培养基制备的质量控制.docx

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培养基制备的质量控制

规章制度汇编

文件编号：

JSCDC/05-026　

受控号：

2009-12-026

培养基制备的质量控制

第Ⅰ版第0次修改

共5页第1页

1.目的

微生物实验室主要工作是对各种微生物进行保存、复苏、培养、检测和（或）计数，所用的培养基应对样品和被测微生物都具有特异性，为了满足微生物分析过程对培养基最低要求，和保证能够获得重现性结果，确保分析结果准确、可靠，必须对培养基的制备过程进行有效的监控，从而保证结果的可信和有效。

2.适用范围

微生物实验室所有培养基的接收、贮存和制备过程。

3.职责

培养基管理人员：

收到培养基后按要求对培养基进行接收、记录和贮存。

培养基制备人员：

培养基的制备整个过程应严格按要求进行。

科室负责人：

负责对培养基的订购和综合管理。

4.培养基的接收与贮存

4.1生产企业应提供的文件

4.1.1培养基的独立成份、添加成分及产品编号及批号。

4.1.2培养基使用前的PH，储存信息和有效期。

4.1.3性能评价和所用的测试菌株，技术数据清单，质控证书，必要的安全/危险数据。

4.2实验室检查记录

实验室收到培养基后应检查：

培养基名称和批号，接收日期，有效期，包装及其完整性。

4.3贮存

应严格按照供应商提供的贮存条件,有效期和使用方法进行培养其的保存和使用。

培养基的购买应有计划，以利于存货的周转（即掌握先购先用的原则）。

4.3.1脱水培养基及其添加成分：

新购买的培养基一般为脱水的粉状或颗粒状，保存在密闭的容器中。

用于菌种选择或鉴定的添加成分通常为冻干物或液体。

实验室保存有效的培养基目录清单应包括的内容有：

容器密闭性复查、首次开封日期、内容物的感官检查（如粉末流动性、均匀性、结块情况和色泽变化等）。

4.3.2商品化即用型培养基：

应严格按照供应商提供的贮存条件、有效期和使用方法进行保存和使用。

4.3.3商品化的脱水合成培养基和各别成分制备的培养基：

这类培养基的贮存有效期各不相同，一般无法做到统一规定。

可参照不同标准中的规定执行。

培养基灭菌分装到平皿、试管或测试瓶中，不能立即使用的培养基应避光、干燥保存。

除特殊说明和标准规定，通常情况下基础培养基（如使用前入添加成分的培养基）应在4℃

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冰箱中保存不超过3个月，或在室温（20℃）下保存不超过1个月，以保证其成分不改变；不稳定选取择性物质和其它添加成分应即配即用；对发生化学反应或含有不稳定成分的固体培养基也应即配即用，不可二次融化。

观察培养基颜色变化，是否有蒸发、脱水情况，是否有微生物生长。

当培养基发生这类变化时，应禁止使用。

使用和进一步加热前，应事先将培养基放置到室温。

5.培养基的实验室制备

5.1概述

使用脱水培养基和其他含有有害物质（胆盐或其它选择剂）的成分时，应遵守良好实验室规范和生产厂商提供的使用说明配制，如质量/体积、pH、制备条件、灭菌条件和操作步骤，并做好记录。

5.2水

配制培养基使用蒸馏水或相同质量的水，以排除测试条件下抑制或影响微生物生长的物制。

如果蒸馏水的用氯消毒的水制备的，在蒸馏前应先对氯进行中和（见GB/T6682）。

盛放蒸馏水的容器最好是由中性材料制成的（如中性玻璃、聚乙烯等）。

为保证蒸馏水的质量，电导率应＜10ms/m（＜100µs/cm），细菌数＜50CFU/mL，建议每月至少检测一次。

警告：

采用离子交换器（去离子）生产的去离子水，微生物含量较高，这种水在过滤灭菌后仍可能带有细菌生长的抑制因子。

所以配置培养基时最好不要使用这种方法生产的去离子水而应使用蒸馏水。

5.3称量和复水

称量所需的脱水培养基（注意缓慢操作，必要时佩带口罩或在通风柜中操作，以防吸入含有毒物质的培养基粉末），先加入少量的水，充分混合（注意避免培养基结块），然后再加入至所需的量。

