基因工程整理资料.docx

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基因工程整理资料

第一章

1、基因工程：

是通过对基因的操作来定向改变或修饰生物体或人类自身，并具有明确应用目的的活动。

被操作的对象一般会发生遗传信息或遗传改善的变化，并具有稳定的遗传性。

2、供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。

3、基因工程的工具有哪些？

P7

（1）基因操作的车间——大肠杆菌Escherichia coli和病毒

（2）获得基因片段的工具——限制性核酸内切酶

（3）连接基因片段的工具——连接酶

（4）基因操作的载体——质粒和病毒

第二章

连接酶只能封闭缺口（nick）,不能连接裂口（gap）。

限制性内切酶造成粘性末端,有利于重组DNA分子的构建

4、限制性内切酶的概念：

是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核苷酸内切酶。

分子克隆工具酶：

限制性内切酶、甲基化酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶、连接酶、磷酸激酶和磷酸酶

5、命名方法：

限制性内切酶的命名

属名种名株名

Haemophilusinfluenzaed嗜血流感杆菌d株

HindIIIHindIII

同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶

6、限制与修饰系统的种类：

根据酶的亚单位组成、识别序列的种类和是否需要辅助因子，限制与修饰系统可分为三类（I,II,III），也可分为四类（多了一个IIs,即II亚类）。

一般所说的限制酶，特指II型限制酶，因为只有这一类具有使用价值。

7、各种限制与修饰系统的比较

型限制与修饰系统所占比例最大，达93%

限制酶产生的末端

1. 产生匹配的黏末端–回文对称序列，内部切割，产生的末端相同且互补

2. 产生非对称突出末端–切割序列为非对称序列，产生非对称的突出末端

3. 平末端–切割回文对称序列，产生平末端•5‘黏末端和3’黏末端

8、同尾酶、同裂酶和归位内切酶的末端判断

 同裂酶——来源不同，识别相同的序列

（1）同序同切酶——识别序列和切割位置都相同

•HindⅡ与HincⅡ识别切割位点为GTY↓RAC

•HpaⅡ与HapⅡ识别切割位点为C↓CGG

•MobⅠ与Sau3AⅠ识别切割位点为↓GATC

•有些同裂酶对甲基化位点的敏感性不同

（2）同序异切酶——识别序列相同，切割位置不同

•KpnⅠ：

GGTAC↓C 

•Acc65Ⅰ：

G↓GTACC

•Asp718Ⅰ：

G↓GTACC

（3）同功多位——识别简并序列的限制酶包含

了另一种限制酶的功能

•EcoRⅠ：

G↓AATTC  

•ApoⅠ：

R↓AATTY 

•HpaⅠ：

GTT↓AAC 

•HincⅡ：

GTY↓RAC 

（4）其他——限制酶识别序列相互交叉

•SalⅠ：

G↓TCGAC

•AccⅠ：

GT↓MKAC

•HincⅡ：

GTY↓RAC•5. 同尾酶——来源不同，识别序列不同，但

产生黏末端相同

5’-GGATCC-3’

3’-CCTAGG-5’

BamHⅠ

5’-TGATCA-3’

3’-ACTAGT-5’

BclⅠ

5’-AGATCT-3’

3’-TCTAGA-5’

BglⅡ

产生相同的5’GATC粘性末端•杂种位点（hybrid site）——由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点。

•一般不能被原来的任何一种同尾酶识别。

•BamHⅠ：

GGATC C         BclⅠ：

TGATCA

•CCTAGG                       ACTAGT

•杂种位点：

GATCC （BamHⅠ）

•CTAGT（BclⅠ）经同尾酶消化的DNA末端连接示意图省略

BamHIBglII•6. 归位内切酶——I‐prefix 和pI‐prefix 系列酶

–有些线粒体、叶绿体、核DNA 、T 偶数噬菌体

含有一些编码内切酶的内含子，有些intein 

（protein splicing element）也有内切酶的活性，这两类内切核酸酶称为I‐prefix 和pI‐prefix 系列内切酶，它们识别的序列很长。

–I‐prefix 是由在RNA 水平上剪切和编码的

–pI‐prefix 在蛋白质水平上剪切的产物。

9、位点偏爱：

某些限制酶对同一底物中的有些位点表现出偏爱性切割，即对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象称作位点偏爱。

