小型猪皮下埋羊肠腺减脂及其机理研究报告doc.docx

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小型猪皮下埋羊肠腺减脂及其机理研究报告

1.实验目的

通过皮下埋羊肠腺对小型猪外观形态学、皮下脂肪组织、激素敏感酯酶（HSL）、乙酰辅酶A（ACC）、血清甘油三酯、胆固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、机体瘦素（Lepin）和神经肽Y（NPY）含量影响，探究皮下埋羊肠腺减肥作用及其机理。

2.实验材料

小型猪（贵州香猪），普通级，体重28-32kg，由成都达硕生物科技有限公司提供，实验动物合格证号：

scxk（111）2008-24。

3.实验仪器，试剂

手术针械，Φ0.25x25mm，苏州医疗用品厂生产

电子天平FA1004，上海良平仪器仪表有限公司生产

非接触式红外额温计UT300E，厦门特利尔电子科技有限公司生产

RT-PCR反应试剂盒，E10J0405，大连TaTkRa公司

紫外分光光度计，UV-1700，美国Beckman公司

PCR扩增仪，BioRad-MyCycler，美国Bio-Rad公司

切片机，徕卡-2015，德国

TSJ-Q型全自动封闭式组织脱水机，ZHB1－12V－1.5，常州市中威医疗仪器有限公司

BMJ-Ⅲ型包埋机，TKY-BMB，常州市中威医疗仪器有限公司

PHY-Ⅲ型病理组织漂烘仪，ZMN-6802，常州市中威医疗仪器有限公司

MoticBA400显微摄像系统，麦克奥迪公司

Image-ProPlus图像分析系统，MediaCybernetics,Inc.

冰乙酸（AR级），批号：

20110709，规格：

500ml/瓶，成都科龙化工试剂厂生产；

甲醛（AR级），批号：

20110813，规格：

500ml/瓶，成都科龙化工试剂厂生产。

配制方法：

分别量取95％乙醇663ml、甲醛90ml、冰乙酸45ml倒入烧杯中，再向其中加人纯化水102ml；充分混匀即可。

脱水试剂：

95％乙醇（AR级），批号：

20111008，规格：

25L/桶，成都科龙化工试剂厂生产；

无水乙醇（AR级），批号：

20111025，20110304，规格：

500m1/瓶，成都科龙化工试剂厂生产。

配制方法：

取95％乙醇用纯化水稀释配成70％、80％和90％乙醇溶液。

透明试剂：

二甲苯（AR级），批号：

20111023，规格500ml/瓶，成都科龙化工试剂厂生产.

封片试剂；中性树胶，规格：

100g/瓶，批号：

20110730，中国上海懿洋仪器有限公司。

盖玻片清洗液：

重铬酸钾：

（AR级），批号：

20110620，规格：

500g/瓶，成都市科龙化工试剂厂生产；

浓硫酸：

（AR级），批号：

20110714，规格：

500ml/瓶，成都市科龙化工试剂厂生产。

配制方法：

取纯化水500m1，加入重铬酸钾50.112g，搅拌、溶解、混匀，再向其中缓慢加入浓硫酸50ml，搅拌混匀即可。

3.实验动物分组

动物适应性喂养一周后，按体重随机分为针刺组（假手术组）、埋羊肠腺组和空白对照组。

动物原始体重，身长，腰围，胸围见表-1。

表-1动物分组原始数据

编号性别组别体重（kg）身长（cm）腰围（cm）胸围（cm）

1#2-1♂针刺组28.082.081.068.0

2#1-1♂埋羊肠腺组28.080.081.567.5

3#2-2♂针刺组27.581.081.566.0

4#1-2♀埋羊肠腺组27.580.080.066.5

5#3-1♀空白组27.080.080.066.0

4.施针方法

小型猪背部皮下脂肪针刺，埋羊肠腺。

5.观察项目

5.1一般观察

各组动物实验期间均用普通饲料喂养，自由摄食和饮水，针刺组和埋羊肠腺组动物分别于实验第1、3、7天针刺埋羊肠腺各一次。

实验期间观察大鼠的体重、体长、Lee’s指数〔

×103/体长〕、腰围、胸围等。

5.2体温检测兽用非接触型体温计测定动物体表温度。

5.3动物血脂检测

分别于施针第1、3、7天各组动物采血一次：

5ml一次性注射器耳缘静脉取血，3000r·min-1离心，收集血清，检测甘油三酯、胆固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白含量。

