实验一二 培养基配制与微生物测定与观察小学期实验.docx

1、实验一二 培养基配制与微生物测定与观察小学期实验实验一 培养基的配制与灭菌一、 实验目的 1、了解培养基的配制原理。2、掌握培养基配制的一般方法和步骤。3、掌握培养基灭菌的方法。 二、 实验原理 培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多，使用的原料也各有差异，但从营养角度分析，培养基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、无机盐、生长素以及水分等。另外，培养基还应具有适宜的pH值、一定的缓冲能力、一定的氧化还原电位及合适的渗透压。 琼脂是从石花菜等海藻中提取的胶体物质，是应用最广的凝固剂。加

2、琼脂制成的培养基在98100下融化，于45以下凝固。但多次反复融化，其凝固性降低。 任何一种培养基一经制成就应及时彻底灭菌，以备纯培养用。一般培养基的灭菌采用高压蒸汽灭菌。牛肉膏蛋白胨培养基配方：牛肉膏 3.0 g蛋白胨 10.0gNaCl 5.0g水 1000mLpH 7.4-7.6三、材料 1、器皿及材料 天平、称量纸、牛角匙、精密pH试纸(pH 5.59.0)、量筒、刻度搪瓷杯、试管、三角瓶、移液器及枪头、培养皿、玻璃棒、烧杯、试管架、剪刀、酒精灯、封口膜、线绳或皮筋、灭菌锅、干燥箱等、超净工作台等。 2、药品试剂 蛋白胨、牛肉膏、NaCl、琼脂、1 mol/LNaOH、1mol/LHC

3、l等。 四、流程 称药品溶解调pH值融化琼脂过滤分装包扎标记灭菌倒平板。 五、步骤 牛肉膏蛋白胨培养基配制方法：1、称量按培养基配方比例依次推确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCL 放人烧杯中。牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯，也可按在称量纸上，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。蛋白胨很易吸湿，在称取时动作要迅速。另外，称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净，擦干，再称取另一药品。瓶盖也不要盖错。2、溶化在上述烧杯中先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。将药品完全溶

4、解后，补充水到所需的总体积，如果配制固体培养基时，将称好的琼脂放入己溶的药品中，再加热溶化，最后补足所损失的水分。在琼脂溶化过程中，应控制火力，以免培养基因沸腾而溢出容器。同时需不断搅拌以防琼脂糊底烧焦。配制培养基时，不可用铜或铁锅加热溶化，以免离子进入培养基中，影晌细菌生长。3、调 pH在未调 pH 前，先用精密 pH 试纸测量培养基的原始pH，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入 1mol/L NaOH,边加边搅拌，并随时用 pH 试纸测其 pH，直至 pH 达 7.4-7.6。反之，用 1mol/L HCI进行调节。对于有些要求 pH 较精确的微生物，其 pH 的调节可用酸度计进行。pH

5、不要调过头，以避免回调而影响培养基内各离子的浓度。配制 pH 低的琼脂培养基时，若预先调好 pH 并在高压蒸气下灭菌，则琼脂因水解不能凝固。因此，应将培养基的成分和琼脂分开灭菌后再混合，或在中性 pH 条件下灭菌，再调整 PH。4、过滤趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利某些实验结果的观察。一般无特殊要求的情况下可以省去（ 本实验勿需过滤）。5、分装按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内。（1）液体分装：分装高度以试管高度的 l4 左右为宜。分装三角瓶的量则根据需要而定，一般以不超过三角瓶容积的一半为宜，如果是用于振荡培养用，则根据通气量的要求酌情减少；有的液体培养基在灭菌后，需要补加

6、一定量的其他无菌成分，如抗生素等，则装量一定要准确。（2）固体分装：分装试管，其装量不超过管高的 1/5，灭菌后制成斜面。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。分装过程中，注意不要使培养基沾在管(瓶)口上，以免引起污染。6、包扎标记 培养基分装完毕后，在试管口或三角瓶口上塞上棉塞（或封口膜及试管帽等）用皮筋或棉绳系好，同时将全部试管用麻绳捆好。用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期等。 7、灭菌将上述培养基在 121条件下，高压蒸气灭菌20min。8、倒平板 将需倒平板的培养基，在超净工作台中倒平板。每个平板倒15-20ml培养基。 9、无菌捡查将灭菌培养基放人 37的温室中培养 2

