发酵工程重难点分析.docx

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发酵工程重难点分析

发酵工程重难点分析

一填空题

1.德国人柯赫1905年因其关于肺结核的出色工作获得了诺贝尔奖，他首先发明了固体培养基，得到了细菌的纯培养物，由此建立了微生物的纯培养技术。

这就开创了人为控制发酵过程的时期，再加上简单密封式发酵罐的发明，发酵罐里技术的改进，发酵工业逐渐进入了近代化学工程的行列。

2.通过控制培养时的氧，可将好氧和厌氧微生物分开；在高温下培养，可将嗜热微生物和非嗜热微生物分开；控制不同的pH条件，可分离出嗜酸或嗜碱微生物；使用高糖或高盐的培养基进行培养，可获得耐高渗透压的微生物。

、

3.在临床上有效的抗肿瘤药物，大部分是直接作用于核酸或抑制核酸生物合成的物质。

由于从微生物到人类的核酸结构和生物合成方式有许多共同之处，因此大部分抗肿瘤药物也会具有抗菌和抗真菌的活性。

目前发展出利用微生物筛选作用于DNA的抗肿瘤药物的方法。

4.优良菌种的选育为生产提供了各种类型的突变株，大幅度提高了菌种产生有利用价值代谢产物的水平，还可以改进产品质量，去除不需要的代谢产物或产生信的代谢产物。

特别是基因工程、细胞工程和蛋白质工程等较为定向技术的发展。

5.温度除了影响发酵过程中各种反应速率外，还可以通过改变发酵液的物理性质，间接影响微生物的生物合成。

例如，随着温度的升高，气体在溶液中的溶解度减小，氧的传递速率也会改变。

另外温度还影响基质的分解速率，例如，菌体对硫酸盐的吸收在25℃时最小。

6.发酵法生产抗生素的主要工艺步骤包括菌种的制备、种子扩大培养、发酵、

发酵液的预处理、代谢产物的分离纯化、干燥，最后制得产品。

二、选择题

1.在四环素发酵中加入（B）能增强戊糖循环，促进四环素的合成。

A.苯乙酸B.硫氰化卞C.巴比妥药物D.柠檬酸

2.分离柠檬酸产酶的黑曲霉就是利用（D）达到分离目的的。

A.调节渗透压B.调节溶解氧C.加多量葡萄糖D.调节培养基PH

3.分离细菌时，正在培养基中加入浓度为50V/Ml（D），可抑制霉菌和酵母菌的生长。

A.葡萄糖B.甘氨酸C.赖氨酸D.制霉菌素

4.分离根霉和毛霉时，由于这些微生物的菌丝易蔓延成片，难以得到纯化的菌落，通常在培养基中添加0.1%（A），防止菌落蔓延，是菌落长得小而紧密。

A.去氧胆酸钠或山梨糖B.制霉菌素C.青霉素D.红霉素

5.在谷氨酸发酵中，生产菌的最适生长温度为（A）

A.30~40℃B.20~25℃C.36~37℃D.40~41℃

6.在通常情况下，培养液中的溶解氧只能维持菌体正常生命活动（A）。

A.20~50sB.20~50分钟C.1~5分钟D.50~80分钟

7.发酵工业一般来说，无菌实验的肉汤过培养基平板应保存并观察主本批（罐）放罐后（C）h，确认为无菌后才能弃去。

A.2B.20C.12D.200

8.我国20世纪40年代初开始用（A）生产柠檬酸。

A.浅盘发酵B.深层发酵C.石油发酵D.薯干深层发酵

9.产柠檬酸黑曲霉发酵过程，（A）4+能有效的解除柠檬酸对pFK的抑制。

A.NHB.Zn2+C.Mg2+D.SO42+

10.柠檬酸发酵中，（A）酶是柠檬酸大量合成的第一关键。

A.柠檬酸合成酶B.异柠檬酸脱氢酶C.乌头酸酶D.磷酸果糖激酶

11.以薯干为原件的柠檬酸深层发酵中，种子培养基采用的薯干粉浓度为（A）。

A.8%~10%B.10%~16%C.0.8%~1.0%D.20%~21%

