增加，浮力上升，紫外吸收增加等）。

1、DNA变性的方法：

1）加热；

2）改变DNA溶液的pH；

3）有机溶剂（如乙醇、尿素、甲酰胺及丙酰胺等）等理化因素。

2、增色效应：

DNA在260nm处有最大吸收值，这一特征是由于含有碱基的缘故。

在DNA双螺旋结构模型中碱基藏于内侧，变性时由于双螺旋解开，于是碱基外露，260nm紫外吸收值因而增加，这一现象称为增色效应（hyperchromiceffect）。

利用DNA变性后波长260nm处紫外吸收的变化可追踪变性过程。

3、溶解曲线：

如果升高温度使DNA变性，以温度对紫外吸收作图，可得到一条曲线，称为溶解曲线。

4、融解温度：

通常人们把50%DNA分子发生变性的温度称为变性温度（即熔解曲线中点对应的温度），由于这一现象和结晶的融解相类似，故又称融点或融解温度（meltingtemperature，Tm）。

因此Tm是指消光值上升到最大消光值一半时的温度。

5、影响Tm值的因素：

Tm不是一个固定的数值，它与很多因素有关：

1）部因素：

pH、离子强度。

随着溶剂内离子强度上升，Tm值也随着增大。

2）部因素：

DNA的碱基比例、DNA的均一性；在相同条件下，DNA内G-C配对含量高，其Tm值也高。

6、DNA中的GC含量与Tm值关系：

Tm=69。

30。

41×%（GC）

对于小于20bp的寡核苷酸，Tm=4（GC）2（AT）

实验表明DNA分子中（GC）克分子含量百分比的大小与Tm值的高低呈直线关系。

（二）复性：

变性DNA只要消除变性条件，二条互补链还可以重新结合，恢复原来的双螺旋结构，这一过程称为复性（renaturation）。

退火：

通常DNA热变性后，将温度缓慢冷却，并维持在比Tm低25～30℃左右时，变性后的单链DNA即可恢复双螺旋结构，因此，这一过程又叫做退火。

复性后的DNA，理化性质都能得到恢复。

倘若DNA热变后快速冷却，则不能复性。

影响复性速度的因素：

1、DNA浓度：

愈高，复性速度也愈快。

2、DNA片段的大小：

DNA片段愈大，扩散速度愈低，使DNA片段线状单链互相发现互补的机会减少。

因此，在复性实验中，有时将DNA切成小片段，再进行复性。

3、温度：

过高不利于复性。

4、溶液的离子强度：

通常盐浓度较高时，复性速度较快。

5、DNA顺序的复杂性；简单的分子复性很快，如polyd[T]和polyd[A]由于彼此互补识别很快，故能迅速复性。

但顺序较复杂的DNA分子复性则较慢。

因此通过变性速率的研究，可以了解DNA顺序的复杂性。

 核酸探针

主要内容：

一、探针的概念

二、探针的种类极其选择：

1、DNA探针，2、cDNA探针，

3、RNA探针，4、寡核酸探针

三、各种标记物极其选择

四、核酸探针的标记方法

五、杂交信号检测

一、探针的概念：

放射性同位素、生物素或荧光染料进行标记的已知序列的核酸片段，即为探针（probe）。

探针可用于分子杂交，杂交后通过放射自显影、荧光检测或显色技术，使杂交区带显现出来。

二、探针的种类极其选择：

基因探针根据标记物不同可粗分为放射性探针和非放射性探针两大类；

根据探针的来源及核酸性质不同又可分为DNA探针，RNA探针，cDNA探针，及寡核苷酸探针等几类。

1、DNA探针：

DNA探针是最常用的核酸探针，指长度在几百碱基对以上的双链DNA或单链DNA探针。

现已获得DNA探针数量很多，有细菌、病毒、原虫、真菌、动物和人类细胞DNA探针。

这类探针多为某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列。