某些噬菌体DNA 中的某些相同的酶切位点对酶的敏感性是不同

–EcoRⅠ：

5 个位点，并不是随机切割，靠近右端的位点比分子中间的位点切割快10 倍

–SacⅡ：

三个在中央，一个在右臂，对中央三个位点的酶切速度快50 倍

原因:

–切割DNA 之前需要同时与两个识别位点作用•NarⅠ，NaeⅠ和SacⅡ

–切割DNA要求作用的DNA 序列上有两个明显不同的结合位点，其中一个是为DNA 切割激活另一个的变构位点（allosteric）•BspMⅠ、EcoRⅡ和HpaⅡ

10、酶切反应条件

1. 缓冲液

–常规缓冲液一般包括提供稳定pH 值的缓冲剂、Mg++ 、DTT（二硫苏糖醇）以及BSA（小牛血请白蛋白）。

2. 反应温度–大多数为37℃，一部分为50‐65℃，少数25‐30℃

–高温作用酶在37℃下的活性会下降，多数仅为最适条件下的10‐50% 

3. 反应时间

–反应时间通常为1 小时或更多，许多酶延长反应时间可减少酶的用量

–EcoRⅠ若反应16 小时，所需酶量为正常酶切时间的1/8 

–HindⅢ为1/8；KpnⅠ为1/4；BamHⅠ为1/2 

 终止酶切的方法

–EDTA 可鏊合镁离子，从而可终止酶切反应，终止浓度为10mM 

–加热是常用的方法，对于最佳反应温度为37℃的酶，在65℃或80℃处理20 分钟可使酶活性大部分丧失

–但是对于在80℃作用20 分钟也有不失活的酶，如Bg1Ⅱ、HpaⅠ和PvuⅡ；Tth111Ⅰ和TspRⅠ，以及Bc1Ⅰ，可用苯酚抽提去除蛋白，或用试剂盒纯化DNA 

11、星星活性概念：

星星活性是限制性内切酶的一般性质，任何一种限制酶在极端非标准条件下都能切割非典型位点

12、甲基化酶的种类

原核生物甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员，用于保护宿主DNA不被相应的限制酶所切割。

在E.coli中，大多数都有三个位点特异性的DNA甲基化酶

12、甲基化酶的种类：

1．Dam甲基化酶Dam甲基化酶可在GATC序列中的腺嘌呤N6位置上引入甲基。

有些限制酶对Dam甲基化的DNA敏感，不能切割相应的序列，如BclⅠ、ClaⅠ、XbaⅠ等。

对甲基化不敏感的有BamHⅠ、Sau3AⅠ、BglⅡ、PvuⅠ等。

MboⅠ和Sau3AⅠ识别和切割位点相同，但其差异就在于前者对甲基化敏感。

一般哺乳动物DNA不会在腺嘌呤N6上甲基化，因此对甲基化敏感的限制酶切割这些DNA不会受到影响。

2．Dcm甲基化酶Dcm甲基化酶识别CCAGG或CCTGG序列，在第二个胞嘧啶C的C5位置上引入甲基。

受Dcm甲基化作用影响的酶有EcoRⅡ（↓CCWGG）。

大多数情况下，其同裂酶BstNⅠ（CC↓WGG）可避免这一响，因为二者识别序列虽然相同，但切点不同。

3．EcoKⅠ甲基化酶。

EcoKⅠ甲基化酶的识别位点少，识别AAC（N）6GTGC和GCAC（N）6GTT序列中A的N6位置。

但因为识别位点少（1/8kb），所以研究较少。

甲基化对限制酶切割反应的影响：

1．修饰酶切位点2．产生新的酶切位点3．对基因组作图的影响

第3节DNA 聚合酶：

1、大肠杆菌DNA 聚合酶Ⅰ2、Klenow DNA 聚合酶3、反转录酶

13、DNA聚合酶的各种类的活性：

DNA聚合酶催化以DNA为模板合成DNA的反应。

特点:

以dNTPs作底物；有模板存在；有引物存在；新链合成方向为5’→3’。

大肠杆菌有三种DNA聚合酶。

一、E.coliDNA聚合酶I

1. 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的活性

（1） 5′→3′聚合酶活性：

（2） 5′→3′外切酶活性（3） 3′→5′外切酶活性

2.大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的用途

①切口平移法制备探针

二、KlenowDNA聚合酶

Klenow片段是大肠杆菌聚合酶Ⅰ全酶经枯草杆菌蛋白酶处理后产生的大片段肽段，分子量为76 kD 。

活性:

 5’ →3’ 的聚合酶活性、3’ →5’ 的核酸外切酶活性

1.补平DNA的3′凹端２.抹平DNA的3′凸端３.通过置换反应对DNA进行末端标记４.随机引物标记５.在cDNA克隆中合成第二链；在体外诱变中，用于从单链模板合成双链DNA

三、反转录酶

反转录酶即依赖于RNA的DNA聚合酶。

它来自AMV（禽成髓

细胞瘤病毒）或Mo-MLV（Moloney鼠白血病病毒，又称M-MuLV）。

活性：

依赖于RNA的DNA聚合酶活性：

可以有效地将mRNA反转录成DNA，其产物称为cDNA（complementaryDNA）；RNaseH活性：

水解DNA-RNA杂合链中的RNA分子；

依赖于DNA的DNA聚合酶活性。

主要用途是将mRNA转录成cDNA以制备基因片段。

.14、限制性内切酶切割DNA后产生的末端有哪些类型？

限制酶在识别序列内部切割DNA分子，可产生3种不同的末端：

平末端，5’-突出末端，3’-突出末端。

（一）平末端HaeⅢ（GG↓CC）EcoRV（GAT↓ATC）

（二）粘性末端大多数限制酶交错切割DNA双链，产生5’-突出末端或3’-突出末端。

15、连接酶的功能：

（1）能封闭DNA双链或RNA/DNA杂种双链中的单链缺口，而不能封闭双链RNA中的单链缺口

（2）能封闭粘性末端退火后出现的缺口；

用途：

（1）通过粘端连接DNA分子；

（2）连接平端双链DNA分子或平端DNA与人工接头的连接。

T4连接酶反应底物为粘端、切口、平末端的RNA（效率低）或DNA

T4DNA连接酶包括分子间连接和分子内连接

由T4噬菌体产生，以ATP作为辅助因子。

可修复双链DNA上的单链缺口；连接RNA‐DNA杂交双链上的DNA链缺口或RNA链缺口；连接完全断开的两个平头末端DNA分子。

是基因工程中最常用的连接酶，可以从厂家直接购买。

连接反应最佳温度为37℃，但是此时粘性末端间氢键结合不够稳定，而且酶活性也会迅速降低。

比如，EcoRI粘性末端连接部位只有4个碱基对，很容易断开。

所以通常在4~16℃连接。

影响连接效率的因素有：

A. 温度B. ATP的浓度C. 连接酶浓度（平末端较粘性末端要求高）D. 反应时间（通常连接过夜）E. 插入片段和载体片段的摩尔比

平末端DNA之间的连接。

平末端DNA之间也可用T4DNA连接酶连接，但反应速度要慢得多。

加大酶和底物的浓度，或者加入适量的一价阳离子（Na+）和低浓度的PEG，从而提高T4DNA连接酶的连接效率。

大肠杆菌DNA连接酶所连接的是粘性末端，平末端效率低P34

16、碱性磷酸酶的用途：

防止载体。

自连其主要用途有：

⑴在用32P标记DNA5′端之前，去除5′端的磷酸；⑵在DNA重组技术中，去除DNA片段的5′磷酸，防止载体的自身环化，提高重组子比例。

第三章

供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。

质粒（Plasmid）是染色体外的遗传因子，能进行自我复制，多为超螺旋共价、闭合、环状双链DNA（cccDNA），少数线状。

大小1~200kb携带多种特殊功能基因。

17、质粒的特性

质粒（plasmid）:

独立于染色体外的裸露的双链环DNA分子。

常有1~3个抗药性基因，以利于筛选。

根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异，可以分离纯化质粒。

最常用的方法是碱裂解法：

在碱性条件（pH12.5）下，线性染色体DNA的双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的氢键虽然断裂但两条互补链彼此缠绕，紧密结合在一起。

当加入乙酸钾恢复至中性时，染色体DNA分子难以复性，而质粒DNA分子很快复性，离心时染色体DNA与细胞碎片一起被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液中。