12.在柠檬酸发酵中，（A）离子激活顺乌头酸酶。

A.铁B.CuC.ZnD.Na

13.用生物素亚适量法的谷氨酸发酵，生物素在培养基的量应控制在（A）mg/L。

A.5~10B.15~20C.25~30D.35~40

14.在谷氨酸发酵中，培养基中的生物素的量若适量，谷氨酸就不会排出菌体细胞外，原因是（B）。

A.细胞膜渗透性加大B.细胞膜渗透性减少

C.细胞壁渗透性加大D.细胞壁渗透性减少

三、判断题

1.在抗生素发酵的后期升高温度，加强氨基酸的反馈抑制作用，从而提前一些使蛋白质和核酸的合成途径关闭，使代谢更有效地转向抗生素合成。

2.抗生素工业的发展很快促进了其他发酵产品的出现。

如19世纪50年代氨基酸发酵工业，在引进了“代谢控制发酵技术”后，得以快速发展

3.生长因子如氨基酸和核苷酸的产生能作为分离中的选择压力，也可以用随机分离法进行初筛，然后通过进一步的检测得到产生菌。

4.胸腺嘧啶和鸟嘌呤可以氨基式或亚氨基式出现，胞嘧啶和腺嘌呤可以酮式或烯醇式出现。

平衡时倾向于酮式或氨基式的，因此DNA双链中以AT和GC碱基配对为主。

5.在工业生产上，由于各种条件因素的影响，自然突变是经常发生的，也造成了生产水平的下降，所以技术人员很注意从高生产水平的批次中，分离高生产能力的菌种再用于生产。

6.沙土管干燥保藏法适用于产生孢子的丝状真菌和放线菌，或形成芽孢的细菌。

其原理是造成干燥和寡营养的保藏条件。

7.玉米浆是玉米淀粉生产的副产品，其中固体物质含量在50%以上，是一种非常容易被微生物利用的氮源。

8.所谓菌体生长类型指的是终产物就是菌体本身，菌体增加与碳源利用平行，且两者之间有定量关系。

9.发酵罐的高度与直径之比一般为1.7～4∶1，在这个范围内，有利于提高空气的利用率。

10.在相同搅拌功率下比较粉碎气泡的能力，平叶搅拌器大于弯叶搅拌器，弯叶搅拌器大于箭叶搅拌器。

但径向搅动量即翻动液体的能力则与以上相反。

11.对于大量的培养基和发酵设备的灭菌，最有效、最常用的灭菌方法是蒸汽灭菌（即湿热灭菌）。

12.标准式发酵罐内装设机械搅拌器的作用是将空气打碎成小气泡，增加气液接触界面，提高氧的传质速率；同时使发酵液充分混合。

13.抗生素一般主要是利用微生物发酵法进行工业化生产，极少数抗生素如青霉素、磷霉素等可用化学法生产。

此外，还可用天然抗生素进行化学结构改造

14.氨基酸发酵液通常采用离心进行固液分离；采用等电点法提取氨基酸；然后用活性炭脱色，过滤除去活性炭；再用离子交换法或重结晶法进行精制。

（有红字的是错误的）

四、名词解释

1.乳化

2.机械消沫

3.带溶剂

4.流态型泡沫

5、机械搅拌发酵罐6末端产物阻遏等等12个名词解释

5、分析题

1、请根据图1分析这2种补糖方式。

图1不同调节pH的方法对青霉素G合成的影响

如图1所示，采用按需补糖和恒速补糖两种方法，按需补糖是根据pH的变化来决定补糖速率，恒速补糖则通过加入酸碱来控制pH，总补糖量均为9%。

虽然这两种方法均能达到控制pH的目的，并且糖耗速率几乎相等，但前者可维持长久的青霉素高产，最终比后者的产量提高了25%。

2、请根据图2分析供氧方面的阻力和耗氧方面的阻力。

图2氧传递的各种阻力示意图

这些阻力包括供氧方面的阻力（图2,1～4）和耗氧方面的阻力（图2,5～9）。

当细胞以游离状态存在于液体中时，阻力7消失；当细胞吸附在气液界面上时，阻力4、5、6、7消失。

3、请根据图3分析你可以得出什么结论？

图3嘧啶生物合成的限速酶调节方式

