生物类实验引物设计doc.docx
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生物类实验引物设计doc
PCR引物设计原则
PCR引物设计原则
PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。
因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。
要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。
同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。
如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。
如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。
现在可以在这一保守区域里设计一对引物。
一般引物长度为15~30碱基，扩增片段长度为100~600碱基对。
让我们先看看P1引物。
一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%。
而且四种碱基的分布最好随机。
不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。
否则P1引物设计的就不合理。
应重新寻找区域设计引物。
同时引物之间也不能有互补性，一般一对引物间不应多于4个连续碱基的互补。
引物确定以后，可以对引物进行必要的修饰，例如可以在引物的5′端加酶切位点序列；标记生物素、荧光素、地高辛等，这对扩增的特异性影响不大。
但3′端绝对不能进行任何修饰，因为引物的延伸是从3′端开始的。
这里还需提醒的是3′端不要终止于密码子的第3位，因为密码子第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。
综上所述我们可以归纳十条PCR引物的设计原则：
①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。
②产物不能形成二级结构。
③引物长度一般在15~30碱基之间。
④G+C含量在40%~60%之间。
⑤碱基要随机分布。
⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。
⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。
⑧引物5′端可以修饰。
⑨引物3′端不可修饰。
⑩引物3′端要避开密码子的第3位。
PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。
如前述，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。
对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。
1.引物的特异性
引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。
2.避开产物的二级结构区
某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。
用有关计算机软件可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。
实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。
若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。
3.长度
寡核苷酸引物长度为15~30bp，一般为20~27mer。
引物的有效长度：
Ln=2（G+C）+（A+T+，Ln值不能大于38，因为>38时，最适延伸温度会超过TaqDNA聚合酶的最适温度（74℃）,不能保证产物的特异性。
4.G+C含量
G+C含量一般为40%~60%。
其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。
若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。
5.碱基础随机分布
引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。
尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。
6.引物自身
引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。
这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。
若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。
7.引物之间
两引物之间不应不互补性，尤应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。
一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。
8.引物的3′端
引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。
3′端也不能有形成任何二级结构可能，除在特殊的PCR（AS-PCR）反应中，引物3′端不能发生错配。
在标准PCR反应体系中，用2UTaqDNA聚合酶和800μmol/LdNTP（四种dNTP各200μmol/L）以质粒（103拷贝）为模板，按95℃，25s；55℃，25s；72℃，1min的循环参数扩增HIV-1gag基因区的条件下，引物3′端错配对扩增产物的影响是有一定规律的。
A∶A错配使产量下降至1/20，A∶G和C∶C错七下降至1/100。
引物A：
模板G与引物G：
模板A错配对PCR影响是等同的。
9.引物的5′端
引物的5′端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。
因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。
引物5′端修饰包括：
加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。
10.密码子的简并
如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。
PCR引物设计及软件使用技巧
生物谷网站PCR引物设计及软件使用技巧
摘要：
本文旨在介绍使用软件设计PCR引物的技巧。
在PCR引物设计原则的基础上，详细介绍了两种常用引物设计软件的基本使用方法，并对其各自的优缺点进行了比较。
一般性引物自动搜索可采用“PremierPrimer5”软件，而引物的评价分析则可采用“Oligo6”软件。
关键词：
PCR；引物设计
1
自从1985年KarnyMullis发明了聚合酶链式反应以来，PCR技术已成为分子生物学研究中使用最多、最广泛的手段之一[1]，而引物设计是PCR技术中至关重要的一环。
使用不合适的PCR引物容易导致实验失败：
表现为扩增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚体带），不出带或出带很弱，等等。
现在PCR引物设计大都通过计算机软件进行。
可以直接提交模板序列到特定网页，得到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。
一般来说，专门进行PCR引物设计的专业软件功能更为强大，但使用起来却不太容易。
本文将就引物设计原则及软件使用问题进行探讨。
引物设计的原则
引物设计有3条基本原则：
首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应（即错配）。
具体实现这3条基本原则需要考虑到诸多因素，如引物长度（primerlength），产物长度（productlength），序列Tm值（meltingtemperature），引物与模板形成双链的内部稳定性（internalstability,用?