7、448h，以检查灭菌是否彻底。六、实验报告1实验结果及讨论针对实验原理、步骤、现象进行讨论。2、思考题（1）制备培养基的一般程序是什么？ （2）做过本次实验后，你认为在制备培养基时要注意些什么问题？ （3）培养基配好后，为什么必须立即灭菌?如何检查灭菌后的培养基是无菌的(4)高压蒸汽灭菌时应注意哪些事项？ 实验二 水中和人体表面细菌总数测定一、目的要求/L1证明水体与人体表面存在微生物。2比较来自不同场所与不同条件下细菌的数量和类型。3体会无菌操作的重要性。二、基本原理平板培养基含有细菌生长所需要的营养成分，当取自不同来源的样品接种于培养基上，在37温度下培养，12天内每一菌体即能通过很多次细

8、胞分裂而进行繁殖，形成一个可见的细胞群体的集落，称为菌落。每一种细菌所形成的菌落都有它自己的特点，例如菌落的大小，表面干燥或湿润、隆起或扁平、粗糙或光滑，边缘整齐或不整齐，菌落透明或半透明或不透明，颜色以及质地疏松或紧密等。因此，可通过平板培养来检查环境中细菌的数量和类型。三、器材肉膏蛋白胨琼脂平板，无菌水，灭菌涂布棒，移液器和枪头、试管架，酒精灯，打火机、记号笔，废物缸。四、操作步骤每组在“水体”和“人体”两大部分中各选择一个内容做实验，或由教师指定分配，最后结果供全班讨论。1写标签任何一个实验，在动手操作前均需首先将器皿用记号笔做上记号，培养皿的记号一般写在皿底上。如果写在皿盖上，同时观察

9、两个以上培养皿的结果，打开皿盖时，容易混淆。用记号笔写上班级、姓名、日期，本次实验还要写上样品来源（如自来水或头发等），字尽量小些，写在皿底的一边，不要写在当中，以免影响观察结果。2水中细菌测定（1）水样的采取（a）自来水 先将自来水龙头用火焰烧灼3min灭菌，再开放水龙头使水流5min后，以灭菌三角烧瓶接取水样，以待分析。（b）池水、河水或湖水 应取距水面l015cm的深层水样，先将灭菌的带玻璃塞瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出，最好立即检查，否则需放入冰箱中保存。（2）细菌总数测定 (a)自来水 用灭菌吸管吸取lml水样，注入灭

10、菌培养皿中。共做两个平皿。 分别倾注约15mL己溶化并冷却到45左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基，并立即在桌上作平面旋摇，使水样与培养基充分混匀。 另取一空的灭菌培养皿，倾注肉膏蛋白胨琼脂培养基15mL作空自对照。 培养基凝固后，倒置于37 温箱中，培养24h，进行菌落计数。 两个平板的平均菌落数即为lml水样的细菌总数。 (b)池水、河水或湖水等 稀释水样 取3个灭菌空试管，分别加入9ml灭菌水。取lml水样注入第一管9ml灭菌水内、摇匀，再自第一管取1ml至下一管灭菌水内，如此稀释到第三管，稀释度分别为10-1、10-2与10-3。稀释倍数看水样污浊程度而定，以培养后平板的菌落数在30300个之

11、间的稀释度最为合适，若三个稀释度的菌数均多到无法计数或少到无法计数，则需继续稀释或减小稀释倍数。一般中等污秽水样，取10-1、10-2、10-3三个连续稀释度，污秽严重的取10-2、10-3 、10-4三个连续稀释度。 自最后三个稀释度的试管中各取lmL稀释水加入空的灭菌培养皿中，每一稀释度做两个培养皿。 各倾注15-20 ml已溶化并冷却至45左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，立即放在桌上摇匀。 凝固后，倒置于37培养箱中培养24h。（3）菌落计数方法 (a) 先计算相同稀释度的平均菌落数。若其中一个平板有较大片状菌苔生长时，则不应采用，而应以无片状菌苔生长的平板作为该稀释度的平均菌落数。若片状

