实验一二 培养基配制与微生物测定与观察小学期实验.docx
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实验一二培养基配制与微生物测定与观察小学期实验
实验一培养基的配制与灭菌
一、 实验目的
1、了解培养基的配制原理。
2、掌握培养基配制的一般方法和步骤。
3、掌握培养基灭菌的方法。
二、 实验原理
培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。
由于微生物具有不同的营养类型,对营养物质的要求也各不相同,加之实验和研究的目的不同,所以培养基的种类很多,使用的原料也各有差异,但从营养角度分析,培养基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、无机盐、生长素以及水分等。
另外,培养基还应具有适宜的pH值、一定的缓冲能力、一定的氧化还原电位及合适的渗透压。
琼脂是从石花菜等海藻中提取的胶体物质,是应用最广的凝固剂。
加琼脂制成的培养基在98~100℃下融化,于45℃以下凝固。
但多次反复融化,其凝固性降低。
任何一种培养基一经制成就应及时彻底灭菌,以备纯培养用。
一般培养基的灭菌采用高压蒸汽灭菌。
牛肉膏蛋白胨培养基配方:
牛肉膏3.0g
蛋白胨10.0g
NaCl5.0g
水1000mL
pH7.4-7.6
三、 材料
1、器皿及材料
天平、称量纸、牛角匙、精密pH试纸(pH5.5~9.0)、量筒、刻度搪瓷杯、试管、三角瓶、移液器及枪头、培养皿、玻璃棒、烧杯、试管架、剪刀、酒精灯、封口膜、线绳或皮筋、灭菌锅、干燥箱等、超净工作台等。
2、药品试剂
蛋白胨、牛肉膏、NaCl、琼脂、1mol/LNaOH、1mol/LHCl等。
四、 流程
称药品→溶解→调pH值→融化琼脂→过滤分装→包扎标记→灭菌→倒平板。
五、步骤
牛肉膏蛋白胨培养基配制方法:
1、称量
按培养基配方比例依次推确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCL放人烧杯中。
牛肉膏常用玻棒挑取,放在小烧杯或表面皿中称量,用热水溶化后倒入烧杯,也可按在称量纸上,称量后直接放入水中,这时如稍微加热,牛肉膏便会与称量纸分离,然后立即取出纸片。
蛋白胨很易吸湿,在称取时动作要迅速。
另外,称药品时严防药品混杂,一把牛角匙用于一种药品,或称取一种药品后,洗净,擦干,再称取另一药品。
瓶盖也不要盖错。
2、溶化
在上述烧杯中先加入少于所需要的水量,用玻棒搅匀,然后,在石棉网上加热使其溶解。
将药品完全溶解后,补充水到所需的总体积,如果配制固体培养基时,将称好的琼脂放入己溶的药品中,再加热溶化,最后补足所损失的水分。
在琼脂溶化过程中,应控制火力,以免培养基因沸腾而溢出容器。
同时.需不断搅拌.以防琼脂糊底烧焦。
配制培养基时,不可用铜或铁锅加热溶化,以免离子进入培养基中,影晌细菌生长。
3、调pH
在未调pH前,先用精密pH试纸测量培养基的原始pH,如果偏酸,用滴管向培养基中逐滴加入1mol/LNaOH,边加边搅拌,并随时用pH试纸测其pH,直至pH达7.4-7.6。
反之,用1mol/LHCI进行调节。
对于有些要求pH较精确的微生物,其pH的调节可用酸度计进行。
pH不要调过头,以避免回调而影响培养基内各离子的浓度。
配制pH低的琼脂培养基时,若预先调好pH并在高压蒸气下灭菌,则琼脂因水解不能凝固。
因此,应将培养基的成分和琼脂分开灭菌后再混合,或在中性pH条件下灭菌,再调整PH。
4、过滤
趁热用滤纸或多层纱布过滤,以利某些实验结果的观察。
一般无特殊要求的情况下可以省去(本实验勿需过滤)。
5、分装
按实验要求,可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内。
(1)液体分装:
分装高度以试管高度的l/4左右为宜。
分装三角瓶的量则根据需要而定,一般以不超过三角瓶容积的一半为宜,如果是用于振荡培养用,则根据通气量的要求酌情减少;有的液体培养基在灭菌后,需要补加一定量的其他无菌成分,如抗生素等,则装量一定要准确。
(2)固体分装:
分装试管,其装量不超过管高的1/5,灭菌后制成斜面。
分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。
分装过程中,注意不要使培养基沾在管(瓶)口上,以免引起污染。
6、 包扎标记
培养基分装完毕后,在试管口或三角瓶口上塞上棉塞(或封口膜及试管帽等)用皮筋或棉绳系好,同时将全部试管用麻绳捆好。
用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期等。
7、灭菌
将上述培养基在121℃条件下,高压蒸气灭菌20min。
8、倒平板
将需倒平板的培养基,在超净工作台中倒平板。
每个平板倒15-20ml培养基。
9、无菌捡查
将灭菌培养基放人37℃的温室中培养24—48h,以检查灭菌是否彻底。
六、实验报告
1.实验结果及讨论
针对实验原理、步骤、现象进行讨论。
2、思考题
(1)制备培养基的一般程序是什么?
