牛乳中细菌数的检查之欧阳计创编.docx
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牛乳中细菌数的检查之欧阳计创编
牛乳中细菌数的检查
时间：
2021.02.11
创作：
欧阳计
摘要：
【目的】采用两种方法检测牛乳中细菌数目，鉴定牛乳卫生等级。
【方法】采用美蓝还原酶试验法和标准平板计数法检测不同种类牛乳中细菌数目，确定质量等级。
通过对照试验鉴定巴斯德消毒法是否符合卫生标准。
【结果】美蓝还原酶试验法可以快捷简便地对牛乳质量等级进行定性检测；标准平板法可以对牛乳中细菌数量进行定量检测，结果准确。
【结论】通过标准平板法平行测定，可确定样品牛乳等级为中等和差。
通过对照试验，确定巴斯德消毒法可靠性强。
关键词：
牛乳；美蓝还原酶；标准平板计数；细菌数；检查
TheInspectionoftheNumberofBacteriainMilk
YongqingXue,WenjingSun,XiangchenFan,NaLi,JunyiLi,HongzhouZhao,
TongyangChen,ChunyanHu
（CollegeofLifeSciences,ShandongAgricutualUniversity,Tai’an,271000,China）
Abstract:
[Objective]Usingtwomethodstodetectingthequalityofcow’smilkandthenumberofbacteriainmilkandtodentifyingthehygieniclevelofmilk.[Methods]Usingthemethylenebluereductasemethodandthestandardplatecountingmethodtocarryonthedetectionofthenumberofbacteriaindifferentmilk,thereforetodeterminethequalityofmilk.ThroughcontrolledtrailstodeterminewhetherPasteurizationofmilkmeetsthequalitystandards.[Results]Methylenebluereductasetestmethodcanbeeasyandquickforthequalitativedetectionofmilkqualitylevels;whilestandardplatecountingmethodcanquantifythenumberofbacteriainmilkandtheresultsofthetestarecommonlyaccurate.[Conclusion]Measuredbythestandardplatingcountmethod,themilksamplesbeingdeterminedareatamiddleandsomeevenlowlevel.BythecontrolledtrialstodeterminethatPasteurizationisreliable.
Keywords:
thecow’smilk;themethylenebluereductasemethod;thestandardplatecountingmethod;thenumbleofbacteria;inspection
1引言
牛乳富含蛋白质，长期饮用有助于增强体质。
同时，牛乳也是许多疾病传播的一种重要的非生命载体，富含微生物生长繁殖的丰富营养[1]。
从健康母牛体内刚取出的牛奶含有少量正常的起始微生物，在牛乳的采取、加工、分装与运输过程中，可能由于操作不规范而使牛乳污染杂菌。
由于牛乳营养丰富，其中污染的杂菌会快速繁殖，饮用后对身体有极大危害。
牛乳的细菌学检查一般有显微镜直接计数法、美蓝还原酶试验、检测大肠菌群和标准平板计数法[2]，本次试验通过后两种方法分别定性、定量检测牛乳样品的细菌数含量，同时通过对照试验，确定在牛乳消毒中被广泛应用的巴斯德消毒法的卫生标准是否达标。
2材料与方法
2.1试验时间与地点
2011年11月7日-8日，9号楼522试验室。
2.2试验材料
材料：
亚奥特鲜牛奶；亚奥特纯牛奶；牛肉膏蛋白胨培养基；
试剂：
美蓝溶液（1:
250000）；无菌水；蒸馏水等；
仪器和用具：
试管，试管架，三角瓶，5mL移液枪及枪头，1mL移液枪及枪头，培养平板，高温蒸汽灭菌锅，恒温水浴锅，微波炉，显微镜，载玻片，标记笔等。
2.3试验方法
2.3.1牛肉膏蛋白胨培养基和无菌水的制备与灭菌
制备牛肉膏蛋白胨培养基400mL，分装在两个三角瓶中；取9支试管，每支试管加9mL蒸馏水。
将牛肉膏蛋白胨培养基与装有蒸馏水的试管及21个平板一起灭菌，121℃维持20min。
牛肉膏蛋白胨培养基的配方（每1000mL）为：
牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂4.4g，水1000mL，pH=7.0~7.2。
2.3.2美蓝还原酶试验法测定牛乳质量
（1）取三支无菌试管，标记为1号、2号和3号，1号试管加入10mL亚奥特鲜牛奶，2号、3号试管分别加入10mL亚奥特纯牛奶，1号、2号试管分别加入1mL美蓝溶液，分别加棉塞塞紧。
（2）轻轻摇动试管，置于37℃水浴锅中温浴，记录开始时间；
（3）试管在水浴锅中稳定5min后取出，轻轻摇动后再放回水浴锅；
（4）每隔30min取出试管观察美蓝与牛乳混合液颜色变化，直至3-6h，记录试管中牛乳4/5变白时的时间。
2.3.3巴氏消毒法消毒牛乳
（1）将亚奥特鲜牛奶摇匀，使其中的微生物充分混匀；
（2）取一支无菌试管，标记A，加亚奥特鲜牛奶5mL；
（3）将A试管置于80℃水浴锅中，使水面超过试管内牛乳液面，保持15min，不断摇动试管使加热均匀；
（4）加热至15min时立即取出试管，用流水冲洗试管外壁，使牛乳迅速冷却；
2.3.4标准平板计数法检测牛乳中细菌数
（1）将亚奥特鲜牛奶摇匀，使其中的微生物充分混匀；
（2）取一支无菌试管，标记B，加亚奥特鲜牛奶5mL；
（3）摇匀A、B试管中牛乳，从A试管中吸取1mL牛乳用无菌水稀释，稀释度依次为10-2，10-3，10-4；从B试管中吸取1mL牛乳用无菌水稀释，稀释度依次为10-3，10-4，10-5。
（4）取21个无菌平板并标明稀释度、溶液名称（消毒前牛乳、消毒后牛乳和无菌水），其中分别取不同梯度的牛乳各1mL依次注入相应标记的平板，每个梯度做三个平行；取无菌水1mL注入平板，做三个平行；
（5）取出灭菌后的牛肉膏蛋白胨培养基，用微波炉熔化为液体，冷却到45℃左右后摇匀，向21个平板中各加15mL，静置。
（6）待平板中培养基凝固后倒置，置于37℃培养箱中培养24h；
（7）选择菌落数为30-300左右的平板计数，计算每毫升牛乳中细菌数。
3结果与分析
3.1试验结果
3.1.1美蓝还原酶试验法结果见表1。
表1美蓝还原酶试验法结果
Table1theresultsofmethylenebluereductasetest
1号试管
2号试管
3号试管
还原时间/min
95
185
——
牛乳等级
差
中等
——
注：
表格中“——”表示无数据。
3.1.2标准平板计数法结果见表2。
表2标准平板计数法结果
Table2theresultsofthestandardplatecountingmethod
溶液
10-2
10-3
10-4
10-5
每毫升牛乳中细菌数
消毒后牛乳
1
87
10
1
9833
2
83
12
1
3
86
10
0
消毒前牛乳
1
——
——
——
——
2
——
——
——
3
——
——
——
无菌水
1
——
——
2
——
3
——
注：
表格中“——”表示未获得数据。
3.2分析
3.2.1美蓝还原试验法
1号试管还原时间为95min，所以牛乳质量为“差”；2号试管还原时间为185min，故牛乳质量为“中等”。
3号试管未加美蓝溶液，作为观察颜色变化的对照。
3.2.2标准平板计数法
1mL巴氏消毒法消毒之后的牛乳中根据三个梯度测得的细菌数为9833个/mL。
说明生鲜牛乳必须经过巴斯德消毒后才可饮用。
未经消毒的牛乳未长菌落，具体原因见讨论部分。
4讨论
美蓝还原酶试验法和标准平板技术法是牛乳中细菌数检测中较为准确、直观的方法。
其中，美蓝还原酶试验法可以定性检测牛乳质量。
其原理是，美蓝作为一种氧化还原指示剂，可在厌氧条件下被还原为无色，如果牛乳中有细菌，其中的活的好氧和兼性厌氧菌通过呼吸作用消耗氧气，造成牛乳中溶氧下降，形成厌氧环境，氧化-还原点位降低，使美蓝还原为无色美蓝[3~4]。
牛乳中细菌数越多，呼吸作用越旺盛，消耗氧气越多，厌氧环境越严格，还原时间越短，因此可依据还原时间的长短判断牛乳的质量等级。
目前通过美蓝还原法检测牛乳质量的一般标准是：
还原时间在30min之内的，质量为“很差”，为四级奶；还原时间为30min-2h的，质量为“差”，为三级奶；还原时间为2-6h的，质量为“中等”为二级奶；还原时间为6-8h的，质量为“好”为一级奶[5]
标准平板菌落计数法是测定细菌数的经典方法，可以定量检测牛乳中细菌数量，从而直接判断牛乳质量。
该方法依据的原理是单个细菌在合适的培养条件下可长成菌落，通过系列稀释使细菌浓度降低，并可以充分分散为单个细菌，经合适培养后，每个细菌都长成肉眼可见的菌落。
待菌落长成后，通过统计菌落数并计算每毫升牛乳中的细菌数，从而判断牛乳的质量。
我国消毒牛乳的卫生标准是，用标准平板计数法检查，规定细菌总数小于30000个/mL[6]。
巴斯德消毒法是牛乳进行消毒普遍采用的方法，在牛乳分装之前消毒生奶，确保细菌相对较少，能消灭牛奶中的病原菌和有害微生物，但不破坏牛奶的营养成分，并保持其物理性质，多用于食品消毒，保持食品风味。
