SSI高效液相的标准操作规程.docx
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SSI高效液相的标准操作规程
SSI高效液相的标准操作规程
适用于所有使用此仪器者
1.流动相的处理
1.1过滤溶剂
溶剂在使用前一定要用0.5μm的过滤器过滤，如果使用固体化学试剂（缓冲盐）配制流动相，过滤特别重要，不能让固体微粒污染泵，阻塞进样器和柱头过滤片。
本实验室有水溶性和有机性两种过滤膜供选择，过滤水溶性流动相时（如甲醇/水），先用1-2ml甲醇润湿过滤膜，有助于快速抽滤。
1.2保持储液瓶的清洁
用普通溶剂瓶作流动相储液器应不定期废弃瓶子，最后一次应用HPLC级的水或溶剂清洗，不能在清洗过程中留下污迹。
1.3保证溶剂的质量
一定要用HPLC级的溶剂，水也应达到HPLC级，同样也要使用高纯度的缓冲盐。
1.4故障及解决方法
1.4.1流动相脱气不充分
流动相受热，或者流动相不同组分混合时会有气体产生，气泡进入泵内引起压力波动，增加噪音，色谱图上出现毛刺。
可试用下列方法解决问题：
流动相再脱气；采用更有效的脱气方法或两种方法配合使用；改系统内混合为系统外预混合。
1.4.2流动相供给不畅
流动相用完，管道中吸入气体引起泵压力不稳。
应经常观察储液器中流动相的量，加足流动相保证所有的样品分析完毕。
输液管上装溶剂滤头，既可使输液管沉至瓶底，又可过滤流动相，储液器盖上留一小孔正好夹住进液管，使其不能上下移动。
溶剂滤头阻塞引起管道和泵腔空化，压力不稳。
溶剂滤头被微粒所阻塞或长霉，去掉溶剂滤头后如果系统运转正常，说明已找出问题，换上新的溶剂滤头则可。
有时候换上新的溶剂滤头仍然不畅，那就需要查查流动相的制备过程，或者换大孔径的溶剂滤头。
不管如何，流动相都需要重新过滤。
流速过高、阻力大，造成空化现象，这是由于溶剂滤头孔径、管道内径、流速和溶剂黏度等引起的。
如果流速大于10ml/min，常会出现这种现象。
使用下列方法解决：
（1）使用低流速；
（2）换大孔径的溶剂滤头；（3）增加进液管道内径；（4）抬高或加压储液器；（5）不用溶剂滤头，但流动相一定要先过滤；（6）储液器盖子太紧，在储液器内形成真空，打出的流动相不连续。
应松开盖子或留有1mm的缝隙；（7）进液管道阻塞或弯曲使泵抽不到液，注意调整进液管道或更换新的。
其它问题包括渗漏或接头松动、泵部件损坏等，都能引起供液不正常。
1.4.3流动相和储液器被污染
由于污染，噪音越来越大，检测器基线上升。
污染物可能被泵以稳定的浓度打入系统，而再以稳定的浓度流出来，所以在色谱图中不出多余的峰。
用梯度洗脱时弱流动相可以使污染物聚在柱顶，流动相强度增加后污染物可能被洗脱出来一个大的伪峰。
有时基线噪音突然增大或突然提高，都是因为反复加进新的流动相或系统用得太久（通宵）所造成的。
新加进的流动相有污染物或者流动相长霉，繁殖了细菌。
脏的储液器会污染清洁的流动相。
每种流动相备有专用的储液器，或者定期报废储液器。
流动相污染来自这几个方面：
试剂质量不高，玻璃器皿不合格；微生物的影响；配制流动相时操作不当等。
因此要求高纯度化学试剂和HPLC级溶剂。
玻璃器皿按规定清洗干净。
为防止微生物生长，每天要用甲醇清洗系统。
怀疑系统内生长了微生物，可用稀硝酸冲洗既可（注意不要损坏柱和管道系统），真空脱气时防止泵油带入流动相。
用清洁的惰性塞子、搅棒、溶剂滤头和玻璃器皿配制流动相。
已经污染的流动相一定要废弃掉。
2.仪器组成及电源
2.1仪器组成
本系统由SeriesⅢ泵，7725i进样器，Model500型紫外/可见光检测器，柱温箱（可选件），数据处理系统一套。
2.2电源