(2)做过本次实验后,你认为在制备培养基时要注意些什么问题?
(3)培养基配好后,为什么必须立即灭菌?
如何检查灭菌后的培养基是无菌的
(4) 高压蒸汽灭菌时应注意哪些事项?
实验二水中和人体表面细菌总数测定
一、目的要求/L
1.证明水体与人体表面存在微生物。
2.比较来自不同场所与不同条件下细菌的数量和类型。
3.体会无菌操作的重要性。
二、基本原理
平板培养基含有细菌生长所需要的营养成分,当取自不同来源的样品接种于培养基上,在37℃温度下培养,1—2天内每一菌体即能通过很多次细胞分裂而进行繁殖,形成一个可见的细胞群体的集落,称为菌落。
每一种细菌所形成的菌落都有它自己的特点,例如菌落的大小,表面干燥或湿润、隆起或扁平、粗糙或光滑,边缘整齐或不整齐,菌落透明或半透明或不透明,颜色以及质地疏松或紧密等。
因此,可通过平板培养来检查环境中细菌的数量和类型。
三、器材
肉膏蛋白胨琼脂平板,无菌水,灭菌涂布棒,移液器和枪头、试管架,酒精灯,打火机、记号笔,废物缸。
四、操作步骤
每组在“水体”和“人体”两大部分中各选择一个内容做实验,或由教师指定分配,最后结果供全班讨论。
1.写标签
任何一个实验,在动手操作前均需首先将器皿用记号笔做上记号,培养皿的记号一般写在皿底上。
如果写在皿盖上,同时观察两个以上培养皿的结果,打开皿盖时,容易混淆。
用记号笔写上班级、姓名、日期,本次实验还要写上样品来源(如自来水或头发等),字尽量小些,写在皿底的一边,不要写在当中,以免影响观察结果。
2.水中细菌测定
(1)水样的采取
(a)自来水先将自来水龙头用火焰烧灼3min灭菌,再开放水龙头使水流5min后,以灭菌三角烧瓶接取水样,以待分析。
(b)池水、河水或湖水应取距水面l0~15cm的深层水样,先将灭菌的带玻璃塞瓶,瓶口向下浸入水中,然后翻转过来,除去玻璃塞,水即流入瓶中,盛满后,将瓶塞盖好,再从水中取出,最好立即检查,否则需放入冰箱中保存。
(2)细菌总数测定
(a)自来水
①用灭菌吸管吸取lml水样,注入灭菌培养皿中。
共做两个平皿。
②分别倾注约15mL己溶化并冷却到45℃左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基,并立即在桌上作平面旋摇,使水样与培养基充分混匀。
③另取一空的灭菌培养皿,倾注肉膏蛋白胨琼脂培养基15mL作空自对照。
④培养基凝固后,倒置于37℃温箱中,培养24h,进行菌落计数。
⑤两个平板的平均菌落数即为lml水样的细菌总数。
(b)池水、河水或湖水等
①稀释水样取3个灭菌空试管,分别加入9ml灭菌水。
取lml水样注入第一管9ml灭菌水内、摇匀,再自第一管取1ml至下一管灭菌水内,如此稀释到第三管,稀释度分别为10-1、10-2与10-3。
稀释倍数看水样污浊程度而定,以培养后平板的菌落数在30~300个之间的稀释度最为合适,若三个稀释度的菌数均多到无法计数或少到无法计数,则需继续稀释或减小稀释倍数。
一般中等污秽水样,取10-1、10-2、10-3三个连续稀释度,污秽严重的取10-2、10-3、10-4三个连续稀释度。
②自最后三个稀释度的试管中各取lmL稀释水加入空的灭菌培养皿中,每一稀释度做两个培养皿。
③各倾注15-20ml已溶化并冷却至45℃左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基,立即放在桌上摇匀。
④凝固后,倒置于37℃培养箱中培养24h。
(3)菌落计数方法
(a)先计算相同稀释度的平均菌落数。
若其中一个平板有较大片状菌苔生长时,则不应采用,而应以无片状菌苔生长的平板作为该稀释度的平均菌落数。
若片状菌苔的大小不到平板的一半,而其余的一半菌落分布又很均匀时,则可将此一半的菌落数乘2以代表全平板的菌落数,然后再计算该稀释度的平均菌落数。
(b)首先选择平均菌落数在30-300之间的,当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时,则以该平均菌落数乘其稀释倍数即为该水样的细菌总数(见表)。
