红芝漆酶粗酶液对活性艳蓝KNR脱色性能的研究培训讲学.docx

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红芝漆酶粗酶液对活性艳蓝KNR脱色性能的研究培训讲学

红芝漆酶粗酶液对活性艳蓝KN-R脱色性能的研究

本科生毕业论文（2009）届

论文题目：

红芝漆酶粗酶液对活性艳蓝KN-R脱色性能的研究

学院：

环境与资源学院

专业：

环境科学

学号：

200511200012

姓名：

李艳

指导老师姓名及职称：

谌斌副研究员

红芝漆酶粗酶液对活性艳蓝KN-R脱色性能的研究

专业：

环境科学学号：

200511200012

学生姓名：

李艳指导老师：

谌斌

内容摘要：

利用红芝（Ganodermalucidum）漆酶对活性艳蓝KN-R染料进行脱色研究。

采用单因子试验研究了漆酶介质、酶液用量、反应时间、反应温度、反应pH、底物浓度和转速对漆酶脱色性能的影响，结果表明：

漆酶脱色适宜温度为40℃，pH值为4.0，活性艳蓝染料的适宜浓度为150mg/L，粗酶液用量为4mL,反应8h可获得最大脱色率,静置和振荡对脱色率影响不大；通过正交试验,确定最佳的脱色组合为：

反应pH3.5，反应温度35℃，底物浓度为150mg/L，以上述最佳脱色条件对活性艳蓝进行脱色实验，反应8h，脱色率可达78%。

关键词：

红芝；漆酶；活性艳蓝KN-R；脱色

前言

染料是在水溶液或介质中使纤维染上各种坚牢颜色的有色有机化合物。

按化学结构可分为偶氮染料、蒽醌染料、靛族染料、硫化染料、酞著染料、次甲基染料、三苯甲烷染料和杂环染料[1]。

活性艳蓝KN-R（BrilliantBlueKN-R），呈蓝色粉末状，色泽接近于还原蓝RSN，是一种典型的蒽醌染料。

随着染料纺织工业的迅速发展，染料的品种和数量日益增加，含染料废水已成为水系污染的重点污染源之一[2]。

中国是染料生产大国，每年生产的染料达150万吨，其中50%以上用于纺织品染色，而在纺织品加工过程中，有10%-20%的染料作为废物排出[3]。

常见的处理印染废水的方法主要有物理法、化学法、生物法三大类。

物理法工艺简单、操作方便，但泥渣产量较大，且费用较高，所以很少单独使用。

化学法在处理过程中需要投加化学药品，增加了处理费用，还可能造成二次污染，而且在能耗、设备等方面尚存在不少问题。

还有一些化学方法在COD或色度等某些方面处理效果不尽人意，故化学法也很少单独运作。

生物处理方法是利用微生物的代谢活性降解环境中有机污染物的方法，由于投资少、占地少，不需要特殊设备而倍受青睐[4]。

漆酶（Laccase，ρ-benzenediol:

oxygenoxidoreductase，E.C.1.10.3.2）是一种含铜的多酚氧化酶，属于铜蓝氧化酶家族中的一小族[5]，对多种芳香族染料具有降解作用，采用漆酶对染料进行脱色降解的研究已引起了国内外的广泛关注[6]。

漆酶对印染废水有较高的脱色率，大大降低其它方法处理印染废水时对环境的污染。

除此之外，在环境、食品、降解木质素、植物纤维的改性、生物传感器、染整工艺、饮料加工、有毒化合物的生物消除、生物检测、纸浆漂白、有机污染物处理、痕量物质的分析等诸多现代工业领域中，漆酶都有着巨大的潜在应用价值[7-9]。

　本文以活性艳蓝KN-R染料为对象，用红芝漆酶粗酶液对其进行脱色降解处理，以其最大吸收波长592nm处的吸光值变化为指标，表征染料脱色降解，考察漆酶介质、脱色反应时间、漆酶粗酶液用量、脱色反应温度、脱色底物浓度、脱色反应pH值、摇床转速等因素对脱色性能的影响，并通过正交实验确定脱色的最佳条件。