5.4溶解

脱水培养基加水后适当加热，并不停搅拌使其快速溶解，必要时，重新溶解。

含琼脂的培养基在加热前应先浸泡几分钟，用各别成分制备的培养基应将不同成分分别加入适量的水中，并充分溶解，然后再加入到所需的量。

5.5pH的测定和调整

用pH计测pH，必要时进行调整。

在实验室用各别成分制备培养基，除特殊说明外，培养基灭菌后冷却到25℃时，pH的变化不应超过0.2个单位。

一般使用浓度约为40g/L（约1mol/L）的氢氧化钠溶液或浓度为36.5g/L（约1mol/L）的盐酸溶液调整培养基的pH。

注：

商品化的培养基高压灭菌后pH值可能变化很大，但采用优质蒸馏水或去离子水配配制时，灭菌前无需调节pH值。

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5.6分装

将制配制好的培养基分装到适当的容器中，根据不同用途，容器的体积可为培养基的1倍、2倍或3倍。

5.7灭菌

培养基和试剂应采用湿热灭菌或过滤灭菌。

亮绿培养基等特定的培养基中含有对光和热敏感的物质，只能煮沸灭菌，煮沸后应迅速冷却，避光保存；明胶、血清、糖类等不耐高温的物质，应采用高压低温灭菌法/间歇灭菌法灭菌；有些试剂则不需灭菌，可直接使用（参见相关标准或供应商使用说明）。

5.7.1湿热灭菌：

湿热灭菌在高压锅或制备培养基的容器中进行，高压灭菌一般采用121℃灭菌15min，当培养基体积超过1000mL时，要对灭菌条件进行适当调整，但应按照标准或使用说明的规定进行。

高压灭菌过程要通过放置到特定的位的热电耦或测试条进行监测，以保证灭菌的效果。

灭菌效果控制是关键，加热后采用适当的方法冷却，以防加热过度。

这对于肠道菌培养基和大容器中的培养基等的灭菌十分重要。

注：

大容量（＞1000mL）的培养基灭菌时可能会造成过度加热。

5.7.2过滤灭菌：

过滤灭菌可在真空负压或正压的条件下进行，使用也孔径为0.22µm的滤膜和过滤垫，过滤前先将滤膜和滤垫灭菌，过滤器于121℃灭菌15min（可以整体灭菌也可以拆卸后灭菌），灭菌后在无菌条件下组装。

注：

一些滤膜上附着有蛋白质（如抗生素），为达到有效过滤，应事先将膜用无菌水润湿。

5.7.3监测:

应对经湿热或过滤灭菌的培养基进行监测,尤其要对pH、色泽、灭菌效果和均匀度等指标进行监测。

5.8添加成分的制备

制备有毒物质的添加成分（尤其是抗生素）时应小心操作（必要时在通风柜中操作），避免因粉末的扩散造成实验人员过敏或发生其他不良么应；制备溶液时小心按产品使用说明书操作，不要使用过期的试剂，抗生素工作液应现用现配；批量配制的抗生素溶液分装后冷冻贮存，但解冻后的贮存溶液不能再次冷冻；厂商应提供冷冻对抗生素活性影响的有关资料，也可由使用者自行测定。