(c)若有两个稀释度的平均菌落数均在30~300之间,则按两者菌落总数之比值来决定。
若其比值小于2,应采取两者的平均数;若大于2,则取其中较小的菌落总数(见表)。
(d)若所有稀释度的平均菌落数均大于300,则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数(见表)。
(e)若所有稀释度的平均菌落数均小于30,则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数(见表)。
(f)若所有稀释度的平均菌落数均不在30~300之间,则以最近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数(见表)。
表计算菌落总数方法举例
例次
不同稀释度的平均菌落数
两个稀释度菌落数之比
菌落总数
(个/ml)
备注
10-1
10-2
10-3
1
1365
164
20
-
16400或1.6×104
两位以后的数字采取四舍五入的方式去掉
2
2760
295
46
1.6
37750或3.8×104
3
2890
271
60
2.2
27100或2.7×104
4
无法计数
1650
513
-
513000或5.1×105
5
27
11
5
-
270或2.7×102
6
无法计数
305
12
-
30500或3.1×104
3.人体表面细菌测定
(1)手指(洗手前与洗手后)
(a)分别在两个琼脂平板上标明洗手前与洗手后。
(b)移去皿盖,将未洗过的手指在琼脂平板的表面,轻轻地来回划线,盖上皿盖。
(c)用肥皂和刷子,用力刷手,在流水中冲洗干净,干燥后,在另一琼脂平板表面来回移动,盖上皿盖。
(2)头发
在揭开皿盖的琼脂平板的上方,用手将头发用力摇动数次,使细菌降落到琼脂平板表面,然后盖上皿盖。
(3)咳嗽
将去盖琼脂平板放在离口约6—8cm处,对着琼脂表面用力咳嗽,然后盖上皿盖。
4.培养
将所有的琼脂平板翻转,使皿底在上,放37℃培养箱,培养1—2天。
5.结果记录方法
(1)菌落计数:
如果菌落很多而重叠,则可数平板1/4面积内的菌落数。
(2)根据菌落大小、形状、高度、干湿等特征观察不同的菌落类型。
但要注意,如果细菌数量太多,会使很多菌落生长在一起,或者限制了菌落生长而变得很小,因而外观不典型,故观察菌落的特点时,要选择分离得很开的单个菌落。
菌落特征描写方法如下:
(a)大小大、中、小、针尖状。
可先将整个平板上的菌落粗略观察一下,再决定大、中、小的标准。
(b)颜色黄色、金黄色、灰色、乳白色、红色、粉红色等。
(c)干湿情况干燥、湿润、粘稠。
(d)形态圆形、不规则等。
(e)高度扁平、隆起、凹下。
(f)透明程度透明、半透明、不透明。
(g)边缘整齐、不整齐。
五、实验报告
1、结果
(1)将你自己的平板结果记录于下表中。
(2)与其他同学所做的结果进行比较。
2、思考题
(1)比较各种来源的样品,哪一种样品的平板菌落数与菌落类型最多?
(2)你所测的水源水的污秽程度如何?
从自来水的细菌总数结果来看,是否合乎饮用水的标准?
(3)洗手前后的手指平板,菌落数有无区别?
(4)通过本次实验,在防止培养物的污染与防止细菌的扩散方面,你学到些什么?
有什么体会?
实验三植物细胞和微生物形态观察
一、实验目的
1、认识细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的基本形态特征。
2、比较植物细胞与微生物细胞的差异。
二、基本描述
1、细菌基本形态观察
显微镜下观察金黄色葡萄球菌、八叠球菌装片。
。
观察枯草芽孢杆菌、变形杆菌、大肠杆菌装片。
观察螺菌装片。
注意菌体的螺旋。
2、霉菌的特征结构观察
观察黑根霉、曲霉、毛霉、青霉装片。
3、酵母菌的形态观察
观察酵母的形状和大小,出芽酵母形状和出芽方式。
4、植物细胞形态观察
三、作业
画出你在显微镜下观察到的植物细胞和微生物的形态,并注明放大倍数。
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以下为微生物形态
酵母菌
青霉属
黑根霉
菌落形态