仪器使用时按泵、检测器、打印机和计算机的顺序，依次接通电源。
3.SeriesⅢ泵的操作
3.1操作环境要求
室内应保持环境清净、无尘，并且有恒温和恒湿设备。
一般实验室的温度应保持在20~30℃之间，相对湿度保持在20%~90%之间。
3.2溶剂使用注意事项
除使用PEEK™泵头以外，SeriesIII泵里面跟溶剂接触的所有部件的制造材料为316L不锈钢、蓝宝石、红宝石或聚合物材料。
这里面有一些材质对酸（包括路易斯酸）和卤化酰基非常敏感。
应避免使用以下溶剂：
王水、溴、无水氯、氯化铜、氯化铁、氯化亚铁、氟利昂、胍、氢溴酸、盐酸、氢氟酸、过氧化氢、碘、氯化汞等。
注意，三氯甲烷和四氯化碳会缓慢分解，产生游离的氯化氢（盐酸），会腐蚀不锈钢流路系统，应尽量避免使用。
3.3前面板介绍
3.3.1Prime/Purge阀：
这是一个高效的空气排放阀，当打开阀时，液体将从此出口排出，而该阀完全关闭时，液体将从Filter/Outlet出口排出，并进入系统。
当泵或者流动相入口管路有气泡时，打开这个阀，用一个大注射器插在阀口抽液，或者按泵前控制面板上的“Prime”键。
一般抽出20~30ml溶液即可。
（注意：
当您拧开这个阀的时候，系统压力一定要在100psi以下）
3.3.1.1Filter/Outlet
这是泵出口，内置一个高压在线过滤器（0.5um），该接口设计连接管路为1/16’’外径管（分析型泵）。
3.4控制面板介绍
3位数字液晶显示器可以显示泵的流速，系统压力或者是用户设置的最高/低压力保护限，显示模式可通过按“MODE“键进行选择。
3.4.1键盘
RUN/STOP：
启动/停止键
：
数字增加键（设置时用）
：
数字减少键
Prime（排气键）：
按下这个键，泵将在最大流速下运行，按任意键停止。
（注意：
在按下这个键时，必须确认“Prime/Purge”阀是完全打开的）
Mode（功能键）：
按下这个键，可以循环选择四个显示模式：
“流速、压力、最高压力限、最低压力限”。
3.4.2LED状态灯介绍
ML/MIN（流速显示）：
当这个灯亮时，显示的是当前的流速（ml/min），您可以通过“”进行调整
PSI（压力显示）：
当这个灯亮时，显示的是当前系统的压力（psi）
HIPRESS（高压限）：
当这个灯亮时，显示的是最高压力保护限，用户可进行调整
LOWPRESS（低压限）：
当这个灯亮时，显示的是最低压力保护限，用户可进行调整
PUMPRUN（泵启动显示）：
当这个灯亮时，泵正在运行中
FAULT（错误提示）：
当这个灯亮时，说明系统有错误产生，泵将停止运行。
您可以在查清错误原因后，按任意键跳过错误检查并重新启动泵。
3.5运行泵
调节好所需的流速后，按“RUN”键启动泵，泵工作时可使用它的自清洗功能，用自清洗液（水）在线清洗泵头。
3.6实验结束后关闭电源开关。
4.进样
4.1进样阀
采用7725i手动进样器，进样环（loop）体积为20μl，上样量在10~20μl时，进样体积必须大于loop体积的3-5倍，才能得到好的重现性，上样量小于10μl时，可以用10μl的微量进样器直接进样。
进样后，快速旋转进样器的把柄，直接把样品进到色谱柱的柱头。
4.2标准曲线
在做标准曲线时，进样浓度应由低到高。
5.信号检测及数据处理
本系统用Model500型紫外/可见光检测器，波长范围在190-800nm。
在分析过程中测定吸收信号由计算机进行处理，显示色谱图，列出数据处理结果。
测量结束时按规定退出程序后关机。
SeriesIII型泵故障快速检查与排除
现象
故障
原因
排除
1.压力不稳
2.压力下降
3.泵关闭
4.出口单向阀无液流
1.单向阀有气泡.
