土壤酶活性测定方法综合.docx

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土壤酶活性测定方法综合

土壤酶活性测定方法

1、土壤脲酶的测定方法（苯酚钠—次氯酸钠比色法）

一、原理

脲酶存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。

它是一种酰胺酶作用是极为专性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和二氧化碳、水。

土壤脲酶活性，与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。

根际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。

人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。

土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的尿素量来求得。

本方法以尿素为基质，根据酶促产物氨与苯酚—次氯酸钠作用生成蓝色的靛酚，来分析脲酶活性。

二、试剂

1）甲苯

2）10%尿素：

称取10g尿素，用水溶至100ml。

3）柠檬酸盐缓冲液（）：

184g柠檬酸和氢氧化钾（KOH）溶于蒸馏水。

将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至，用水稀释定容至1000ml。

4）苯酚钠溶液（L）：

苯酚溶于少量乙醇，加2ml甲醇和丙酮，用乙醇稀释至100ml（A液），存于冰箱中；27gNaOH溶于100ml水（B液）。

将A、B溶液保存在冰箱中。

使用前将A液、B液各20ml混合，用蒸馏水稀释至100ml。

5）次氯酸钠溶液：

用水稀释试剂，至活性氯的浓度为%，溶液稳定。

6）氮的标准溶液：

精确称取硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，得到1ml含有氮的标准液；再将此液稀释10倍（吸取10ml标准液定容至100ml）制成氮的工作液（ml）。

三、操作步骤

称取5g土样于50ml三角瓶中，加1ml甲苯，振荡均匀，15min后加10ml10%尿素溶液和20mlPH柠檬酸盐缓冲溶液，摇匀后在37℃恒温箱培养24小时。

培养结束后过滤，过滤后取1ml滤液加入50ml容量瓶中，再加4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。

20min后显色，定容。

1h内在分光光度计与578nm波长处比色。

（靛酚的蓝色在1h内保持稳定）。

标准曲线制作：

在测定样品吸光值之前，分别取0、1、3、5、7、9、11、13ml氮工作液，移于50ml容量瓶中，然后补加蒸馏水至20ml。

再加入4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。

20min后显色，定容。

1h内在分光光度计上于578nm波长处比色。

然后以氮工作液浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。

注意事项:

1、每一个样品应该做一个无基质对照，以等体积的蒸馏水代替基质，其他操作与样品实验相同，以排除土样中原有的氨对实验结果的影响。

2、整个实验设置一个无土对照，不加土样，其他操作与样品实验相同，以检验试剂纯度和基质自身分解。

3、如果样品吸光值超过标曲的最大值，则应该增加分取倍数或减少培养的土样

四、结果计算：

以24小时后1g土壤中NH3－N的毫克数表示土壤脲酶活性（Ure）。

Ure=（a样品－a无土－a无基质）×V×n／m

式中：

a样品为样品吸光值由标准曲线求得的NH3－N毫克数；

a无土为无土对照吸光值由标准曲线求得的NH3－N毫克数；

a无基质为无基质对照吸光值由标准曲线求得的NH3－N毫克数；

V为显色液体积；n为分取倍数，浸出液体积／吸取滤液体积；m表示土重

2、土壤磷酸酶活性测定（磷酸苯二钠比色法）

一、原理

测定磷酸酶主要根据酶促生成的有机基团量或无机磷量计算磷酸酶活性。

前一种通常称为有有机基团含量法，是目前较为常用的测定磷酸酶的方法，后一种称为无机磷含量法。

研究证明：

磷酸酶有三种最适PH值：

4~5、6~7、8~10。

因此，测定酸性、中性和碱性土壤的磷酸酶，要提供相应的PH缓冲液才能测出该土壤的磷酸酶最大活性。

测定磷酸酶常用的PH缓冲体系有乙酸盐缓冲液（~）、柠檬酸盐缓冲液（）、三羟甲基氨基甲烷缓冲液（~）、和硼酸缓冲液（PH9~10）。

磷酸酶测定时常用基质有磷酸苯二钠、酚酞磷酸钠、甘油磷酸钠、α-或者β-萘酚磷酸钠等。

现介绍磷酸苯二钠比色法。

二、试剂

1）缓冲液：

（1）醋酸盐缓冲液（PH）

L醋酸溶液95%冰醋酸溶至1L.

L醋酸钠溶液C2H3O2Na或27g溶至1L.

取L醋酸溶液和L醋酸钠溶液稀释至1L.

（2）柠檬酸盐缓冲液（PH）

L柠檬酸溶液C6H7O8溶至1L.

L磷酸氢二钠溶液或者溶至1L.