1材料与方法

1.1菌种

红芝（Ganodermalucidum）,实验室保藏菌种。

1.2.1主要试剂

活性艳蓝、柠檬酸、磷酸氢二钠、愈创木酚、对羟基苯甲酸、1,2,3-三羟基苯并三唑、8-羟基喹啉、氯化羟胺、紫尿酸铵、丁二酸、氢氧化钠，均为国产分析纯试剂。

1.2.2常用储存液

（1）柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液（pH2.6-7.0）

A液：

0.1mol/L柠檬酸溶液，称取21.01g柠檬酸，定容至1L。

B液：

0.2mol/L磷酸氢二钠溶液，称取53.7g磷酸氢二钠，定容至1L。

按照表1量取不同体积的A液和B液混合，用pH计调节至所需值。

（2）丁二酸-氢氧化钠缓冲液（pH3.8-6.0）

A液：

0.2mol/L丁二酸溶液，称取丁二酸23.62g,定容至1L。

B液：

0.2mol/L氢氧化钠溶液，称取氢氧化钠8.00g,定容至1L。

取A液25mL,B液20mL混合，用pH计将pH调至4.5.

（3）活性艳蓝KN-R溶液母液的配制

称取0.5g活性艳蓝KN-R，用相应pH值的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液定容至1L，即为所需的活性艳蓝KN-R母液（500mg/L），然后根据所需浓度对母液进行稀释。

表1柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液配比表

pHA液/mLB液/mLpHA液/mLB液/mL

2.644.65.45.024.325.7

2.842.27.85.223.326.7

3.039.810.25.422.227.8

3.237.712.35.621.029.0

3.435.914.15.819.730.3

3.633.916.16.017.932.1

3.832.317.76.216.933.1

4.030.719.36.415.434.6

4.229.420.66.613.636.4

4.427.822.26.89.140.9

4.626.723.37.06.543.5

4.825.224.8

1.3主要仪器设备

电热恒温水槽，上海福玛实验设备有限公司；电热恒温干燥箱，上海跃进医疗器械厂；生化培养箱，上海跃进医疗器械厂；生物反应器式摇床，上海国强生化工程设备有限公司；标准型洁净工作台，苏州净化设备有限公司；722S分光光度计，尤尼柯（上海）仪器有限公司；低速台式离心机，上海安亭科学仪器厂；双光束紫外可见分光光度计TU_1901，北京普析通用仪器有限公司

1.4培养基

菌丝培养固体培养基：

麦芽糖30g，（NH4）2SO410g，MgSO4·7H2O0.5g，K2HPO4·3H2O1g，FeSO4·7H2O0.01g，KCl0.5g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，自然pH。

产酶液体发酵培养基：

葡萄糖2%，马铃薯汁20%，KH2PO40.3%，VB10.01g/L，MgSO40.15%，自然pH。

1.5红芝培养方法

在菌丝培养固体培养基上铺上玻璃纸，接种红芝菌种，置28℃生化培养箱中培养6d。

在250mL三角瓶中装产酶液体发酵培养基50mL，接入6d菌龄菌种，120rpm，30℃摇床培养。

1.6漆酶粗酶液制备方法

摇床培养5d的红芝发酵液，于4℃下4000rpm离心15min，弃去沉淀，上清液即为粗酶液，冰箱保存备用。

1.7漆酶酶活测定方法[10]

以愈创木酚为底物，取4mL含有1mmol/L愈创木酚的50mmol/L丁二酸-氢氧化钠缓冲液（pH4.5），加入1mL粗酶液，混合均匀后于30℃水浴反应30min，测OD465值。

对照管中加4mL不含底物的上述缓冲液和1mL酶样液。

定义每分钟氧化1μmol底物所需的酶量为一个酶活力单位（U/mL）。

酶活力计算公式：

漆酶活力（U/L）=（ΔOD×V1×106×N）/（Δt×ε×V2）

1.8活性艳蓝KN-R的脱色体系构建

染料脱色实验的总体积为20mL，由蒽醌染料活性艳蓝KN-R、粗酶液和100mmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液组成，酶解反应液装于50mL锥形瓶中，于一定温度水浴反应，每隔一定的时间在蒽醌染料KN-R的最大吸收波长592nm处测吸光度，得到吸光度为A1,用同样的方法在反应体系中加入等量的灭活酶液作为对照，测得其吸光度为A0。