DNA探针的获得有赖于分子克隆技术的发展和应用。

以细菌为例，目前分子杂交技术用于细菌的分类和菌种鉴定比之GC百分比值要准确的多，是细菌分类学的一个发展方向。

加之分子杂交技术的高敏感性，分子杂交在临床微生物诊断上具有广阔的前景。

DNA探针（包括cDNA探针）的优点：

①这类探针多克隆在质粒载体中，可以无限繁殖，取之不尽，制备方法简便。

②不易降解（相对RNA而言），一般能有效抑制DNA酶活性。

③DNA探针的标记方法较成熟，有多种方法可供选择，如缺口平移，随机引物法等，能用于同位素和非同位素标记。

 2、cDNA探针：

cDNA（complementaryDNA）探针是指互补于mRNA的DNA分子，是由逆转录酶催化而产生的。

该酶以RNA为模板，根据碱基配对原则，按照RNA的核苷酸顺序合成DNA（其中U与A配对）。

cDNA探针是目前应用最为广泛的一种探针。

3、RNA探针：

RNA探针是一类很有前途的核酸探针，由于RNA是单链分子，所以它与靶序列的杂交反应效率极高。

早期采用的RNA探针是细胞mRNA探针和病毒RNA探针，这些RNA是在细胞基因转录或病毒复制过程中得到标记的，标记效率往往不高，且受到多种因素的制约。

这类RNA探针主要用于研究目的，而不是用于检测。

克隆探针：

前述三种探针均是可克隆的，一般情况下，只要有克隆的探针，就不用寡核苷酸探针。

在DNA序列未知而必须首先进行克隆以便绘制酶谱和测序时，也常应用克隆。

32P]dATP标记。

（二）、非放射性标记：

放射性标记核酸探针在使用中的限制，促使非放射性标记核酸探针的研制迅速发展，在许多方面已代替放射性标记，推动分子杂交技术的广泛应用。

目前已形成两大类非放射标记核酸技术，即酶促反应标记法和化学修饰标记法。

1、酶促反应标记法：

将标记物预先标记在核苷酸分子上，然后利用酶促反应将核苷酸分子掺入到探针分子中去。

１）标记物-dUTP的生成：

如Bio-11-dUTP、Dig-11-dUTP。

２）通过缺口平移法、末端加尾标记和随机引物延伸法将标记物-dUTP作为大肠杆菌多聚酶I（DNA酶I）的底物掺入到DNA分子中。

2、化学修饰标记法：

利用标记物分子上的活性基团与探针分子上的基团发生的化学反应将标记物直接结合到探针分子上。

如可通过连接臂将一个光敏基团连接于生物素成为光敏生物素，在可见光的作用下，与核酸形成稳定的交联，从而得到光敏生物素探针。

 五、杂交信号检测：

（一）放射自显影：

利用放射线在X线片上成影作用来检测杂交信号，称为放射自显影。

（二）非放射性核素探针的检测：

1、偶联反应：

（1）半抗原——通过抗原-抗体反应与显色体系偶联。

（2）配体——亲和法与显色体系偶联：

生物素-抗生物素蛋白-酶（Avidin-Biotin-Enzyme-Complex，ABC）

2、显色反应：

通过连接在抗体或生物素蛋白的显色物质如酶、荧光素等进行杂交信号的检测。

（1）酶学检测：

是最常用的检测方法，通过酶促反应使底物形成有色产物。

最常用的酶是辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶，也有使用酸性磷酸酶和β–半乳糖苷酶。

1）辣根过氧化物酶（HRP）检测体系：

AKP灵敏度和分辨率较HRP高约10倍左右，但HRP的优点为价廉、稳定。

（2）荧光检测：

常用的有异硫氰酸荧光素（FITC）和罗丹明，可被紫外线激发出荧光而被检测到。

主要应用于原位杂交。

（3）化学发光法：

是指在化学反应过程中伴随的发光反应。