2.系统泄露
3.单向阀不干净.
4.单向阀已坏.
1.流动相脱气不佳
2.接头不紧
3.流动相过滤不好
4.颗粒物划伤单向阀或柱塞杆密封圈.
5.溶剂滤头不干净.
1.检查流动相，保证完全脱气.
2.检查漏液连接处，拧紧连接螺丝
3.直接从出口单向阀处冲洗泵
4.清理或更换单向阀
5.清理或更换溶剂滤头.
1.压力不规则变化.
2.压力下降
3.泵头与机壳间漏液
1.系统泄露
2.柱塞密封已坏
1.接头不紧.
2.密封使用时间过长
3.盐结晶在密封圈上
1.检查漏液连接处.
2.更换柱塞密封.
3.检查柱塞杆，仔细清洗，尽量使用自清洗系统
泵运行声音不正常，有金属撞击声
.柱塞杆支座位置不正确
1.检查泵头螺丝，拧紧
2.更换密封圈.
3.更换柱塞杆导向环和密封圈
4.使用缓冲溶液时，尽量使用自清洗系统.
5.清理柱塞杆支座连接部位过多的润滑油
流动相中有兰色液体
均速器已坏
系统压力突然降低.
更换均速器
泵运行50圈后停止
压力低于低压限.
1.流动相过滤不好
2.颗粒物划伤单向阀或柱塞杆密封圈.
1.检查并将低压限设置为零
2.泵达到使用压力后再设低压限.
3.联系维修.
1.即使不连接色谱柱，泵启动后自动停止运行
2.泵运行到最大压力后停止运行
液路系统堵塞
1.拆下泵入口或在线过滤器，清洗
2.一段一段的查找管路，排除堵塞管路。
一般堵塞均发生于泵外连接管路上
泵电源打开后，泵无显示，风扇不转
电源保险丝熔断
1.电源问题.
2.内部短路
1.更换保险丝
2.联系维修
全面板显示正常，泵电机不转
电机控制板保险丝熔断
1.电源问题.
2.内部短路
1.更换保险丝
2.联系维修.
PEEK接头漏液.
PEEK接头不能拧得太紧.
1.接头表面密封不严
2.接头表面盐结晶.
3.接头表面有划痕
1.清理表面.
2.如果有划痕，更换接头.
自清洗泵头漏液.
清洗面密封不好.
1.大（016）O型环不能密封.
2.泵头松动
3.表面划痕
4.自清洗密封圈
1.更换大（016）O型环
2.拧紧泵头.
3.更换划痕部件.