天门冬氨酸转氨甲酰酶是催化嘧啶生物合成途径中的第一个反映，它的活力是受该途径的种产物胞苷三磷酸的抑制。

ATP是ATPCase的第二个效应物，它活化ATPCase，得以协调嘌呤和嘧啶的合成。

4、图4表示的是盐析和盐溶，请分析产生盐溶的原因及稀盐溶液为什么常用于大多数生化物质的提取？

图4溶液离子强度与蛋白质溶解度

盐溶现象的主要原因是少量离子的活动，减少了偶极溶质分子间极性基团的静电吸引力，增加了溶质和溶剂相互作用的结果。

盐溶现象不仅在水中，而且在低介电常数的溶剂（如乙醇）中同样发生。

低离子强度溶液还对一些生物物质的生理活性有稳定作用，所以稀盐溶液常用于大多数生化物质的提取。

六、问答题

请说明大肠杆菌乳糖操纵子的两种效应物的共同调节。

原核生物中，分解酶合成的调节方式有的更为复杂，对它们的调控除需要效应物外，还需要活化蛋白的参与调解。

如乳糖操纵子的调节与大肠杆菌胞内的cAMP的浓度有关。

cAMP与cAMP的受体蛋白（CRP）结合成复合物，然后其调节作用。

CRP不能单独与启动基因结合，只有在与cAMP结合后发生自身构型变化，才能结合到启动基因上，促使RNA聚合酶结合到启动基因的另一位点。

如果此时有效应物存在，调节蛋白不能结合至操纵基因上，乳糖操纵子的结构基因才能转录。

当cAMP不存在或CRP不存在时，即使效应物（如乳糖）存在，RNA聚合酶也不能结合到启动基因上，不能使结构基因转录和表达。

请以肠细菌中精氨酸和嘧啶核苷酸的合成途径为例说明联合激活或抑制调节。

肠细菌中精氨酸和嘧啶核苷酸的合成途径是完全独立的，但它们有一个共同的中间体——氨甲酰磷酸，负责合成这个中间体的酶——氨甲酰磷酸合成酶可以被嘧啶代谢途径的代谢物UMP反馈抑制，也可以被精氨酸合成途径的中间体鸟氨酸激活。

如有嘧啶时，UMP在胞内库存量升高，氨甲酰磷酸合成酶被抑制。

由于氨甲酰磷酸的耗竭导致鸟氨酸堆积，从而刺激了该酶的活性，使鸟氨酸合成受阻。

随着鸟氨酸在胞内浓度下降，此酶活力下降。

温度影响发酵液的物理性质

温度除了影响发酵过程中各种反应速率外，还可以通过改变发酵液的物理性质，间接影响微生物的生物合成。

例如，温度对氧在发酵液中的溶解度就有很大的影响，随着温度的升高，气体在溶液中的溶解度减小，氧的传递速率也会改变。

另外温度还影响基质的分解速率，例如，菌体对硫酸盐的吸收在25℃时最小。

在四环类抗生素发酵中温度如何影响生物合成的方向？

抗生素发酵的后期为什么要降低温度？

在四环类抗生素发酵中，金色链丝菌能同时产生四环素和金霉素，在低于30℃时，它合成金霉素的能力较强。

随着温度的提高，合成四环素的比例提高。

当温度超过35℃时，金霉素的合成几乎停止，只产生四环素。

对微生物代谢调节的研究发现，温度与微生物的调节机制关系密切。

例如，在20℃时，氨基酸末端产物对其合成途径的第一个酶的反馈抑制作用，比在其正常生长温度37℃时更大。

根据这一发现，可以考虑在抗生素发酵的后期降低温度，加强氨基酸的反馈抑制作用，从而提前一些使蛋白质和核酸的合成途径关闭，使代谢更有效地转向抗生素合成。

影响发酵温度的因素：

发酵热

生物热（Q生物）

微生物在生长繁殖过程中，本身产生的大量热称为生物热。

这种热主要来源于营养物质如碳水化合物、蛋白质和脂肪等的分解产生的大量能量，这些能量部分被用于合成高能化合物，并被消耗在各种代谢途径中，如何成新的细胞组分、膜的运输功能、细胞物理和化学完整性的维持、运动性细胞器的活动、合成次级代谢产物等，除此之外，在一些代谢途径中，高能磷酸键可以以热的形势散发出去。