取L柠檬酸溶液加L磷酸氢二钠溶液稀释至100ml.

（3）硼酸盐缓冲液（PH）

L硼砂溶液硼砂溶至1L.

LNaOH溶液8gNaOH溶至1L.

取50mlL硼砂溶液加23mlLNaOH溶液稀释至200ml.

2）%磷酸苯二钠（用缓冲液配制）

3）氯代二溴对苯醌亚胺试剂：

称取氯代二溴对苯醌亚胺，用10ml96%乙醇溶解，贮于棕色瓶中，存放在冰箱里。

保存的黄色溶液未变褐色之前均可使用。

4）甲苯

5）%硫酸铝溶液

6）酚标准溶液

酚原液：

取1g重蒸酚溶于蒸馏水中，稀释至1L，存于棕色瓶中。

酚工作液（ml）：

取10ml酚原液稀释至1L。

三、操作步骤

称5g土样置于200ml三角瓶中，加甲苯，轻摇15min后，加入20ml%磷酸苯二钠（酸性磷酸酶用乙酸盐缓冲液；中性磷酸酶用柠檬酸盐缓冲液；碱性磷酸酶用硼酸盐缓冲液），仔细摇匀后放入恒温箱，37℃下培养24h。

然后在培养液加入100ml%硫酸铝溶液并过滤。

吸取3ml滤液于50ml容量瓶中，然后按绘制标准曲线方法显色。

用硼酸缓冲液时，呈现蓝色，于分光光度计上660nm处比色。

标准曲线绘制：

取0、1、3、5、7、9、11、13ml酚工作液，置于50ml容量瓶中，每瓶加入5ml硼酸缓冲液和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，30min后，在分光光度计上660nm处比色。

以显色液中酚浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。

注意事项:

1、每一个样品应该做一个无基质对照，以等体积的蒸馏水代替基质，其他操作与样品实验相同，以排除土样中原有的氨对实验结果的影响。

2、整个实验设置一个无土对照，不加土样，其他操作与样品实验相同，以检验试剂纯度和基质自身分解。

3、如果样品吸光值超过标曲的最大值，则应该增加分取倍数或减少培养的土样

四、结果计算

以24h后1g土壤中释放出的酚的质量（mg）表示磷酸酶活性。

磷酸酶活性=（a样品－a无土－a无基质）×V×n／m

式中：

a样品为样品吸光值由标准曲线求得的酚毫克数；

a无土为无土对照吸光值由标准曲线求得的酚毫克数；

a无基质为无基质对照吸光值由标准曲线求得的酚毫克数；

V为显色液体积；n为分取倍数，浸出液体积／吸取滤液体积；m表示烘干土重

3、土壤蔗糖酶活性测定（3,5-二硝基水杨酸比色法）

一、原理

蔗糖酶与土壤许多因子有相关性，如与土壤有机质、氮、磷含量，微生物数量及土壤呼吸强度有关，一般情况下，土壤肥力越高，蔗糖酶活性越高。

蔗糖酶酶解所生成的还原糖与?

3,5-二硝基水杨酸反应而生成橙色的3-氨基-5-硝基水杨酸。

颜色深度与还原糖量相关，因而可用测定还原糖量来表示蔗糖酶的活性。

二、试剂

1）酶促反应试剂：

基质8%蔗糖，磷酸缓冲液：

1/15M磷酸氢二钠（Na2HPO4·2H2O溶于1L蒸馏水中）加1/15M磷酸二氢钾（KH2PO4溶于1L蒸馏水中）即成，甲苯

2）葡萄糖标准液（1mg/mL）

预先将分析纯葡萄糖置80℃内约12小时。

准确称取50mg葡萄糖于中，用水溶解后，移至50mL中，定容，摇匀（冰箱中4℃保存期约一星期）。

若该溶液发生混浊和出现絮状物现象，则应弃之，重新配制。

3）?

3,5-二硝基水杨酸试剂（DNS试剂）

称二硝基水杨酸，溶于20ml2mol/LNaOH和50ml水中，再加30g酒石酸钾钠，用水稀释定容至100ml（保存期不过7天）。

三、操作步骤

（1）标准曲线绘制

分别吸1mg/mL的标准葡糖糖溶液0、、、、、于试管中，再补加蒸馏水至1mL，加DNS试剂3mL混匀，于沸水浴中准确反应5min（从试管放入重新沸腾时算起），取出立即泠水浴中冷却至室温，以空白管调零在波长540nm处比色，以OD值为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。