500检测器的使用和维护
图2.1：
检测器前面板
前面板见图2.1：
以下控制和指示器位于前面板上：
1）显示屏：
A31/2数字显示器。
吸收值可显示到1.999AU。
当按下开关8（SAMP）时，这个显示屏显示样品相对光密度，当按下开关9（REF）时，这个显示屏显示参照光强度。
2）上升时间选择开关：
一个四档旋转开关控制，能控制二级Bessel滤器的过滤强度。
可选择的上升时间有0.1，0.3，1.0和3.0秒四档。
上升时间等于2倍的时间常数。
（以秒为单位）
3）灵敏度选择开关：
十二档的旋转开关控制仪器背板上的输出口的输出电压范围。
可供选择的有2.0，1.0，0.5，0.2，0.1，0.05，0.02，0.01，0.005，0.002，0.001，和0.0005AUFS。
这个开关不控制仪器背板上的1V/AU积分仪输出端口的输出。
4）波长选择器：
连续波长旋钮，可调范围190-800nm。
顺时针旋转降低波长，逆时针旋转增加波长。
箭头指示波长增加方向。
注意：
不要强力旋转旋钮，使波长值低于180nm或高于820nm这会损坏波长控制器。
5）波长指示器：
一个三位的机械波长指示器，显示当前工作波长。
6）紫外（UV）灯指示器：
绿色发光二极管亮表示氘（D2）灯装于设备内并且发光。
7）可见光（VIS）灯指示器：
绿色二极管灯亮表明这个设备内装着一个钨灯并且发光。
8）样品光强度开关：
按下这个瞬间开关，显示器显示样品室光敏二极管测到的样品光密度。
9）参照光密度开关：
也是瞬间开关，按下此开关，显示器显示参照光敏二极管测到的参照光密度。
10）短路开关：
瞬时开关，按下这个按钮，记录仪输出端电压降为零伏。
这个按钮必须持续按压一会才能发挥作用。
这个按钮用于调整记录笔在记录纸上的位置，但不影响积分仪输出。
11）标记开关：
瞬时开关按下该开关可产生偏转度达20%的输出信号，该开关不影响积分仪输出。
12）等待状态指示灯：
绿色LED指示灯，此灯亮表示记录仪输岀端正在输出一个恒定的零电压。
这种情况见于：
a）刚刚开机时。
解决办法，按下自动回零开关--14，则记录仪归零，等待指示灯熄灭，记录仪输出端开始有电压输出。
b）刚刚按下自动归零开关时。
这种情况到仪器完成信号处理时能自动恢复。
等待指示灯熄灭，记录仪输出端开始输出电压。
13）超限指示灯：
绿色LED指示灯。
此灯亮表示样品流通池里的吸光度超过了自动归零电路的最大调整范围。
这时仪器仍可以正常输出记录电压，只是输出的电压存在一个偏差，即新基线和真正零基线之间的偏差。
例如自动归零电路己将0.002AU设置为零基线，那么新测得的所有数值都是在0.002AU的基础上的增加值。
在配备标准流通池的条件下自动归零电路最大可以将1.5AU的输出设为零基线。
14）自动归零开关：
瞬时开关可以使高达1.5AU的电压回零，按下这个开关等待指示灯点亮，记录仪输出端电压归零。
大约三秒之内，这个仪器即可完成新零电位的记录并计算新电压相对值，等待指示灯自动熄灭。
当超限指示灯亮时表示样品流通池里的吸光度超过了自动归零电路的最大调整范围。
图2.2：
检测器后面板
16
17
15
14
13
12
11
10
9
8
后面板见图2.2
1）地线：
此接线端接地线
注意：
此地线不要和其它地线或阴极线相连，否则会形成地线环流，造成基线噪声
2）记录仪输出端：
两个接线端提供模拟信号输出，可用于记录仪或积分仪。
最大输出电压分三档，10mV、100mV和1.0V，可调。
此输出端受上升时间开关和灵敏度开关的调节。
3）积分仪输出端：
两个接线端提供一个比例固定的1V/AU的模拟输出信号。
这个输出端不受上升时间开关和灵敏度开关的控制也不受短路开关和标记开关的影响，但受自动归零开关的控制。
4）远程自动归零：
两个接线柱，用于远程控制，使用瞬时开关或TTLlow可启动自动归零电路。
5）远程标记：
两个接线柱，用于远程控制，使用瞬时开关或TTLlow可启动标记开关。
6）远程关灯：
两个接线柱，用于远程控制，使用一个持续性的开关或TTLlow可以关闭仪器的检测灯，断开这个开关又可使检测灯点亮。
7）地线：