5.4脂肪组织HSL和ACC检测

实验第八天，禁食过夜，各实验组动物次日第一批处死，迅速剖取腹部脂肪，Eleasa方法测定脂肪组织HSL和ACC含量。

停针一周后，即实验第14天，处死剩余动物，剖取腹部脂肪，Eleasa方法测定脂肪组织HSL和ACC含量。

5.5机体瘦素（Lepin）和神经肽Y（NPY）免疫组织化学检测

剖取全脑和肝脏，置于液氮中保存，将每组动物次日取出全脑置于冰碟上分离出下丘脑，置玻璃匀浆管中加1NHCl1ml，在冰浴中充分匀浆，室温放置100min，4℃离心20min（4000rpm），取上清加入1NNaoH1ml中和酸，离心10min（4000rpm），取上清（即下丘脑组织匀浆）-20℃保存待测。

同样按上述方法制备肝脏组织匀浆液。

用免疫组织化学方法分别测定小丘脑和肝脏组织中瘦素（Lepin）和神经肽Y（NPY）含量。

5.6RT-PCR检测下丘脑NPY表达量

5.6.1引物、试剂、仪器：

NPY和β-action引物序列见表-2.RT-PCR反应试剂盒（大连TaTkRa）。

紫外分光光度计（美国Beckman公司），PCR扩增仪（美国Bio-Rad公司）。

表-2目标基因和β-action引物

基因名称

引物

扩增产物（bp）

NPY

上游引物5’-CTGCTGTTGGTCCCATTGCT-3’

下游引物3’-GCCTTTACTTCCGTCATAGTG-5’

110

β-action

上游引物5’-CGTTGACATCCGTAAAGACCTC-3’

下游引物5’-TAGGAGCCAGGGCAGTAATCT-3’

230

5.6.2脂肪组织细胞总RNA抽提

采用Trizol一步法抽提各组动物脂肪组织细胞NPYRNA，用紫外分光光度计测定其总RNA的浓度及纯度，筛选OD260/OD280的比值在1.8～2.0之间的样品，计算每份样品的浓度，将全部样品的浓度都配成统一的50ng/μL。

5.6.3逆转录按逆转录试剂盒的操作说明进行，将上述抽提的RNA逆转录成cDNA。

5.6.4RT-PCR选择目的基因NPY，作为标准品建立标准曲线，得到样品中相应目的基因的Copy数;同时以管家基因β-actin作为内参建立标准曲线，得到样品中管家基因的Copy数，将目的基因和管家基因的Copy数进行校准，最后得到的Copy数即为目的基因的定量。

反应体系为SYBRqPCRmix12.5μl，引物（2.5pmol/μl）2μl，去离子水8μl，cDNA（适度稀释）2.5μl，总体系25μl，扩增条件：

95℃预变性1min，设计PCR循环程序，95℃变性15s，复性15s，72℃延伸45s，共40个循环。

然后72℃延伸5min，4℃保存备用，85℃单点荧光检测。

5.6.5结果分析反应结束后，使用SequenceDetectionsoftwareversion1.2.3软件（AppliedBiosystems公司）分析PCR过程各检测样本的CT（Thresholdcycle）值。

CT值的含义是每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。

每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小。

本研究通过2-△△CT计算NPY相对mRNA表达水平：

△CTintervention=CTinterventionNPY-CTinterventionβ-actin，△CTblank=CTblankNPY-CTblankβ-actin，△△CT=△CTintervention-△CTblank