G值反映），形成引物二聚体（primerdimer）及发夹结构（duplexformationandhairpin）的能值，在错配位点（falseprimingsite）的引发效率，引物及产物的GC含量（composition），等等。
必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。
根据有关参考资料和笔者在实践中的总结，引物设计应注意如下要点：
1.引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应[2]。
2.引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。
引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加[2]。
3.引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。
不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A[3][4]。
另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。
5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物[2]。
4.引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。
上下游引物的GC含量不能相差太大[2][5]。
5.引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。
Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4（G+C）＋2（A+T），在Oligo软件中使用的是最邻近法（thenearestneighbormethod）[6][7]。
6.?
G值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。
应当选用3’端?
G值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间?
G值相对较高的引物。
引物的3’端的?
G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应[6]。
7.引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行[8]。
8.对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。
值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。
有的模板本身条件比较困难，例如GC
2
含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；在用作克隆目的的PCR因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。
在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。
引物的自动搜索和评价分析
软件的引物设计功能主要体现在两个方面：
首先是引物分析评价功能，该功能只有少数商业版软件能够做到，其中以“Oligo6”最优秀；其次是引物的自动搜索功能，各种软件在这方面的侧重点不同，因此自动搜索的结果也不尽相同。
据笔者的经验，自动搜索功能以“PremierPrimer”为最强且方便使用，“Oligo6”其次，其他软件如“VectorNTISuit”、“Dnasis”、“Omiga”和“Dnastar”都带有引物自动搜索功能，但搜索结果不是十分理想。
要想得到效果很好的引物，在自动搜索的基础上还要辅以人工分析。
笔者认为引物设计软件的最佳搭配是“Oligo”和“Premier”软件合并使用，以“Premier”进行自动搜索，“Oligo”进行分析评价，如此可快速设计出成功率很高的引物。
Oligo6.22使用技巧简介
1.功能
在专门的引物设计软件中，“Oligo”是最著名的。
它的使用并不十分复杂，但初学者容易被其复杂的图表吓倒。
Oligo5.0的初始界面是两个图：
Tm图和ΔG图；Oligo6.22的界面更复杂，出现三个图，加了个Frq图。
“Oligo”的功能比“Premier”还要单一，就是引物设计。
但它的引物分析功能如此强大以至于能风靡全世界。
2.使用（以Oligo6.22为例）
Oligo6.22的启动界面如下：
图中显示的三个指标分别为Tm、ΔG和Frq，其中Frq是6.22版本的新功能，为邻近6至7个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。
该频率高则可增加错误引发
6
的可能性。
因为分析要涉及多个指标，起动窗口的cascade排列方式不太方便，可从windows菜单改为tili方式。
如果觉得太拥挤，可去掉一个指标，如Frq，这样界面的结构同于Oligo