6.培养基的使用

6.1琼脂培养基的融化

将培养基放到沸水浴中或采用有相同效果的方法（如高压锅中的蒸汽）使之融化。

经过高压的培养基应尽量减少重加热时间，避免过度加热。

培养基融化后放入47℃±2℃的恒湿

水浴锅中保温，直至使用。

融化后的培养基应尽快使用，放置时间一般不应超过4h。

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6.2培养基的脱气

必要时，将培养基在使用前放到沸水或蒸汽浴中加热15min，加热时松开容器的盖子；加热后盖紧，并迅速冷却至使用温度。

6.3添加成分的加入

对热团党委稳定的添加成分应在培养基冷却至47℃±2℃时再加入。

灭菌的添加成分在加入之前，应先放置到室温，避免冷的液体造成琼脂凝结或形成片状物。

将加入添加成分的培养基缓慢充分混匀，尽快分装到待用的容器中。

6.4平板的制备和储存

倾注融化的培养基到平皿中，使之在平皿中形成一个至少2mm厚的琼脂层（直径90mm的平皿通常加入15mL琼脂培养基）。

将平皿盖好皿盖放到水平平面使琼脂冷却凝固。

凝固后的培养基应立即使用或存放于暗处和（或）4℃～12℃冰箱的密封袋中，最好存放一周或按厂商提供的标准执行。

在平板底部做好标记，标记内容包括名称、制备日期和（或）有效期。

也可以使用适宜的培养基编码系统进行标记。

将倒好的平板放在密封袋中冷藏保存可延长贮存期限。

为了避免产生冷凝水，平板应冷却后再装入袋中。

贮存前不要对培养基表面进行干燥处理。

对于采用表面接种形式培养的固体培养基，应先对琼脂表面进行干燥：

揭开平皿盖，将平板倒扣于烘箱/培养箱中（温度设为25℃±50℃）；或放在有对流风的无菌净化台中，直到培养基表面的水滴消失为止。

注意不要过度干燥。

商业化的平板琼脂培养基应按厂商提供的说明使用。

6.5培养

培养时每垛最多堆六个平板，平板间要留有空隙以保证空气流通，使培养物的温度尽快与培养箱温度达到一致；液体培养基温度与培养箱达到一致取决于很多因素，如体积、内容物量、容器类型、培养类型等；使用厌氧罐时，堆放的平板数可以超过六个。

6.6培养基的弃置

所有污染和未使用的培养基的弃置应采用安全的方式，并且要符合相关法律法规的规定。

7.成品的质量控制

7.1物理指标控制

培养基的实验室测试至少应包括：

20℃～25℃的pH值，并应观察加入培养基的量、琼脂层厚度、色泽、透明度和（或）是否存在肉眼可见的杂质、凝胶稳定性黏稠度和湿度。

7.2微生物指标控制

7.2.1污染控制:

从每批制备好的培养基中选取部分样品进行污染测试。

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7.2.3测试菌株:

测试菌株是具有其代表种的稳定特性并能有效证明实验室特定培养基最佳性能的一套菌株。

测试菌株主要购置于标准菌种保藏中心，也可以是实验室自己分离的具有良好特性的菌株。

每种培养基的测试菌株应包括：

具典型反应特性的强阳性菌株、微弱生长的阳性菌株（对培养基中选择剂等试剂敏感性强的菌株）、非特异性菌株（如产生不同发酵反应和荧光反应的菌株）、阴性菌株。

7.2.4即用型培养基和试剂：

商品化即用型培养基的生产厂如果经过ISO9001体系认证或满足相应质量要求，可相要求厂商提供相应的资质证明，这样，就不必再进行大量的培养基测试工作，但应保证培养基的贮存条件。

7.2.5商品化合成脱水培养基制备的培养基：

对每批新购置的商品化合成脱水培养基使用前应用标准菌株（见附件3〈常用培养基测试用菌株及指标〉）进行相应的测试，以保证培养基的质量（具体操作见附件1〈培养基性能测试作业指导书〉），并将测试结果记录于培养基测试结果记录单（见附件2）不含指示剂或选择剂的培养基，只需用阳性菌株进行检测；含有指示剂或选择剂的培养基，应使用能证明其指示或选择作用的菌株进行试验；复合培养基（即需加入添加成分的培养基）需用具备7.2.3性能的菌株进行验证；实验室制备的需加入添加成分的即用型培养基本条款同样适用。

8.支等性文件

SN/T1538.1-2005培养基基制备指南第1部分:

实验室培养基制备质量保证通则。

GB/T27405-2008实验室质量控制规范食品微生物检测

附件1：

培养基性能测试作业指导书

1.目的

微生物实验室主要工作是对各种微生物进行保存、复苏、培养、检测和（或）计数，所用的培养基应对样品和被测微生物都具有特异性，为了满足微生物分析过程对培养基最低要求，和保证能够获得重现性结果，确保分析结果准确、可靠，必须对培养基的性能进行测试和监控，从而保证结果的可信和有效。