NPYmRNA表达差别倍数以2-△△CT表示。

由熔解曲线判断PCR反应的特异性。

5.7HE切片

取腹部脂肪一小块，用2.5%甲醛乙醇溶液固定，石蜡切片，在400倍显微镜下计数全视野中脂肪细胞个数，并用测微器测定脂肪细胞大小。

5.8统计处理

实验数据用SPSS软件进行分析，组间比较采用t检验，相关分析采用多元相关分析。

6.实验结果

6.1动物体重、体长、Lee’s指数〔

×103/体长，腰围，胸围测定值（

±s）。

实验结果见表-3。

表-3动物身体指数

组别动物数量（头）

体重（kg）

身长（cm）Lee’s指数腰围胸围

针刺组229.17±1.345381.45±0.5188377.94±1.258982.14±2.411866.48±1.1201

埋羊肠腺组226.99±0.722180.00±0.0000374.95±1.224579.11±2.274565.81±1.1429

空白对照组128.28±1.169180.00±0.0000380.84±0.998680.46±0.676766.18±0.7050

6.2.动物体温测定值（℃，

±s））。

实验结果见表-4。

表-4实验动物体温值

组别动物数量（头）

1st埋线

2st埋线3st埋线停针后

针刺组238.90±0.000038.90±0.141439.00±0.000038.90±0.1414

埋羊肠腺组239.00±0.000038.85±0.212138.95±0.070738.95±0.0707

空白对照组139.00±0.000039.00±0.000038.90±0.000038.70±0.0000

6.3血脂含量测定值

表-5显示，埋羊肠腺施针可显著降低血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）含量、升高高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）含量。

实验结果见表-5。

表-5埋羊肠腺对动物血脂含量影响

组别动物数量（头）

胆固醇

甘油三酯低密度脂蛋白高密度脂蛋白

针刺组24.09±0.661.330±0.143.02±0.441.90±0.31

埋羊肠腺组23.82±080*△1.25±0.20**△△2.89±0.60*△2.05±0.53**△

空白对照组14.14±0.731.30±0.293.06±0.621.88±0.60

与空白组比较，**P<0.01，*P<0.05；与针刺组比较，△△P<0.01，△P<0.05

6.4细胞因子HSL、乙酰辅酶AEleasa测定值（

±s）

由表-6埋羊肠腺施针可显著升高激素敏感酯酶和乙酰辅酶A含量，进而促进机体脂质代谢。

实验结果见表-6。

表-6HSL和乙酰辅酶A测定结果

组别动物数量（头）

HSL

乙酰辅酶A

7d14d

7d14d

针刺组2321.32±49.5758320.43±54.62761.1997±0.28891.4103±0.2619

埋羊肠腺组2516.63±65.6848**△△525.66±45.6026**△△1.7265±0.2230**△△1.7408±0.2247*△

空白对照组1327.70±53.2438336.51±45.77941.0793±0.22341.1583±0.2067

与空白组比较，**P<0.01，*P<0.05；与针刺组比较，△△P<0.01，△P<0.05

6.5瘦素（Leptin）和神经肽（NPY）免疫组织化学检测

由表-7可知，埋羊肠腺施针可显著升高脂肪组织瘦素含量，降低下丘脑神经肽含量，促使机体减少摄食，增加能量释放，抑制脂肪细胞的合成。

Leptin和NPY积分光密度测定结果见表-7

表-7Leptin和NPY积分光密度

组别

Leptin

NPY

针刺组

埋羊肠腺组

空白对照组

与空白组比较，**P<0.01，*P<0.05；与针刺组比较，△△P<0.01，△P<0.05

6.6神经肽（NPY）荧光定量PCR

由表-8可知，埋羊肠腺可显著降低小型猪脂肪组织中NPYmRNA表达，各组动物脂肪组织细胞中NPYmRNA表达量见表-8。

NPYmRNA扩增曲线见图-1.

表-8各组动物脂肪组织细胞中NPYmRNA表达量。

组别标本量（个）2-△△CT

正常组41.73215±0.2245

针刺组组41.56982±0.2102

埋羊肠腺组40.89695±0.1900**

注：

与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01

图-1NPYmRNA扩增曲线

6.7脂肪组织HE切片

7.实验结论

7.1埋羊肠腺施针可显著降低血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）含量、升高高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）含量。

单纯性肥胖患者多因不健康的饮食习惯致使三餐进食比例和饮食结构不合理，加之体力劳动减少，体态臃肿、懒散少动，热量}肖耗明显减少，脂肪在体内蓄积而不断增重并伴有血脂代谢异常。

胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL-C）超过正常或同时高密度脂蛋白（HDL-C）低下称为血脂异常，它较为全面、准确地反映了血脂代谢紊乱状态。

过多的脂质在动脉内壁沉积，形成粥样硬化斑，造成心、脑等靶器官供血减少乃至损害，所以减重在预防和治疗血脂异常进而演变成的高脂血症中非常关键。

本研究发现，埋羊肠腺施针法可以明显降低肥胖者血脂中TC、TG和LDL-C水平，明显升高HDL-C水平，调整机体脂质代谢。

7.2埋羊肠腺施针可显著升高激素敏感酯酶和乙酰辅酶A含量，进而促进机体脂质代谢。

激素敏感性脂肪酶（HSL）是脂肪分解的限速酶，能水解甘油三酯（TG）、甘油二酯（PG）、甘油一酯、胆固醇酯和其他脂质及水溶性底物，产生甘油和脂肪酸。

它主要存在于脂肪组织。

它最主要的作川是在脂肪组织中发挥其水解酰基甘油的能力、释放脂肪酸为机体提供能量，并被长期认为是TG水解的限速酶。

HSL缺乏引起脂质合成和分解的酶、相关因子及脂肪激素表达的改变，从而影响脂质代谢。

乙酰辅酶A是能源物质代谢的重要中间代谢产物，在体内能源物质代谢中是一个枢纽性的物质。

糖、脂肪、蛋白质三大营养物质通过乙酰辅酶A汇聚成一条共同的代谢通路——三羧酸循环和氧化磷酸化，经过这条通路彻底氧化生成二氧化碳和水。

本研究显示，埋羊肠腺施针法可显著升高脂肪组织HSL和乙酰辅酶A含量，提示埋羊肠腺法可通过升高HSL和乙酰辅酶A含量加速局部脂肪代谢分解而达到减肥效果。

7.3埋羊肠腺施针可显著升高脂肪组织瘦素含量，降低下丘脑神经肽含量

NPY是一个36个氨基酸的肽，广泛分布于中枢和外周神经系统。

许多证据表明NPY在体重调节中起到重要的作用，NPY最主要的作用是增加食物的摄入，降低饱食动物的产热效应。

促摄食的NPY神经元起源于弓状核，投射到室旁核，释放的NPY在室旁核与NPY的Y1和Y5受体结合，引发强的摄食反应，并影响能量支出，这种作用在外周可能是通过调节交感神经和副交感神经完成的。

瘦素（Leptin，LP）是由分泌的一种肽类激素，是一种由脂肪组织分泌的激素，Leptin通过作用于ARC上的OB-R抑制NPY的合成与分泌，达到抑制进食、减少体脂的目的。

瘦素的功能是多方面的，主要表现在对脂肪及体重的调控：

1）抑制食欲：

瘦素可使人类进食明显减少，体重和体脂含量下降；2）增加能量消耗：

瘦素可作用于中枢，增加交感神经活性，使大量贮存的能量转变成热能释放；3）对脂肪合成的影响：

瘦素可直接抑制脂肪合成，促进其分解，也有人认为可促进脂肪细胞成熟；

本研究显示，埋羊肠腺施针法可显著升高脂肪组织瘦素含量，降低下丘脑神经肽含量，进而干预下丘脑饱食中枢调控动物的摄食行为和脂肪代谢，起到减肥效果。

7.4埋羊肠腺施针法可显著抑制下丘脑NPY神经肽表达

NPY自1982年由Tatermato首次从猪脑中分离得到以后，人们对它的生物学功能进行了广泛的研究，发现NPY具有促进动物采食，影响激素分泌，调节体温、生物节律、性行为及情绪等作用。

抑制NPY的内分泌会使食物摄入下降，国外研究表明无论动物在饱腹或饥饿状态下，NPY注射到脑室均可刺激动物采食。

NPY是调节体重的一个关键物质，NPY抑制剂则可能成为有效的控制肥胖的药物。

本研究显示，埋羊肠腺施针法可显著抑制下丘脑NPY神经肽表达，进而抑制下丘脑组织对葡萄糖的利用和降低脂蛋白酯酶活性。

7.5病理切片结论