请说明生物热产生的阶段性、培养基成分对生物热的影响。

生物热产生的大小有明显的阶段性，在孢子发芽和生长初期，生物热的产生是有限的，当进入对数生长期以后，生物热就大量产生，成为发酵过程热平衡的主要因素。

此后生物热的产生开始减少，随着菌体的逐步衰老、自溶，愈趋低落。

并且生物热也随着培养基成分的不同而变化。

在相同条件下，培养基成分越丰富，营养被利用的速度越快，产生的生物热就越大。

青霉素菌种

青霉素生产菌株一般为产黄霉素，根据深层培养菌丝体的形态，分为球状菌和丝状菌。

在发酵过程中，产黄青霉的生长发育可分成6个阶段。

①分生孢子的Ⅰ期；

②菌丝繁殖，原生质嗜碱性很强，有类脂肪小颗粒产生为Ⅱ期；

③原生质嗜碱性仍很强，形成脂肪粒，积累藏物为Ⅲ期；

④原生质嗜碱性很弱，脂肪粒减少，形成中、小空泡为Ⅳ期；

⑤脂肪粒消失，形成大空泡为Ⅴ期；

⑥细胞内看不到颗粒，并有个别自溶细胞出现为Ⅵ期。

其中I-IV期称为菌丝生长期，菌丝的浓度增加很多，但产生的青霉素较少，处于该时期的菌丝体适于用做发酵的种子.Ⅳ-v期是青霉素的分泌期，此时菌丝体生长减缓，并大量产生青霉素。

Ⅵ期是苗丝体的自溶期。

氨基酸发酵发酵条件控制

发酵过程主要控制的条件是pH值、温度、溶解氧和泡沫等。

pH值是通过流加尿素或氨水来控制。

菌种生长和产生氨基酸时的最适温度是不同的，并且随著菌种的不同而异。

不同氨基酸的最适供氧条件和最适pH值条件可以看出，不同的发酵也有不同的要求。

发酵过程中会产生大量泡沫，通常采用天然油脂如豆油、玉米油或化学合成消沫剂如还氧丙烯环氧乙烯聚醚类进行消沫，应注意控制用量和加入方式。

为了使发酵罐发挥最大的生产效率，发酵罐必须满足几个要求：

①发酵罐必须能承受一定的压力。

②发酵罐要有适宜的径高比。

③发酵罐的搅拌通风设备能使气液成分混合，实现传质传热作用，保证微生物发酵过程中所需的溶解氧。

④发酵罐应具有足够的冷却面积。

⑤发酵罐内应尽量减少死角，避免藏污积垢，保证灭菌彻底，防止染菌。

⑥搅拌器的轴封要严密，以减少泄露。

影响发酵液过滤的因素

发酵液的过渡速度与菌体细胞体积、各种发酵条件如培养基的组成、来利用完的培养基浓度、消沫剂、发酵周期等有关。

菌体对过滤速度影响很大。

从表11-1可见，不同的抗生素产生菌发酵液的过滤特性参数相差很大，可达几个数量级。

一般真菌的菌丝体比较粗大,像产黄青霉的菌丝直径为10µm,因此质量比阻値rB,仅为（0.15~0.20）X1012m/kg.发酵液不需特殊.处理就很容易过滤。

放线菌菌丝细而分支,交织成网格状,如链霉菌菌丝直径仅0.5~1.0µm左右,发酵液还含有大量糖类物质，黏度高,因此质量比阻值rB约为2X1015m/kg左右,过滤较困难,发酵液需要进行预处理,凝固蛋白质等胶体物质,提高过滤速度。