2.适用范围

微生物实验室所常用培养基的质控和性能测试。

3.职责

测试人员：

负责按照本检测细则对被培养基进行测试。

复核人员：

负责对测试操作是否规范以及检测结果是否准确进行复核。

科室负责人：

负责对科室综合管理和检测报告的签发。

4.常规质量控质要求

4.1基本要求

供应商或制备者应确保培养基的理化特性满足相关标准的要求,以下特性的质量评价结果应符合相应的规定：

分装数量、外观、色泽、均一性、琼脂凝胶的硬度、水分含量、pH、缓冲能力、微生物污染。

4.2微生物学要求

应选择能代表整批产品的样品进行微生物学性能测试。

4.2.1微生物污染

按批次的不同选择适量的培养基在适当条件下培养，测定其微生物污染。

生产商应根据每种固体或液体培养基成分、制备要求和包装类型的不同，规定或建立其污染限值。

分别从初始和最终制备的培养基中抽取或制备至少一个（或1％）平板或试管，置天37℃或按特定标准中规定的温度培养18h。

注：

该条款只适用于即用型培养基。

4.2.2生长特性

4.2.2.1生长率

每种培养基上菌株的生长率应达到所规定的最低限值（见相关标准或附录）。

定量方法中生长率PR的计算公式：

PR=

式中：

NS——从一个或多个待测培养基平板上得到的菌落总数；

N0——从一个或多个规定的参考培养基平板上获得的菌落总数（该菌落总数应≥100CFU）。

非选择性培养基上目标菌的生长率最低应为0.7，该类培养基应易于目标菌生长；选择性培养基上目标菌的生长率最低为0.1。

通常应达到这个要求，特殊情况时可以放宽判定标准（见相关标准或附录3）。

4.2.2.2选择性

为定量评价培养基的选择性，应按规定以适当器具将适量测试菌株的工作培养物接种至选择性培养基和参考培养基中，培养基的选择性应达到规定值（见相关标准或附录3）。

用如下公式计算选择因子SF：

SF=D0－DS

式中：

D0——能在参考培养基上生长至少10个菌落的最高稀释度；

DS——能在测试培养基显示生长的最高稀释度；

SF、D0和DS用㏒10表示，例：

D010-4=㏒104.0，DS10-3=㏒103.0，SF=1.0。

非目标菌在选择性培养基上的SF至少为2。

通常应达到这个要求，特殊情况时可以放宽判定标准（见相关标准或附录3），在定量法中，非目标菌的生长应该部分或全部抑制。

4.2.3生理生化特性

确定培养基的菌落形态学、鉴别特性和选择性，以获得培养基的整体性能。

规定培养基的基本特性，使用一套适当的测试菌株对培养基上目标菌的生理生化特性和非目标菌的被抑制程度进行测试。

4.2.4性能评价和结果解释

基按照规定得到的所有测试菌株的性能测试结果均符合规定，则该批培养基品质优良；若只有基本要求和微生物学要求符合规定，则该批培养基可被接受。

5.性能测试方法

本部分列举了液体、固体培养基的定量、半定量和定性测试方法。

通常使用半定量和定性测试方法就能满足实验室对培养基性能测试要求。

评价新的培养基或新的供应商的产品时，应采用定量测试方法

附录3或SN/1538.1中列出了相应的测试菌株。

5.1测试菌株

附录3针对不同的培养基列出了所推荐使用的目标菌株（生长率）和非目标菌株（选择性）.测试菌株应符合SN/1538.1-2005中5.2.2的要求.如根据需要选用强阳性菌株、弱生长的阳性菌株，非特异性菌株或受损的菌株等。

5.1.1工作菌株的制备

工作菌株是将标准菌株接种到非选择性肉汤中所制备的处稳定生长期的纯菌株,也可以采用其他制备方法,但要保证接种菌株的纯度、活力及操作的规范性,以确保工作菌株的可靠性。