用异丙醇或乙醇沉淀后洗涤，可得到较纯的质粒DNA。

实验室使用的质粒提取试剂盒一般也是根据碱裂解法来提取质粒。

1.质粒的复制

质粒DNA含有自己的复制起始位点（Origin，简称ori）以及控制复制频率的调控基因，有些质粒还携带特定的复制因子编码基因，形成一个独立的复制子（Replicon）。

在不同的质粒中，复制起始区的组成方式是不同的，有的可决定复制的方式，如滚环复制和复制。

在大肠杆菌中使用的大多数载体都带有一个来源于pMB1质粒或ColE1质粒的复制起始位点。

2. 质粒的拷贝数

a/\质粒拷贝数分为严谨型与松驰型。

b严谨型质粒每个细胞中拷贝数有限，大约1 ～几个；c松驰型质粒拷贝数较多，可达几百。

3. 质粒的不相容性

两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性。

它是指在第二个质粒导入后，在不涉及DNA限制系统时出现的现象。

不相容的质粒一般都利用同一复制系统，从而导致不能共存于同一宿主中。

两个不相容性质粒在同一个细胞中复制时，在分配到子细胞的过程中会竞争，随机挑选，微小的差异最终被放大，从而导致在子细胞中只含有其中一种质粒。

而不相容群指那些具有不相容性的质粒组成的一个群体，一般具有相同的复制子。

在大肠杆菌中现已发现30多个不相容群，如ColE1和pMB1，pSC101和p15A。

4. 转移性。

质粒具转移性。

它是指在自然条件下，很多质粒可以通过细菌接合作用转移到新宿主内。

它需要移动基因mob，转移基因tra ，顺式因子bom 及其内部的转移缺口位点nic。

18、标记基因按其用途可将标记基因分为选择标记基因和筛选标记基因。

选择标记用于鉴别目标DNA（载体）的存在，将成功转化了载体的宿主挑选出来筛选标记可用于将特殊表型的重组子挑选出来

选择标记基因

（1）氨苄青霉素抗性基因

青霉素可抑制细胞壁肽聚糖的合成，与有关的酶结合并抑制其活性，抑制转肽反应。

氨苄青霉素抗性基因编码一个酶，该酶可分泌进入细菌的周质区，抑制转肽反应并催化‐内酰胺环水解，从而解除了氨苄青霉素的毒性。

（2）四环素抗性基因

四环素可与核糖体30S 亚基的一种蛋白质结合，从而抑制核糖体的转位。

四环素抗性基因编码一个由399 个氨基酸组成的膜结合蛋白，可阻止四环素进入细胞。

pBR322 质粒除了带有氨苄青霉素抗性基因外，还带有四环素抗性基因。

（3） 氯霉素抗性基因

氯霉素可与核糖体50S亚基结合并抑制蛋白质合成。

目前使用的氯霉素抗性基因来源于转导性P1噬菌体（也携带Tn9）。

cat基因编码氯霉素乙酰转移酶，一个四聚体细胞质蛋白（每个亚基23kDa）。

在乙酰辅酶A存在的条件下，该蛋白催化氯霉素形成氯霉素羟乙酰氧基衍生物，使之不能与核糖体结合。

（4）卡那霉素和新霉素抗性基因（kanr,neor）

卡那霉素和新霉素是一种脱氧链霉胺氮基糖苷，都可与核糖体结合并抑制蛋白质合成。

卡那霉素和新霉素抗性基因实际就是一种编码氨基糖苷磷酸转移酶[APH（3’）‐Ⅱ,25kDa]的基因。

氨基糖苷磷酸转移酶可使这两种抗生素磷酸化，从而干扰了它们向细胞内的主动转移。

在细胞中合成的这种酶可以分泌至外周质腔，保护宿主不受这些抗生素的影响。

2、筛选标记基因

（1） α‐互补（α‐complementation）α‐互补是指lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的‐半乳糖苷酶（‐galactosidase，由1024个氨基酸组成）阴性的突变体之间实现互补。