染料脱色率计算：

脱色率（%）=（A0-A1）/A0×100%

A0-脱色反应前溶液的吸光值；

A1-经脱色反应一段时间后溶液的吸光值。

2结果与讨论

2.1漆酶粗酶液对活性艳蓝KN-R的酶解脱色光谱分析

配制50mg/L活性艳蓝KN-R溶液，以去离子水为参比，在TU-1901双光束紫外可见分光光度计下对其进行可见光区（300-700nm）光谱扫描，找出最大吸收波长。

活性艳蓝KN-R吸收光谱如图1所示，活性艳蓝KN-R在可见光范围内的最大吸收峰在592nm处。

图1光谱扫描曲线

20mL的反应体系中含有2mL的漆酶粗酶液（酶活22U/L）、50mg/L活性艳蓝KN-R、用100mmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液调节pH值为4.0。

将反应混合液放入50mL的锥形瓶中，置于30℃恒温水浴中，每隔一段时间，于300-700nm进行可见光谱扫描，结果见图2。

由图2可知，在可见光范围内，谱图重叠性较好，没有其他特征峰出现，在染料的最大吸收峰592nm处的吸光度下降明显。

图2活性艳蓝KN-R脱色前后光谱图

2.2漆酶介质对脱色率的影响

漆酶介质系统（LMS）是指漆酶在介质和氧的存在下进行生物催化的过程。

介质在酶的作用下会形成活性高且有一定稳定性的中间体，这些活性中间体能从氧分子中获得电子传递给底物，从而使底物降解[11]。

漆酶在加入介质的情况下，其对染料的脱色降解率可能会提高，不同的介质系统情况不同。

已报道的介质有：

2,2-氨基-二（3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6）铵盐（ABTS）、1-羟基苯并三唑（HBT）、紫脲酸（VIO）、吩噻嗪-10-丙酸（PPT）、丁香酸甲酯（MS）、N-OH-N乙酰基苯胺（NHA）。

这些介质价格昂贵，在实际应用中难以使用，为了寻找到价格低廉且效果好的介质，在实验室条件下，对以下介质进行筛选：

对羟基苯甲酸、氯化羟胺、8-羟基喹啉、1，2，3-苯并三唑、紫尿酸铵。

20mL反应体系中包含2mL的粗漆酶（酶活22U/L）、50mg/L的活性艳蓝KN-R、柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液（100mmol/L，pH4.0）配制的浓度为100mg/L介质，将反应混合液放入50mL的锥形瓶中，置于30℃水浴反应，反应一段时间后，于592nm处测定溶液的吸光值，以只加粗酶液作为对照。

结果如图3。

从图3可以看出，加入氯化羟胺、8-羟基喹啉的脱色率低于对照样，而加入对羟基苯甲酸、1,2,3-苯并三唑和紫脲酸铵的脱色率略高于对照样，说明上述物质不能作为漆酶脱色的介质。

备注：

1无介质，2-对羟基苯甲酸，3-氯化羟铵，4-8-羟基喹啉，5-1,2,3-苯并三唑，6-紫脲酸铵。

图3不同介质对脱色率的影响

2.3反应时间对脱色率的影响

在20mL反应体系中，以pH4.0的100mmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠为缓冲液，活性艳蓝KN-R的终浓度为50mg/L，加入2mL粗酶液（酶活22U/L），于40℃水浴反应，每隔2h于592nm处测定脱色体系吸光度值（图4）。

由图4可以看出，随着反应时间的延长，脱色率逐渐增加。

反应初期脱色率随时间变化较快，8h脱色率达到60%以上，作用时间超过8h后脱色率趋于平缓，因此，可将8h确定为脱色时间。

根据Michaelis-Menten假说，随着时间的延长，在溶液中酶的游离基被底物“饱和”，当底物浓度较酶游离基浓度过高时，基本上所有的游离酶都会被固定在酶-底物复合物之中，而复合物浓度过高时也会抑制或减慢复合物分解为产物和酶，导致溶液中游离酶越来越少，与底物的结合减少，延长反应时间也不能增加染料的脱色率[3]。

图4脱色率随反应时间的变化曲线

2.4粗酶液用量对脱色率的影响

20mL的反应体系中包含不同体积粗酶液（酶活14.23U/L）、柠檬酸-磷酸氢二钠为缓冲液（100mmol/L，pH4.0）配制的浓度150mg/L的活性艳蓝KN-R，将反应混合液放入50mL的锥形瓶中，置于40℃水浴反应8h，于592nm测定溶液的吸光值。