制控菌种接种一个琼脂斜面或平板，孵育过夜或得到足够的量为止。

这些工作琼脂斜面或平板上的培养物应贮存于2～8℃，或者室温，可放四个星期。

取适量的单个菌落悬浮于少理的灭菌生理盐水，用分光光度计调整浊度至0.5麦氏标准（1～2×108CFU/mL）或在625nm吸光度值为0.08～0.1。

5.1.1.1生长率测试用工作菌株

目标菌的定量、半定量和生长率试验常用每平板（或试管）的接种水平为10CFU～100CFU。

5.1.1.2选择性测试用工作菌株

培养基选择性试验是将浓度为104CFU/mL～106CFU/mL的非目标菌工作菌株悬浮液接种到平板上或试管中。

5.1.1.3培养条件

按相关标准和附录3中的条件对接种后的培养基进行培养。

5.2固体培养基测试方法

可采用与下列方法效果等同的方法进行固体培养基的测试。

如定量方法只能用定量方法替代。

5.2.1定量测试方法

该方法适用于大多数固体培养基，但不适用于部分霉菌培养基的测试。

5.2.1.1测试步骤

-----按5.1.1的方法使用工作菌株；

-----选择能够代表一批培养基的适当数量的平板进行测试,并保证平板表面足够干燥。

用同样的方法制备参考培养基平板；

-----用工作菌株的稀释液均匀涂布测试平板和参考平板，并按5.1.1的要求，选择菌落数在一定范围的平板进行计数；

-----按标准规定的培养条件培养平板；

-----计算每一平板中的菌落数，评价菌落的大小和表面特征。

5.2.1.2计算

根据平板上菌液的体积和稀释倍数，计算出培养基上菌落的平均值。

5.2.1.3结果解释

计算生长率PR（4.2.2.1）和选择因子SF（4.2.2.2，必要时），解释结果。

5.2.2半定量测试方法

该方法适用于固体和液体培养基的性能测试,但仅能作为固体培养基的补充测试。

5.2.2.1测试步骤

-----按常规的方法用大约15mL琼脂培养基制备平板；

-----按5.1.1的方法使用工作菌株；

-----用3mm接种环按下图划线平板。

A部分用接种环按0.5cm的间隔划4条平行线，按同样的方法在B区和C区划线，最后在D区内划一条连续的曲线。

划线时最好将模板图放在平板下面；

-----按标准规定的培养条件培养平板；

注：

按种环应完全浸入工作菌株液中，取一满环接种物，将按种环接触容器边缘3次可去除多余的液体。

划线时接种环与琼脂表面的角度应为20°～30°。

按种环压在琼脂表面的压力和划线速度应前后一致，整个划线应快速连续。

5.2.2.2计算

培养后，评价菌落的形态、大小和密度，并计算生长指数G。

每条有菌落生长的划线记作1分，每个培养皿上最多炎16分。

如果仅一半的线有菌落生长，记作0.5分。

如果划线上没有菌落生长或生长量不于划线的一半，则记为0分。

记录每个平板的得分总和便得到G。

如菌落在A区和B区生全部生长，而在C区在一半线生长则G为10。

5.2.2.3结果解释

目标菌的生长指标G大于6时，培养基可接受。

非选择性培养基的G值通常较高。

目标菌在培养基上应呈现典型的生长，而非目标菌的生长应部分或完全抑制。

5.2.3定性测试方法

该方法可用作固体培养基性能测试补充。

5.2.3.1测试步骤

-----按常规的方法用大约15mL琼脂培养基制备平板；

-----按5.1.1的方法使用工作菌株；

-----用3mm接种环取测试菌培养物，在测试培养基表面划平行直线。

可同时在一个平板上接种多个菌种，但划线不能交叉；

-----按标准中规定的培养时间和温度对接种后的平板进行培养。

5.2.3.2结果解释

培养后按以下方法对培养基计分:

-----0表示不生长

-----1表示微弱生长

-----2表示生长良好。

目标菌得分就应为2，并且有典型的菌落外观、大小和形态。

非目标菌的生长应该部分或全部被抑制。

5.3液体培养基测试方法

可采用与下列方法效果先等同的方法进行液体培养基测试。

如，定量方法只能用定量方法所替代。

测定液体培养基的生长率应采用适当的接种方法。

本条介绍用于评价液体培养基生长率和选择性的定量，半定量和定性方法。

但液体培养基的细菌总数或得分应通过将培养物倾注或划线平板后才能得到。

液本培养基特性反应的定性评价通过肉眼观察来实现。

5.3.1定量测试方法

该方法还适用于对新制备培养基、肉汤或稀释剂的评价。

5.3.1.1测试步骤

-----从每批液体培养基中选择适当数量的试管或每份10mL的培养基进行测试;