12、菌苔的大小不到平板的一半，而其余的一半菌落分布又很均匀时，则可将此一半的菌落数乘2以代表全平板的菌落数，然后再计算该稀释度的平均菌落数。 (b)首先选择平均菌落数在30-300之间的，当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则以该平均菌落数乘其稀释倍数即为该水样的细菌总数(见表)。 (c) 若有两个稀释度的平均菌落数均在30300之间，则按两者菌落总数之比值来决定。若其比值小于2，应采取两者的平均数；若大于2，则取其中较小的菌落总数(见表)。 (d) 若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数(见表)。 (e) 若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀

13、释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数(见表)。 (f) 若所有稀释度的平均菌落数均不在30300之间，则以最近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数(见表)。表 计算菌落总数方法举例 例次不同稀释度的平均菌落数两个稀释度菌落数之比菌落总数（个ml）备注10-110-210-31136516420-16400或1.6104两位以后的数字采取四舍五入的方式去掉22760295461.637750或3.810432890271602.227100或2.71044无法计数1650513-513000或5.1105527115-270或2.71026无法计数30512-30500或3.11043人体表面细菌测

14、定（1）手指（洗手前与洗手后）（a）分别在两个琼脂平板上标明洗手前与洗手后。（b）移去皿盖，将未洗过的手指在琼脂平板的表面，轻轻地来回划线，盖上皿盖。（c）用肥皂和刷子，用力刷手，在流水中冲洗干净，干燥后，在另一琼脂平板表面来回移动，盖上皿盖。（2）头发 在揭开皿盖的琼脂平板的上方，用手将头发用力摇动数次，使细菌降落到琼脂平板表面，然后盖上皿盖。（3）咳嗽 将去盖琼脂平板放在离口约68cm处，对着琼脂表面用力咳嗽，然后盖上皿盖。4培养将所有的琼脂平板翻转，使皿底在上，放37培养箱，培养12天。5结果记录方法（1）菌落计数：如果菌落很多而重叠，则可数平板1/4面积内的菌落数。（2）根据菌落大小、

15、形状、高度、干湿等特征观察不同的菌落类型。但要注意，如果细菌数量太多，会使很多菌落生长在一起，或者限制了菌落生长而变得很小，因而外观不典型，故观察菌落的特点时，要选择分离得很开的单个菌落。菌落特征描写方法如下：（a）大小 大、中、小、针尖状。可先将整个平板上的菌落粗略观察一下，再决定大、中、小的标准。（b）颜色 黄色、金黄色、灰色、乳白色、红色、粉红色等。（c）干湿情况 干燥、湿润、粘稠。（d）形态 圆形、不规则等。（e）高度扁平、隆起、凹下。（f）透明程度 透明、半透明、不透明。（g）边缘 整齐、不整齐。五、实验报告1、结果（1）将你自己的平板结果记录于下表中。（2）与其他同学所做的结果进行

16、比较。2、思考题 （1）比较各种来源的样品，哪一种样品的平板菌落数与菌落类型最多？（2）你所测的水源水的污秽程度如何？从自来水的细菌总数结果来看，是否合乎饮用水的标准？（3）洗手前后的手指平板，菌落数有无区别？（4）通过本次实验，在防止培养物的污染与防止细菌的扩散方面，你学到些什么？有什么体会？实验三 植物细胞和微生物形态观察一、实验目的1、认识细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的基本形态特征。2、比较植物细胞与微生物细胞的差异。二、基本描述1、细菌基本形态观察显微镜下观察金黄色葡萄球菌、八叠球菌装片。观察枯草芽孢杆菌、变形杆菌、大肠杆菌装片。观察螺菌装片。注意菌体的螺旋。 2、霉菌的特征结构观察观察黑根霉、曲霉、毛霉、青霉装片。3、酵母菌的形态观察观察酵母的形状和大小，出芽酵母形状和出芽方式。4、植物细胞形态观察三、作业画出你在显微镜下观察到的植物细胞和微生物的形态，并注明放大倍数。-以下为微生物形态 酵母菌青霉属黑根霉菌落形态