巴斯德消毒法是一种温和的加热工艺，在实际应用中加热消毒的范围较广，一般在63~90℃之间视消毒时间而定，主要方法有：
63℃保持30min，或者是80℃保持15min，90℃保持5min。
本次试验即验证了该消毒方法的消毒效果，通过在80℃下保持15min然后用标准平板计数法检查细菌数，验证了巴斯德消毒法的可靠性，也说明生鲜牛乳必须经过巴斯德消毒法才符合卫生标准的要求，才能分装、饮用。
在本次试验中仍出现了一些问题，主要表现在以下方面：
第一，在美蓝还原酶试验中，未验证美蓝溶液是否变质失效。
美蓝溶液变质后可能会影响还原时间的长短，甚至无法测得实验数据。
第二，在美蓝还原酶试验中，检查美蓝是否变色的时间间隔设定为30min，使得试验结果可能存在较大误差。
但缩短时间后，就意味着需要频繁取出试管，对温水浴效果有影响。
根据本次试验的结果，在尽量缩小误差且不影响温水浴效果的前提下，建议将时间间隔缩短为15min。
由于时间原因，本次试验并未验证15min的时间间隔是否确实符合试验要求。
第三，在标准平板计数法测细菌数试验中，在试验设计初，没有设置空白对照，即用1mL无菌水代替消毒后和消毒前的牛乳，加15mL左右牛肉膏蛋白胨培养基，在相同条件下培养，进行菌落计数。
只有通过空白对照试验，才能确定无菌水、培养基、操作过程、操作中使用的仪器是否染菌，是否对试验结果有影响。
根据严格的试验要求，应设置该对照试验，并且只有在对照组中严格不长菌落的前提下才能确保整个操作过程属于无菌操作。
第四，在标准平板计数法测定细菌数试验中，在试验设计初，未消毒牛乳细菌数测定时，每个稀释度牛乳稀释液的总量是5mL，使得后续操作中用移液枪无法吸出1mL稀释液。
为确保试验有序进行，每个试管中稀释液总量应该是10mL。
第五，在标准平板计数法测定细菌数试验中，消毒后的牛乳在进行计数时发现平板上没有长菌。
培养平板不长菌的可能原因有：
（1）培养基种类不适合对应菌种的生长；
（2）培养基配置过程中出现问题，如配料变质、配料用量错误、没有调节合适的pH；（3）培养条件不适合菌种生长，如培养温度、培养时间；（4）操作中酒精误入培养基，使菌种致死；（5）在加入培养基时，没有冷却到45℃左右，培养基温度过高，导致菌种死亡；（6）含菌样品的问题，比如样品无菌、样品细菌浓度低而稀释度过大。
在本次试验中可能成立的原因为琼脂变质、pH调节不准确、加培养基时温度过高。
可以通过重复试验、对照试验、显微镜检查来确定具体原因。
由于时间关系，本次试验未进一步确定原因。
第六，在进行菌落计数前没有对培养平板进行拍照，使得试验数据可信度降低。
对试验结果进行拍照，一方面可以保留试验初始数据，另一方面可以作为试验结果存在的证明。
由于以上问题的存在，在严格意义上讲，本次试验是失败的。
通过对试验数据的分析，可初步确定本次试验的试验结果是合理的，能够初步达到目的。
5结论
美蓝还原酶试验法和标准平板技术法都可以用作牛乳中细菌数的检测。
美蓝还原酶试验法操作简便，对仪器和设备要求低，出现结果所需时间短，可定性检测牛乳质量。
。
标准平板计数法所需试验周期长，对仪器设备要求高，操作相对复杂，但可以定量检测牛乳中细菌数目，而且可以设置多组平行，具有较高的重复性，提高检测准确度。
牛乳因其富含蛋白质且容易吸收而被人们食用，但也正是因为牛乳营养丰富，细菌极易大量繁殖，巴斯德消毒法是一种对牛乳消毒的可靠方法。
本次试验也证明，生鲜牛乳必须经过巴斯德消毒才能确保牛乳中细菌数控制在国家卫生标准范围内。
牛乳常用的消毒方法还有超高温瞬时杀菌法，实在湿热温度135~150℃时维持3~5s，在很短的时间内，牛奶的营养物质不会被破坏，但能有效杀死微生物。
目前，针对牛乳中细菌的检测在美蓝还原酶试验法和标准平板计数法两种经典方法的基础上又有研究人员设计出新的方法，如多重PCR检测技术在牛乳细菌检测中的应用[7]。
同时，以牛乳为主要原料，通过接种保加利亚乳杆菌、乳酸链球菌、嗜热链球菌等菌种，经发酵使牛乳中的蛋白质凝结成块而制成酸乳，由于菌种迅速生长繁殖，菌体及其代谢产物大量增加，尤其是所含的乳酸等有机酸可以改善肠道菌群，抑制致病菌的生长，还具有增强免疫、刺激肠胃蠕动、阻碍对铅的吸收等功能[8]。
综上，牛乳制品的安全生产关系到国民体质与健康，对牛乳进行巴斯德消毒法处理并进行细菌学检查十分必需。
同时研究新的、更加方便准确的检测方法也是一个研究方向。
参考文献
[1][2][5][6][8]沈萍,陈向东.微生物学实验.北京:
高等教育出版社,2007:
215-278.
[3]周群英,高群耀.环境微生物学.北京:
高等教育出版社,1998:
188-196.
[4]周德庆.微生物学教程.北京:
高等教育出版社,2005:
362-368.
[7]王华,刘斌.PCR技术在食品微生物学中的应用.生物技术通报,2010
（2）.
时间：
2021.02.11
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