5.0，只是显示更清楚了。
经过Windows/Tili项后的显示如图：
在设计时，可依据图上三种指标的信息选取序列，如果觉得合适，可点击Tm图块上左下角的Upper按钮，选好上游引物，此时该按钮变成，表示上游引物已选
取好。
下游引物的选取步骤基本同上，只是按钮变成Lower。
?
G值反映了序列与模板的结合强度，最好引物的?
G值在5’端和中间值比较高，而在3’端相对低（如图：
）Tm值曲线以选取72℃附近为佳，5’到3’的下降形状也有利于引物引发聚合反应。
Frq曲线为“Oligo6”新引进的一个指标，揭示了序列片段存在的重复机率大小。
选取引物时，宜选用3’端Frq值相对较低的片段。
当上下游引物全选好以后，需要对引物进行评价并根据评价对引物进行修改。
首先检查
引物二聚体尤其是3’端二聚体形成的可能性。
需要注意的是，引物二聚体有可能是上游或下游引物自身形成，也有可能是在上下游引物之间形成（crossdimer）。
二聚体形成的能值越高，越不符合要求。
一般的检测（非克隆）性PCR，对引物位置、产物大小要求较低，因而应尽可能选取不形成二聚体或其能值较低的引物。
第二项检查是发夹结构（hairpin）；与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。
一般来说，这两项结构的能值以不超过4.5为好。
当然，在设计克隆目的的PCR引物时，引物两端一般都添加酶切位点，必然存在发夹结构，而且能值不会太低。
这种PCR需要通过灵活调控退火温度以达到最好效果，对引物的发夹
结构的检测就不应要求太高。
第三项检查为GC含量，以45-55％为宜。
有一些模板本身的GC含量偏低或偏高，导致引物的GC含量不能被控制在上述范围内，这时应尽量使上下游引物的GC含量以及Tm值保持接近，以有利于退火温度的选择。
如果PCR的模板不是基因组DNA，而是一个特定模板序列，那么最好还进行Falseprimingsite的检测。
这项检查可以看出引物在非目的位点引发PCR反应的可能性。
如果引物在错配位点的引发效率比较高，就可能出假阳性的PCR结果。
一般在错配引发效率以不超过100为好，但对于特定的
7
8
模板序列，还应结合比较其在正确位点的引发效率。
如果两者相差很大，比如在正确位点的引发效率为450以上，而在错误位点的引发效率为130，那么这对引物也是可以接受的。
当我们结束以上四项检测，按Alt+P键弹出PCR窗口，其中总结性地显示该引物的位置、产物大小、Tm值等参数，最有用的是还给出了推荐的最佳退火温度和简单的评价。
由于“Oligo”软件的引物自动搜索功能与“PrimerPremier5”的相类似，并且似乎并
不比后者更好用，在此不再赘述。
其实，使用软件自动搜索引物就是让计算机按照人的要求去寻找最佳引物，如果参数设置得当将大大提高工作效率。
除了本地引物设计软件之外，现在还有一些网上引物设计软件，如由WhiteheadInstitute开发的“Primer3”等（本网站http:
//210.72.11.60已引进并调试好该软件，欢迎使用）。
该软件的独特之处在于，对全基因组PCR的引物设计；可以将设计好的引物对后台核酸数据库进行比对，发现并排除可引发错配的引物。
因此建议经常做全基因组PCR的用户试用。
参考文献（References）：
[1]H.A.艾得希主编,田丁等译.PCR技术——DNA扩增的原理与应用.北京:
北京医科大学中国协和医科大学联合出版社,1991.
[2]林万明著.PCR技术操作与应用指南.北京:
人民军医出版社,1993.
[3]朱平主编.PCR基因扩增实验操作手册.北京:
中国科学技术出版社,1992
[4]郑仲承.寡核苷酸的优化设计，生命的化学,2001,21（3）:
254-256.
[5]GeorgeH.KellerMarkM.Manak.DNAprobes.1992.
[6]Oligo软件帮助文件（Oligo.HLP）.
[7]Martin,F.H.,Castro,M.M.,andTinoco,Jr.I.Basepairinginvolvingdeoxyinisine,implicationsfor
probedesign.NucleicAcidsRes,1985,13:
8927-8938.
[8]Rychlik,W.andRhoads,R.E.Acomputerprogramforchoosingoptimaloligonucleotidesforfilter
hybridization,sequencingandinvitroamplificationofDNA.NucleicAcidsRes,1989,17:
8543-8551.生物谷网站
Oligo使用方法介绍PCR的引物如何设计?
关于引物设计请教来了!
引物概念
2008-04-0313:
44
作为目前最好、最专业的引物设计软件，Oligo的功能很强，在这里我们介绍它的一些主要功能：
如：
普通引物对的搜索、测序引物的设计、杂交探针的设计以及评估引物对质量等等。
在正式进行引物设计前，我们首先面临的一个任务就是向Oligo程序导入模板序列，根据不同的实验情况，导入模板有三种方法：
1，直接用键盘输入：
a，点击file菜单中的NewSequence浮动命令，或直接点击工具栏中的NewSequence命令，进入序列展示窗口；