-----接种目标菌：

用少量目标菌株培养物（每管10CFU～100CFU，接种物制备见5.1.1）接种测试肉汤和参考肉汤，混匀；

-----接种非目标菌：

用大量非目标菌培养物（每管大于1000CFU，接种物制备见5.1.1）接种测试肉汤和参考肉汤，混匀；

-----接种目标菌和非目标菌混合培养物：

用少量（每管10CFU～100CFU，接种物制备见5.1.1）目标菌接种测试肉汤和参考肉汤，同时在每个试管中接种大量非目标菌（每管大于1000CFU，接种物制备见5.1.1），混匀；

-----按标准中规定的培养时间和温度对接种后的试管进行培养；

-----培养后，从每一种肉汤中移取一定量的菌液，必要时可取原菌液的稀释液按5.2.1的方法涂布于非抑制性琼脂平板上；

-----稀释剂和运输培养基：

按每管100CFU～1000CFU接种测试菌（接种物制备见5.1.1），混匀。

稀释剂在室温下放置45min后进行平板计数；运输培养基按常规培养时间和温度对接种后试管进行培养，然后进行平板计数。

5.3.1.2结果读取、计算和解释

培养后，对目标菌和非目标菌进行计数，以区分开不同类型的培养基。

并根据不同的测试目的，进行计算和解释。

a）按PR（4.2.2.1）和SF（4.2.2.2值对参考肉汤和测试肉汤进行比较和解释：

-----目标菌的PR值不应小于0.1（测试培养基与参考培养基菌落总数的差别不超过一个数量级）；

-----非目标菌的SF值至少应达到2；

-----混合菌中，目标菌标的生长不应受到非目标菌生长的抑制，即目标菌始终应为优势菌。

b）在混合菌中目标菌数量的最低值及非目标菌数量的最高值应符合以下要求：

-----目标菌的最低浓度应达到106CFU/mL～108CFU/mL；

-----在选择性肉汤培养物中非目标菌的最高浓度不应超过104CFU/mL。

c）稀释剂和运输培养基不应引起目标菌和非目标菌数量太大变化。

微生物在这些培养基中培养后的数量变化应在最初计数±50％的范围内。

注：

液体培养基与菌种生长特性相关的质量在菌种生长早期表现最为明显。

如测试菌在参考肉汤和测试肉汤中生长率和选择性的很多信息要在对数生长期，尤其是前对数生长期获得。

因此，要观察培养基质量的微小变化，应在接种测试菌后的短期时间内（如6h或12h）从液体培养基中挑取培养物划线接种平板。

5.3.2半定量测试方法

5.3.2.1测试步骤

-----挑选一定数量试管或在一批培养基中吸取每份10mL的样品进行测试；

-----目标菌、非目标菌以及混合菌的接种：

在装有测试肉汤的试管中接种10CFU～100CFU的目标菌，同时接种更多数量（每管大于1000CFU）的非目标菌，混匀；

-----非目标菌的接种：

在测试肉汤试管中接种较多数量（大于1000CFU）的非目标菌，混匀培养；

-----按标准方法中规定的培养时间和温度进行培养；

-----用3mm接种环取一环混合菌培养液划线接种到特定目标菌选择性平板上；

-----和3mm接种环取一环非目标菌培养液划线接种到非选择性平板（TSA）上；

-----将两个平板按标准要求培养。

5.3.2.2计算和结果解释

选择性平板上有至少10个目标菌菌落生长,则表示液体测试肉汤的生长率为良好。

非选择性平板上没有菌落生长（或者少于10CFU），则表示液体测试肉汤的选择性为良好。

5.3.3定性测试方法

单管定性法适用于液体培养基的性能测试。

这项测试不能用于四硫酸盐肉汤等混浊培养基。

5.3.3.1测试步骤

-----用3mm接种环取一环工作菌株培养物直接接种到用于性能测试的液体培养基中；

-----按标准方法中规定的培养时间和温度进行培养。

5.3.3.2结果解释

用目测的浊度值（如0