目前常用的是辣根过氧化物酶（HRP）催化鲁米诺（luminol）伴随的发光反应。

适合于Southern、Northern及斑点杂交。

（4）电子密度标记：

利用重金属的高电子密度、在电子显微镜下进行检测，适合于细胞原位杂交。

核酸分子杂交的类型

核酸分子杂交可按作用环境大致分为液相杂交和固相杂交两种类型。

液相杂交：

液相杂交指所参加反应的两条核酸链都游离在溶液中。

液相杂交是一种研究最早且操作复合的杂交类型，在过去的30年里虽有时被应用，但总不如固相杂交那样普遍。

其主要原因是杂交后过量的未杂交探针在溶液中除去较为困难和误差较高。

固相杂交：

固相杂交是将参加反应的一条核酸链先固定在固体支持物上，另一条核酸链游离在溶液中。

由于固相杂交后，未杂交的游离片段可容易地漂洗除去，膜上留下的杂交物容易检测和能防止靶DNA自我复性等优点，故该法最为常用。

根据支持物的不同固相杂交又可为：

滤膜杂交、菌落原位杂交和组织原位杂交。

重点介绍：

一、印迹杂交

（一）印迹杂交技术的基本过程：

（二）印迹转移的方法

（三）印迹杂交的类别及应用

1、Southern印迹杂交、

2、Northern印迹杂交，

二、斑点杂交、狭缝杂交，

三、菌落原位杂交、

四、组织原位杂交等。

一、印迹杂交：

（一）印迹杂交技术的基本过程：

印迹杂交技术的原理首先由EdwenSouthern在1975年提出。

其基本操作过程是：

1、核酸的制备；

2、电泳：

将DNA片段在琼脂糖凝胶中电泳分离；

3、变性：

置NaOH液中浸泡，从而将凝胶中的DNA变性为单链；

4、印迹：

利用吸水纸巾的毛细管作用，将单链DNA从凝胶中转移到硝酸纤维素膜上，再将膜置80℃烘干并使单链DNA分子固定在膜上；

5、预杂交：

减少非特异性杂交反应。

6、杂交：

7、洗膜：

8、检测：

（二）印迹转移的方法：

将凝胶中的核酸片段印迹到滤膜的方法有：

1、虹吸印迹法

2、电转移印迹法

3、真空印迹法

1、虹吸印迹法：

利用毛细管的虹吸作用由转移缓冲液带动核酸分子转移至滤膜上。

电泳后的凝胶→变性→中和→放置→室温转移15—20h→漂洗→80℃烘烤2h固定核酸

2、电转移印迹法：

利用电泳作用将凝胶中的DNA转移至滤膜上，是一种快速、简单、高效的转移法，只需几小时，特别适用虹吸转移法不理想的大片段的转移。

电转移法使用的滤膜有一定的限制，只能用尼龙膜或化学活化膜，不能用硝酸纤维素膜。

因为硝酸纤维素膜结合DNA依赖于高浓度盐溶液，高盐溶液的导电性极强，产生强大的电流，使转移体系的温度急剧升高，破坏DNA。

3、真空印迹法：

利用真空泵将转移缓冲液从上层容器中通过凝胶抽到下层真空室中，同时带动核酸分子转移到凝胶下面的滤膜上，整个过程只需1小时左右。

（三）印迹杂交的类别及应用：

1、DNA印迹杂交技术：

Southernblotting

2、RNA印迹杂交技术：

正好与DNA相对应，故被趣称为Northernblotting

3、蛋白质印迹杂交技术则被称为Westernblotting。

其中最常用的是用抗体来检测，也称为免疫印迹技术（immunoblotting）。

1、DNA印迹杂交技术：

DNA印迹技术由Southern于1975年创建，称为Southern印迹技术（Southernblotting）。

基因组DNA→限制性内切酶→DNA变性电泳→印记转移→预杂交—（探针）→杂交→洗膜→放射自显影或化学显色。

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