以反应前测得吸光值作为对照，结果如图5。

由图5可以看出，随着粗酶液体积的增加，脱色率先上升后平缓，粗酶液体积大于4mL后，脱色率基本不变。

这可能是由于加入的酶制剂浓度较高，在溶液中酶的游离基可能很快被底物“饱和”，基本上所有的游离酶都被固定在酶-底物复合物之中，导致溶液中游离酶越来越少，与底物的结合减少，所以再增加酶液量不能增加染料的脱色率。

综合考虑，在上述20mL反应体系，粗酶液（酶活14.23U/L）添加量以4mL为宜。

图5不同粗酶液用量对脱色率影响图

2.5反应温度对脱色率的影响

酶的活性受温度的调控，漆酶也不例外。

在20mL的反应体系中，以pH4.0的100mmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠为缓冲液，加入4mL粗酶液（酶活14.23U/L）,加入一定量的活性艳蓝母液，使其终浓度为50mg/L，置于20-60℃保温8h，测定脱色率（图6）。

由图6可以看出，随着温度的升高，脱色率先增大再减小。

在40℃时脱色率最高，可达79.3%。

当温度从20℃增加到40℃时，脱色率从70%增大到80%，可能在此区间酶的热稳定性较好，活性变化不大。

当温度从40℃增大到60℃脱色率从80%下降到50%，下降幅度较大，可能是温度过高使酶失活所致。

有酶参与的反应中，酶的催化作用总是与酶的失活处于竞争状态。

在较低温度下，酶的失活往往可以忽略不计，只能观察到其催化作用，随着温度的升高，酶的失活越来越明显[12]。

为了解释上述现象，对漆酶的热稳定性做了探讨。

将粗酶液分别置于不同温度下保温2h，立即取出，冰浴终止反应，在30℃下，测定剩余的漆酶活力，以保温前30℃下测定的酶活力为100%，结果如图7。

由图7可以看出，在40℃以下，漆酶基本不失活，在50℃时部分失活，温度高于50℃时，酶活力迅速下降。

综合考虑漆酶的热稳定性与脱色的最适温度，漆酶的脱色温度以40℃为宜。

图6反应温度对活性艳蓝脱色率的影响

图7漆酶的热稳定性

2.6脱色底物浓度对脱色率的影响

在20mL反应体系中，以pH4.0的100mmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠为缓冲液，加入活性艳蓝母液配成不同浓度溶液（20-300mg/L），然后加入粗酶液4mL（酶活17.42U/L），在40oC水浴反应8h，测吸光度，计算脱色率，结果如图8。

从图8可以看出，活性艳蓝浓度在20-150mg/L之间时，脱色率均在70%以上，随着活性艳蓝浓度的增大，脱色率先增大再下降，浓度为150mg/L时，脱色率最高，达到80%以上。

浓度从150mg/L增加到300mg/L，脱色率从80.5%降低到52.5%。

酶反应的进行首先要求酶和底物结合形成“酶-底物”中间复合物，然后酶再催化底物进行转化，分解出产物，同时酶回复原状并参与下轮催化。

在染料浓度很高时，达到一个极限值，也就是因为游离酶都被固定与底物形成了复合物，溶液中游离的酶越来越少，有时这种复合物浓度的增加会抑制或减慢中间复合物向底物的转化，导致染料浓度高于一定程度后脱色率下降[13]。

适宜脱色的活性艳蓝染料浓度为150mg/L。

图8活性艳蓝浓度对脱色率的影响

2.7脱色反应pH对脱色率的影响

酶的催化作用与反应液的pH值有很大关系，pH值过高或过低，都可能引起酶的变性失活，只有在适宜的pH值范围内，酶才能显示其催化活性[13]。

20mL的反应体系中包含100mmol/L的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，设置反应液的pH分别为2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0，适量的粗酶液，150mg/L的活性艳蓝KN-R，将反应混合液放入50mL的锥形瓶中，置于40℃水浴反应，反应一段时间后，于592nm处测定溶液反应前后的吸光值，计算脱色率，绘制脱色率-pH变化曲线（图9）。