（2）土壤蔗糖酶测定

称取5g土壤，置于50mL三角瓶中，注入15ml8%蔗糖溶液，5mlpH磷酸缓冲液和5滴甲苯。

摇匀混合物后，放入恒温箱，在37℃下培养24h。

到时取出，迅速过滤。

从中吸取滤液1ml，注入50ml容量瓶中，加3mlDNS试剂，并在沸腾的水浴锅中加热5min，随即将容量瓶移至自来水流下冷却3min。

溶液因生成3-氨基-5-硝基水杨酸而呈橙黄色，最后用蒸馏水稀释至50ml，并在分光光度计上于508nm处进行比色。

（为了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖而引起的误差，每一土样需做无基质对照，整个试验需做无土壤对照；如果样品吸光值超过标曲的最大值，则应该增加分取倍数或减少培养的土样。

）

四、结果计算：

蔗糖酶活性以24h，1g干土生成葡萄糖毫克数表示。

蔗糖酶活性=（a样品－a无土－a无基质）×n／m

a样品、a无土、a无机质分别表示其由标准曲线求的葡萄糖毫克数；n为分取倍数；m表示烘干土重

4、土壤纤维素酶活性测定（3,5-二硝基水杨酸比色法）

一、原理

纤维素是植物残体进入土壤的碳水化合物的重要组分之一。

在纤维素酶作用下，它的最初水解产物是纤维二糖，在纤二糖酶作用下，纤维二糖分解成葡萄糖。

所以，纤维素酶是碳素循环中的一个重要的酶。

纤维素酶解所生成的还原糖与?

3,5-二硝基水杨酸反应而生成橙色的3-氨基-5-硝基水杨酸。

颜色深度与还原糖量相关，因而可用测定还原糖量来表示蔗糖酶的活性。

二、试剂

1）甲苯

2）1%羧甲基纤维素溶液：

1g羧甲基纤维素钠，用50%的乙醇溶至100ml。

3）醋酸盐缓冲液：

L醋酸溶液95%冰醋酸溶至1L.

L醋酸钠溶液C2H3O2Na或溶至1L.

取11mlL醋酸溶液和88mlL醋酸钠溶液混匀即成PH醋酸盐缓冲液.

4）3,5-二硝基水杨酸溶液：

称二硝基水杨酸，溶于50ml2mol/LNaOH和125ml水中，再加75g酒石酸钾钠，用水稀释至250ml（保存期不过7天），

5）葡萄糖标准液（1mg/mL）

预先将分析纯葡萄糖置80℃烘箱内约12小时。

准确称取50mg葡萄糖于烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至50mL容量瓶中，定容，摇匀（冰箱中4℃保存期约一星期）。

若该溶液发生混浊和出现絮状物现象，则应弃之，重新配制。

三、操作步骤

葡萄糖标准曲线：

分别吸1mg/mL的标准葡糖糖溶液0、、、、、于试管中，再补加蒸馏水至1mL，加DNS溶液3ml混匀，于沸腾水浴中加热5min，取出立即泠水浴中冷却至室温，以空白管调零在波长540nm处比色，以OD值为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。

称10g土壤置于50ml三角瓶中，加入甲苯，摇匀后放置15min，再加5ml1%羧甲基纤维素溶液和5ml醋酸盐缓冲液，将三角瓶放在37℃恒温箱中培养72h。

培养结束后，过滤并取1ml滤液，然后按绘制标准曲线显色法比色测定。

（为了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖而引起的误差，每一土样需做无基质对照，整个试验需做无土壤对照；如果样品吸光值超过标曲的最大值，则应该增加分取倍数或减少培养的土样。

）

四、结果计算

纤维素酶活性以72h，1g干土生成葡萄糖毫克数表示。

纤维素酶活性=（a样品－a无土－a无基质）×n／m

a样品、a无土、a无机质分别表示其由标准曲线求的葡萄糖毫克数；n为分取倍数；m表示烘干土重

5、过氧化氢酶活性测定（高锰酸钾滴定法）

一、原理

过氧化氢广泛存在于生物体和土壤中，是由生物呼吸过程和有机物的生物化学氧化反应的结果产生的，这些过氧化氢对生物和土壤具有毒害作用。

与此同时，在生物体和土壤中存有过氧化氢酶，能促进过氧化氢分解为水和氧的反应（H2O2→H2O+O2），从而降低了过氧化氢的毒害作用。

土壤中过氧化氢酶的测定便是根据土壤（含有过氧化氢酶）和过氧化氢作用析出的氧气体积或过氧化氢的消耗量，测定过氧化氢的分解速度，以此代表过氧化氢酶的活性。

测定过氧化氢酶的具体方法比较多，如气量法：

根据析出的氧气体积来计算过氧化氢酶的活性；比色法：

根据过氧化氢与硫酸铜产生黄色或橙黄色络合物的量来表征过氧化氢酶的活性；滴定法：

用高锰酸钾溶液滴定过氧化氢分解反应剩余过氧化氢的量，表示出过氧化氢酶的活性。

本实验重点采用高锰酸钾滴定法。

二、试剂

2mol/LH2SO4溶液:

量取的浓硫酸稀释至500ml，置于冰箱贮存;

L高锰酸钾溶液：

称取高锰酸钾，加入400mL水中，缓缓煮沸15min，冷却后定容至500mL，避光保存，用时用L草酸溶液标定；

L草酸溶液：

称取优级纯H2C2O4?