细菌的菌体更细小,发酵液如不用絮凝等方法预处理,往往很难用常规过滤设备进行过滤操作。

培养基的组成很明显地影响过滤速度。

如用黄豆饼粉、花生饼粉做氮源.淀粉做碳源,会增加过滤难度。

在链霉素发酵液的培养基中,若以黄豆饼粉代替玉米浆,则比阻值增大1倍以上（表11-1）。

在青霉素发酵培养基中加人酵母蛋白,比阻值也会提高很多。

此外，正确地判断发酵终止时间，对过滤会有很大的帮助。

例如，在发酵后期要少加消沫剂和少进行补料，防止消沫剂和未完的培养基增加过滤难度。

放罐时间应在菌体发生自溶之前，因菌体自溶释放出的代谢产物会增加发酵液粘度，使过滤困难。

总之，延长发酵时间能够使发酵单位有所提高，但发酵时间的延长会致使发酵液色素和胶体杂质增多，过滤困难，最终导致产品质量下降，反而得不偿失。

连续培养与分批培养中相比，有以下优点:

①可以提高设备的利用率和单位时间产量，直保持一个期的稳定状态。

②发酵中各参数趋于恒值，便于自动控制。

③易于分期控制。

可以在不同的罐中控制不同的条件。

连续培养的方法很多，而且可以从不同的角度上来分类。

如从设备上可分为罐式和管式;从控制方法上可分为恒成分培养和恒浓度培养；所使用的菌种可以是循环式或非循环式；还可以是单级或多级的连续培养方式。

利用营养缺陷型突变菌株可以产生那几类产物？

•在营养缺陷型突变菌株中，生物合成途径中的某一步发生了酶缺陷，合成反应不能完成，末端产物不能积累，因此末端产物的反馈调节被解除。

只要在培养基中限量加入所要求的末端产物，克服生长障碍，就能使中间产物积累。

•在直链式的氨基酸、核苷酸生物合成中，营养缺陷型突变株只能积累中间产物，而不能积累终产物。

在分支代谢途径中，筛选的营养缺陷型突变株是通过解除协同反馈调节，可使另一分支代谢途径中的末端产物积累。

而遗传障碍不完全突变即渗漏型突变，是一种酶活性下降的突变，不是完全丧失酶活性，因此不会过量积累末端产物，可避免反馈调节作用，大量积累中间产物，这种突变菌株在不添加相应物质的基本培养基上长成很小的菌落。