由图9可以看出，不同pH条件下，活性艳蓝的脱色率不同。

随pH的增加脱色率先增后减，在pH为4时，脱色率最大，达到84.2%，红芝漆酶的最适反应pH为3.5，这与酶的性质基本一致；在pH为2.5时，脱色率为40%；当pH大于4时，随着pH的增加，脱色率逐渐减小；当pH大于6时，脱色率几乎为0，可能是由于碱性条件使酶失活性所致。

酶分子活性部位上的氨基酸侧链基团可随pH的变化而发生解离并处于不同的正负高价离子或等电荷状态，将直接影响到酶的活化和酶与底物的亲和力，另一方面，pH也会影响到底物的带电状态，使底物无法与酶结合，酸或碱还会使酶的空间结构改变，引起酶的活性丧失[14-15]。

脱色反应的最适pH以4为最好。

图9反应液pH对脱色率的影响

2.8摇床转速对脱色率的影响

将粗酶液与活性艳蓝的混合液（20mL反应体系中，粗酶液4mL，温度40℃，pH值4.0，酶活10.45U/L，150mg/L活性艳蓝）分别静置及在不同转速下振荡反应8h，每隔一段时间测定其吸光度，计算脱色率，结果如表2。

从表2可以看出，不同摇床转速对脱色率影响不大。

有文献报道[16]，漆酶对染料的脱色是漆酶和氧存在的情况下进行的催化氧化过程，被漆酶吸收的电子最终传递给氧气形成水。

从本实验结果来看，在一定的转速下氧不是上述反应的限制因素，这一结果与戴文魁报道[17]的一致。

另外的原因可能是由于活性艳蓝是易溶性物质，粗酶液能够与其均匀混合。

表2摇床转速对脱色率的影响

编号转速（rpm）脱色率（%）

1048

25050

310049

415050

2.9活性艳蓝脱色条件的优化

为了得到更好的脱色条件，在单因子试验的基础上，选取底物浓度、pH值、反应温度3种因素进行3因素3水平正交试验，正交试验的因素水平及结果见表3。

正交试验结果分析表明：

反应温度、pH、底物浓度对活性艳蓝脱色率影响的显著性排序为pH值＞反应温度＞底物浓度。

根据正交极差分析结果，可看出最优方案应是B1C1A2，即在pH值3.5，温度为35℃，底物浓度为150mg/L的条件下，脱色率最高。

该组合不在正交试验的9个组合之中，因此进行补充试验，该组合补充实验脱色率为78%，是脱色率最优的组合。

表3正交试验数据表

3主要结论

（1）红芝漆酶粗酶液对活性艳蓝KN-R具有很好的脱色降解效果，脱色前后没有出现其他特征峰。

单因子试验结果表明：

在20mL反应体系中，染料的浓度为150mg/L，反应液pH4.0，反应温度40℃，最适粗酶液用量为4mL,反应8h可获得较好脱色效果；氯化羟胺、紫脲酸铵、对羟基苯甲酸、8-羟基喹啉和1,2,3-苯并三唑等介质对脱色降解影响不明显；静置和振荡对脱色率影响不大。

（2）正交实验结果表明：

反应温度、pH、底物浓度对活性艳蓝脱色率影响的显著性顺序为pH值＞反应温度＞底物浓度，在pH3.5，作用温度35℃，底物浓度为150mg/L的条件下，反应8h，脱色率可达78%。

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StudyonDecolorationofBrilliantBlueKN-RbyLaccase

fromGanodermalucidum

Major:

EnvironmentalScienceStudentNo.:

200511200012

Candidate:

LiYanAdvisor:

ChenBin

Abstract：

ThedecolorizationofbrilliantblueKN-RbylaccasefromGanodermalucidumwasstudied.Theeffectsoflaccasemediator,crudelaccasecharge,decoloringtime,decoloringtemperature,decoloringpH,substrateconcentrationandrotationalspeedonthecatalyticaldecolorizationwerediscussedindetailbythesingle-factorexperiment.Theresultsofsingle-factorexperimentwereasfollows:

theoptimalreactiontemperaturewas40℃,pH4.0,concentrationofBrilliantBlueKN-R150mg/L,crudelaccasecharge4mL,thedecolorizationratereacheditsmaximumafter8hours,standingandvibrationhadlittleeffectonthedecolorizationrate.Theoptimumconditionsofd