α‐互补是基于在两个不同的缺陷‐半乳糖苷酶之间可实现功能互补而建立的。

（2）．插入失活。

通过插入失活进行筛选的质粒主要有pBR322该质粒具有四环素抗性基因（tetr）和氨苄青霉素抗性基因（ampr）两种抗性标记。

当外源DNA片段插入tetr基因后，导致tetr基因失活，变成只对氨苄青霉素有抗性。

这样就可通过对抗生素是双抗还是单抗来筛选是否有外源片段插入到载体中。

19、质粒载体的种类：

克隆载体与表达载体

1. 克隆载体克隆载体主要用于扩增或保存DNA 片段，是最简单的载体。

（1） pBR322 质粒

（2） pUC18 和pUC19（3）pUC118和pUC119质粒载体（4） pGEM‐3Z/4Z质粒载体注意：

T7和SP6启动子特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶，如：

E.coliBL21（DE3）等

2．表达载体

该类载体是在常规克隆载体的基础上衍生而来的，主要增添了强启动子，以及有利于表达产物分泌、分离或纯化的元件。

一个理想的载体，应具备以下条件：

（1）能够在宿主细胞中存在并繁殖，有功能良好的复制子和启动子，使插入基因复制和表达；

（2）具有多种限制性内切酶的切点，且切点是单一的，这样可将多个外源DNA片段插入其中；

（3）具有容易检测的筛选标记；

（4）载体DNA的分子量适当，可容纳较大的外源DNA片段，又可在受体细胞内扩增较多的拷贝；

（5）在细胞内稳定性高，这样可以使重组体可以稳定传代而不易丢失。

20、表达载体的特征：

在宿主细胞内必须能够自主复制（具备复制原点）；必须具备合适的酶切位点，供外源DNA片段插入，同时不影响其复制；有一定的选择标记，用于筛选。

另外有一定的拷贝数，便于制备。

有时还有其他附加因素，如MSC、lacZ’（a_互补）、单链噬菌体的复制起始和终止位点、启动子和入噬菌体的cos位点等。

21、代表性噬菌体载体：

插入型载体与取代型载体

噬菌体只有进入裂解循环，才能大量扩增。

因此，入噬菌体只有在特定的大肠杆菌菌株中进入裂解周期，才能用作载体。

入噬菌体载体必须含有裂解生长所必需的基因或DNA片段。

根据切除入噬菌体DNA的多少，可将入-DNA分成两大类载体：

通过特定的酶切位点允许外源DNA插入的载体称为插入型载体；允许外源DNA片段替换非必需DNA片段的载体称为取代型载体。

四、噬菌体载体的克隆原理及步骤

噬菌体载体属于克隆载体，主要用于克隆DNA片段。

构建cDNA文库和基因组文库，并从中筛选目的基因是入噬菌体载体的一般用途，也可用于亚克隆在大容量载体中增殖的外源DNA片段。

注意：

入噬菌体载体作为载体，只有DNA处于36.4~50.9kb范围内才可被包装。

体外包装：

λ噬菌载体+尾部蛋白+头部蛋白

入-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达外源基因

22、M13噬菌体P60——61M13噬菌体属丝状噬菌体，其基因组为闭合环状正链ssDNA，6407bp，其中90%的DNA都编码蛋白质，有11个基因，有两个较长的间隔区，是外源基因插入的部位。

M13噬菌体颗粒是丝状的，只感染具有F因子的大肠杆菌。

感染宿主后不裂解宿主细胞，而是从感染的细胞中分泌出噬菌体颗粒，宿主细胞仍能继续生长和分裂。

M13噬菌体载体①M13噬菌体的感染与释放不会杀死宿主菌，仅导致宿主菌生长缓慢；②M13噬菌体DNA在宿主菌内既可以是单链也可以是双链，通过感染或转化的方法能将M13噬菌体DNA导人宿主菌中；③M13噬菌体的包装不受DNA大小的限制，其噬菌体颗粒的大小可随DNA的大小而改变，即使DNA的大小比本身DNA的大小超出6倍，仍能进行包装。

粘粒载体P75

23、噬菌粒P67噬菌粒是一类人工构建的含有丝状噬菌体大间隔区以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的质粒载体。