补料

目前生产上多采用丰富培养基来提高产量，随着丰富培养基的运用，又带来了新的问题。

过于丰富的碳、氮源会使菌体大量繁殖，营养物质都消耗在菌体生长上，到了产物合成阶段，一则由于营养消耗，二则由于菌体过早衰老、自溶，反使产量降低。

并且基础料的浓度过高，会使培养基过于粘滞，致使搅拌动力消耗增加，消沫困难，溶解氧下降，渗透压过高等，以致不利于细胞的生长

补料需要有正确的方法，其关键在于控制补料的时间、速率和配比。

其目的是不使菌体生长繁殖过快，仅仅维持呼吸，即处于半饥饿状态，但是仍能合成产物。

请说明发酵第Ⅲ型特点是什么？

这一型的特点是产物形成一般在菌体生长接近或达到最高生长时期，即稳定期。

产物形成与碳源利用无准量关系，产量远低于碳源的消耗量。

所以也称为与生长不相关型（图9-1c）。

次级代谢产物如抗生素、维生素多属于此类，最高产量一般不超过碳源消耗量的10%。

抗生素中的土霉素、氯霉素和杆菌肽不属于这一类型。

溶剂萃取之有机溶剂的选择

选择萃取用的溶剂应该考虑对产物有较大的溶解度和良好的选择性。

分离因

素可以表征溶剂的选择性如何，溶解度则由相似相溶的分子极性所决定。

介电常数是一个化合物摩尔极化程度的量度，通过这一数值，可以预知一个

化合物是极性化合物还是非极性化合物。

了解了各种溶剂的介电常数后，就可测定被萃取的产物的介电常数，来寻找极性相当的溶剂，以获得萃取能力强、选择性高的溶剂分离体系。

选择溶剂除了以上要求外，还应该注意溶剂与被萃取液的互溶度要小，黏度

低，界面张力适中，对相的分散和相的分离有利；溶剂的化学稳定性高，回收和再生容易；价格低廉；安全性好，如闪点高、毒性低等。

在微生物代谢的提取中，常使用乙酸乙酯、乙酸丁酯、丁醇等。

4.3.2.1末端产物阻遏

末端产物阻遏的阻遏物为终产物，这种阻遏方式常普遍存在于氨基酸、核苷酸生物合成途径中。

首先是在研究甲硫氨酸生物合成途径中发现的。

大肠杆菌细胞中有三种酶，即同型丝氨酸转移酶、胱硫醚合成酶和同型半胱氨酸甲基化酶，当培养基中存在有甲硫氨酸时，检测不到它们的存在；而甲硫氨酸不存在时，可以检测到它们的活性。

表明这些酶均是受甲硫氨酸的阻遏。

4.3.2.2分解代谢产物阻遏

分解代谢产物阻遏是在研究碳源对微生物生长的影响时发现的。

发现葡萄糖能够抑制其他糖的利用，只有在葡萄糖利用完以后，才开始利用其他的糖。

在利用其他糖时，有一生长停滞期，是利用第二种糖的酶合成的时期。

这种酶诱导的阻遏现象最初以为只限于葡萄糖，因而被称为葡萄糖效应。

后来发现所有可以迅速利用或代谢的能源，都能阻遏异化另一种被缓慢利用能源所需酶的形成，故称为分解代谢产物阻遏。

葡萄糖代谢阻遏实际上并不是葡萄糖本身起到阻遏作用，而是它的分解代谢产物引起的阻遏作用。

机械方法消沫

机械消沫是利用物理作用，靠机械的强烈震动和压力的变化促使泡沫破碎。

机械消沫的方法有多种，一种是在罐内将泡沫消除，最简单的是在搅拌轴的上部安装消沫桨，当消沫桨随着搅拌轴转动时，将泡沫打碎。

另一种是将泡沫引出罐外，通过喷嘴的加速作用和利用离心力消除泡沫后，液体再返回罐内。

机械消沫的优点是不需要引入外来物质，可节省原材料，减少杂菌污染的机会，也可以减少培养液性质的变化，对提取工艺无任何副作用。

其缺点是效率不高，对粘度较大的流态型泡沫几乎没有作用，也不能消除引起泡沫稳定的根本原因。

所以，仅作为消沫的辅助方法。

也有在罐内装设超声波和超声波器的进行消沫的。

赖氨酸发酵的培养基组成情况。

L-赖氨酸发酵主要是用通气搅拌发酵罐进行分批发酵。

尽管也可以利用其他的碳水化合物、醋酸或乙醇，但甘蔗糖蜜是它最偏好的碳源，常常还要补充大豆水解物。

发酵温度维持在28℃，用尿素或氨水维持PH在中性附近，尿素或氨水也可以祈祷氮源的作用。

生物素浓度的控制非常重要，因为生物素浓度在30ug/L以上，就会导致L-谷氨酸取代L-赖氨酸而积累。

甘蔗蜜糖一般含有适量的生物素，可以满足生长的需求。

消沫剂对KLa的影响

在发酵过程中加入的消沫剂，会分布在气液界面，增大传递阻力，使KL下

降。

发酵过程中，各种原因可以使发酵液产生泡沫，其中发酵性泡沫中氧分压很

低，而二氧化碳分压则很高，这类泡沫相当稳定且不易破碎，对发酵产生许多不

利影响，也是逃液的主要原因。

加入消沫剂是消除泡沫的重要手段。

使用的消沫

剂是表面活性物质，尽管会引起溶解氧浓度的暂时下降，但最终会有效地改善发

酵液的通气效率.

另外作业和测验也要，大家要全面复习基础上再看上面材料，