此端接地
下面介绍三个双掷开关，输出电压最大值。
这三个开关对积分仪输出端电压不起作用。
8）向上扳动此开关，同时向下按下9、10两个开关，记录仪输出端的最大输出电压设为1.0V
9）向上扳动此开关，同时向下按下8、10两个开关，记录仪输出端的最大输出电压设为100mV。
10）向上扳动此开关，同时向下按下8、9两个开关，记录仪输出端的最大输出电压设为10mV。
注意：
如果同时将此三个开关打开，那么机器的输出电压就会打到最大并不可调节！
所以只能有一个开关处于接通状态。
11）关闭过滤器：
向上扳动此开关，可关闭内部的二级Bessel过滤电路，此时前面板的上升时间控制开关不起作用，上升时间被锁定为0.1秒。
12）积分仪输出端校正开关：
打开此开关可以为积分仪输出端提供一个+10mV的校正电压。
当基线发生负漂移，积分仪输出端不能归零时，可使用此开关。
大多数情况下用不着此开关。
此开关对记录仪输出端不起作用。
13）记录仪输出端校正开关：
此开关不影响积分仪输出端输出电压，只控制记录仪输出端。
打开此开关可向记录仪输出端提供一个+10mV的校正电压，此电压不受最大输出电压开关的控制
14）电源开关：
向上为开，向下为关，控制整个仪器的电源供应。
15）电源插座：
一个三针电源插座，可用于接入标准电源。
16）保险丝盒：
打开这个盒子可以更换保险丝，调节输入电压设置。
17）电压调节器：
有四档可供选择，100，120，220，240VAC（50-60Hz）
左侧机箱
1）灯箱：
拧下螺丝可以更换检测灯。
注意！
不可在带电情况下开箱，紫外线可以对人眼和皮肤造成伤害。
用过之后不论是氘灯还是钨灯都十分热，应小心灼伤。
2）流通池盖：
缷下螺丝可以看到流通池和检测光敏二级管。
3）流通池出口：
将此管接于废液罐。
3）流通池入口：
将此管接于色谱柱.
2
Model500紫外检测器常见故障及处理
绝大多数HPLC检测器的问离，事实上都是由系统的其他单元所造成。
基线噪音和漂移，定量分析过程中重现性差，以及许多经常由溶解气泡，流动相不纯，样品太杂或色谱柱等所产生的故障实际上并非检测器的故障。
为了更好地查找故障来源，首先说明一下机内自检系统。
灯能量检测：
检测器能检测参比池和样品池的相对光能量。
一旦系统基线噪音太大，应先检查参比池和样品池的相对光能量，正常能量数值和数值比与所使用的流通池类型，操作波长，背景吸收有关。
1.干净的流通池和正常的光源参比池和样品池的相对光能量比约为2:
1.
2.不正常的参比池和样品池的相对光能量比表明：
a）流通池太不干净
b）流动相背景吸收太大。
3.参比池相对光能量小于50表明光源需要更换。
常见故障检查与处理
现象
原因
处理
1.记录仪基线出现尖锐峰型
a.气泡流经流通池l.
b.外部触发设备产生的电信号
c.电网中其他用电设备产生的信号.
a.流动相脱气/或在流通池后增加背压，
b.检查管路有无泄露（液体或气体）。
c.检查电源连接和地线连接
d.实行独立电源供电系统
2.基线噪音大（随机）.
a.流通池光学窗不干净
b.样品入口管漏液.
c.流通池内有气泡.
d.地线问题
e.光电管不干净或位置不对.
f.流通池位置不对
g.检测器输出与记录设备不匹配
h.触发器产生的地线问题.
a.用溶剂清洗流通池（甲醇,丙酮,水,硝酸（6N）.水）
b.检查色谱柱到流通池间的管路是否漏液
c.增加流速或流通池背压
d.用万用表检查信号地线.
e,清理光电管表面
f.检查流通池位置.
g.保证触发器与仪器共地
3.基线漂移
a.流通池光学窗不干净.
b.洗脱液吸收变化.
c.流通池与色谱柱间的液路漏液
d.流通池内有气泡.
e.检测器输出与记录设备不匹配.
f.温度变化太大
g.流通池或光电管盖松动
a.用溶剂清洗流通池（甲醇,丙酮,水,硝酸（6N）.水）
b.使用高纯溶剂，延长平衡时间，选用较高波长
c.检查管路有否漏液.
d.增加流速或流通池背压
e.保持室内温度相对恒定.
f.检查流通池或光电管盖，拧紧螺丝.
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