2H2O3.334g,用蒸馏水溶解后，定容至250ml；

3%的H2O2水溶液：

取30%H2O2溶液25ml,定容至250ml，置于冰箱贮存，用时用LKmnO4溶液标定。

三、操作步骤

分别取5g土壤样品于具塞三角瓶中（用不加土样的作空白对照），加入甲苯，摇匀，于4℃冰箱中放置30min。

取出，立刻加入25mL冰箱贮存的3%H2O2水溶液，充分混匀后，再置于冰箱中放置1h。

取出，迅速加入冰箱贮存的2mol/LH2SO4溶液25mL，摇匀，过滤。

取1mL滤液于三角瓶，加入5mL蒸馏水和5mL2mol/LH2SO4溶液，用L高锰酸钾溶液滴定。

根据对照和样品的滴定差，求出相当于分解的H2O2的量所消耗的KmnO4。

过氧化氢酶活性以每g干土1h内消耗的LKmnO4体积数表示（以mL计）表示。

四、结果计算（如下面处理）：

KMnO4标定：

10mLLH2C2O4用KMnO4滴定，所消耗KMnO4体积数为，由此计算出KMnO4标准溶液浓度为L。

H2O2标定：

1ml3%H2O2用KMnO4滴定，所消耗KMnO4体积数为,由此计算出H2O2浓度为L。

酶活性=（空白样剩余过氧化氢滴定体积-土样剩余过氧化氢滴定体积）*T/土样质量

其中：

酶活性单位-mlLKMnO4）/（h·g）；

T-高锰酸钾滴定度的矫正值T==。

五、注意事项

1、用L草酸溶液标定高锰酸钾溶液时，要先取一定量的草酸溶液加入一定量硫酸中并于70℃水浴加热，开始滴定时快滴，快到终点时再进行水浴加热，后慢滴，待溶液呈微红色且半分钟内不退色即为终点。

2、高猛酸钾滴定过程对酸性环境的要求很严格。

经探究后发现直接取1mL滤液滴定不仅液体量太少，终点不好把握，硫酸的量也不足，因此我组对实验方法进行了改进，即取1mL滤液于三角瓶，加入5mL蒸馏水和5mL2mol/LH2SO4溶液，再用高锰酸钾溶液滴定，这样滴定过程极为方便。

6、土壤蛋白酶活性测定方法：

铜盐比色法

（一）方法原理

本法基于以精胶为基质，酶解后所释放的氨基酸使其与铜盐反应形成蓝色复合物。

用比色测定颜色深度，计算出氨基酸含量，来度量酶的活性。

（二）试剂

1）1%精胶

2）甲苯

3）铜-磷酸盐溶液：

①CuCl2?

H2O溶于1L水；②Na2HPO4?

12H2O溶于500mL水，加入NaOH，稀释至1L；③Na2B4O7溶于水，加入100毫升mol/LHCL稀释至2L，使用按照1：

2：

2的体积分数前将上述①、②、③混合。

4）甘氨酸标准溶液的配制：

取甘氨酸溶于蒸馏水，稀释至1L（1mL含50μgNH3-N）。

（三）操作步骤

（1）标准曲线绘制

取0、5、10、15、20mL甘氨酸标准溶液，用蒸馏水加至20mL，然后加入20mL新配制的铜-磷酸盐溶液。

显色后，用分光光度计在650nm处测定，绘制标准曲线。

（2）土壤蛋白酶活性测定

称取5g土壤置于100mL三角瓶中，加入甲苯2mL，放置15min，加入20mL1%精胶溶液，于37℃恒温培养24h，于此同时，以水代替基质作为对照。

培养结束后，将悬液过滤，取10mL滤液，加水10mL，铜-磷酸盐溶液20mL。

显色后，用分光光度计在650nm处测定，根据标准曲线求出NH3-N含量。

以每克土壤在37℃下24h内酶解蛋白质释放的NH3-N的质量（μg）表示蛋白酶活性。