间隔区含有噬菌体DNA合成的起始与终止及噬菌体颗粒形态发生所必需的全部顺式作用元件。

含噬菌粒的细菌被噬菌体感染后，基因II蛋白可作用于噬菌粒的间隔区，启动滚环复制，产生单链DNA并包装。

噬菌粒载体的特点：

①双链DNA既稳定，又高产，具有常规质粒的特征。

②免除了将外源DNA片段从质粒亚克隆于噬菌体这一繁琐的步骤。

③由于载体足够小，故可得到长达10kb的外源DNA区段的单链。

能像M13-DNA那样体外包装，并高效转染受体细胞能像质粒那样在受体细胞中自主复制装载量比常规的M13mp系列要大很多（10kb）

通过克隆双链DNA能获得同等长度的单一单链DNA重组操作简便，筛选容易

*外源DNA如超过10kb，则重组质粒的转化率和DNA得率都非常低**已有个别材料可用于此目的

24、粘粒的概念：

质粒的衍生物，是带有Cos序列（也称cos位点）的质粒。

Cos序列是入噬菌体DNA中将DNA包装到噬菌体颗粒中所需的DNA序列。

黏粒含有质粒复制起点（ColE）、抗生素抗性标记基因（ampr）、cos位点，可像质粒一样转化和增殖。

黏粒大小一般为5~7kb，可克隆大片段DNA，克隆的最大片段可达45kb。

25、酵母人工染色体载体酵母人工染色体（yeastartificialchromosome，YAC）是一类酵母穿梭载体，具有酵母的复制元件（ARS,CEN,TEL）、克隆位点以及可在细菌和酵母菌中选择的标记基因。

此外，YAC还具有酵母菌染色体的一些特点。

可以接受100-1000kb的外源DNA片段。

一、YAC载体的复制元件和标记基因：

YAC载体应含有下列元件1、酵母染色体的端粒序列2、酵母染色体的复制子3、酵母染色体的着丝粒序列4、酵母系统的选择标记

5、大肠杆菌的复制子标记6、AC载体的装载量为250-400Kb

人工染色体必须具备哪几个元件？

三个元件：

DNA着丝点、端粒和复制起始位点

第五章

表达系统一般包括表达载体及相应的宿主菌株。

表达载体除了提供复制属性（无论是自主复制还是整合到基因组中）外，主要是形成一种表达所必需的环境，包括启动子、终止子、核糖体结合位点，以及增强子和剪切信号等，此外还有一些与表达产物的分离纯化有关的遗传信号。

26、大肠杆菌表达载体都是质粒载体，首先具有克隆载体的特征，在此基础上增加表达元件即得表达载体。

一个表达载体含有启动子、RBS、终止子、克隆位点、大肠杆菌复制起始位点、标记基因等元件。

常用的启动子分三类，即lac启动子、trp启动子和它们的杂合启动子tac或trc，都受IPTG诱导。

T7噬菌体启动子、λ噬菌体的PL启动子。

P87具体

噬菌体启动子PL的可控性：

噬菌体启动子PL受CI阻遏蛋白阻遏，很难直接诱导控制。

在基因工程中常使用温度敏感型的cI突变基因cI857控制PL。

cI857阻遏蛋白在42℃时失活脱落，PL便可介导目的基因的表达。

但在大型细菌培养罐中迅速升温非常困难，因此常使用一个双质粒控制系统，用色氨酸间接控制目的基因表达。

重点看图P89

1、T7噬菌体启动子只能由T7噬菌体的RNA聚合酶识别，大肠杆菌的RNA聚合酶无法识别。

将T7RNA聚合酶基因（T7gene1）置于lacUV5启动子之后，构建噬菌体，再将此噬菌体整合到大肠杆菌基因组，得到大肠杆菌BL21（DE3）。

将pET表达载体导入大肠杆菌后，因为大肠杆菌的lacI基因产生阻遏蛋白，lacUV5启动子无法启动T7RNA聚合酶转录，T7启动子也就无法启动。

如果在大肠杆菌中再引入一个带有T7噬菌体的溶菌酶编码基因的质粒，如pLysS或pLysE，它们表达的T7溶菌酶可抑制T7RNA聚合酶的活性，进一步防止在未添加IPTG时T7启动子激活。

2、通过宿主控制T7RNA聚合酶的量来实现的，即在宿主细胞中引入一个带有T7噬菌体的溶菌酶编码基因的质粒，如pLysS或pLysE，它们分别低量和高量表