b，此时即可键入DNA序列；
c，如果需要的话，Oligo提供碱基回放功能，在边键入时边读出碱基，防止输入错误。
点击Edit菜单中的“Readbackon”即可。
2，利用复制和粘贴：
当我们序列已经作为TXT文件存在或其它oligo不能直接open的文件格式，如word文件.html格式，这个功能就显得很有用了。
在相应文件中复制序列后在序列展示窗口粘贴，oligo会自动去除非碱基字符。
当序列输入或粘贴完成后，点击Accept/Discard菜单中的Accept浮动命令，即可进入引物设计模式。
3，如果序列已经保存为Seq格式或者FASTA，GenBank格式时，oligo就可以直接打开序列文件。
点击File菜单中的“Open”浮动命令，找到所需文件，打开即可。
进入引物设计模式后，oligo一般会弹出三个窗口，分别是6－碱基频率窗口，碱基退火温度窗口以及序列内部碱基稳定性窗口，其中的退火温度窗口是我们引物设计的主窗口，其它的两个窗口则在设计过程中起辅助作用，比如6－碱基频率窗口可以使我们很直观地看到所设计引物在相应物种基因组中的出现频率，如果我们的模板是基因组DNA或混合DNA时，该信息就显得有用了，而内部稳定性窗口则可以显示引物的5’端稳定性是否稍高于3’端等。
一，普通引物对的搜索：
以Mouse4E（cDNA序列）为例。
我们的目的是以Mouse4E（2361bp）为模板，设计一对引物来扩增出600－800bp长的PCR产物。
1，点击“Search“菜单中的”ForPrimersandProbes“命令，进入引物搜索对话框；
2，由于我们要设计的是一对PCR引物，因此正、负链的复选框都要选上，同时选上Compatiblepairs。
在Oligo默认的状态下，对此引物对的要求有：
a，无二聚体；b，3’端高度特异，GC含量有限定，d，去除错误引发引物等。
3，剩下的工作是确定上、下游引物的位置及PCR产物的长度以及引物设计参数。
①单击：
“searchRanges”按钮，弹出“SearchRanges”对话框。
输入上游引物的范围：
1－2000，下游引物的位置：
100－2300；PCR产物的长度600－800bp。
②单击“Paramaters”按钮进入“SearchParameters”对话框，对话框种分三个活页，分别是：
不同设定，参数以及更多参数。
③在“普通设定”窗口，为我们提供了对引物非常直观的设定方法，从高到低分六个等级，最后还有一个用户定制选项。
④当我们对引物的各种参数的含义及应该设定多大值并不是特别清楚时，就可以直接设定Veryhigh/High等来完成对引物设计参数的设定。
⑤当我们选中“AutomaticallyChangeString”后，Oligo会在引物搜索过程中：
如果在高等级设定中无法找到引物对时自动降低一个定级来进行搜索，知道找到引物对。
在设计反向PCR引物对时，就选中“InversePCR”复选框。
⑥我们还可以让引物的长度可以改变，以适应设定的Tm值或PE？
（PrimeEffitions，引发效率）。
也可以限定所选引物对的最大数目。
⑦在“Parameters”窗口中，实际上需要我们改动的只有引物的长度，根据试验的要求作相应的改变，如23nt。
其他参数就使用Oligo的默认值，一般无需改变。
在“MoreParameters“窗口中，一般也无需作任何改变，直接用Oligo的默认值。
4，点击“确认”－“Ok”进入搜索窗口，再次单击“OK”后，Oligo自动完成引物对的搜索，并出现一个搜索结果窗口。
显示出得到的引物对数目。
5，点击“Ok”，出现“PrimerPairs”窗口，在窗口中列出了7对引物的简单信息，引物位置，产物长度，最佳退火温度及GC含量。
单击“Sort”按钮，可以按产物长度，最佳退火温度及GC含量从小到大或从大到小的顺序排列。
6，点击任意一对引物，在旁边马上弹出一个叫“PCR”的窗口，在窗口中我们可以看到这对引物在模板中的大概位置，最佳退火温度（该温度可以直接应用于我们实际PCR中的第二步退火）。
另外还有引物的Tm值，GC含量，引发效率，同时还计算出了产物的Tm值于引物Tm值的差异以及引物间Tm值的差异。
一般我们尽量保持前者在20度以内，后者在5－6度以内。
点击不同的引物对时，PCR窗口内容同时作相应的改变。
7，要想了解引物的详细信息，如二聚体，发卡结构形成情况、组成、Tm值和错误引发位点等，这时只需点击“Analyze”菜单中的相应命令，就可以分别得到相关信息。
例如点击“DuplexFormation”，我们就可以得到上游引物间，下游引物间及上下游引物间形成二聚体的情况。
同理，“HairpinFormation”，“CompositionandTm”，“FalsePrimingSites”等命令就可以显示出相关信息。
所有这些分析的结果都有助于我们从Oligo搜索得到的多对引物中选择最佳的引物对。
需要说明的是，1，如果一次搜索得到的引物对太多时，我们可以适当提高选定的条件和规定更合适的搜索范围来减少引物对数；2，引物一般尽量不要在3’端或是离3’端太近的位置形成二聚体，同时二聚体的自有能绝对值尽量小于10；3，对于错误引发，在普通PCR中，如果引发效率在160points以上时，就可能出现杂带，在测序反应中，错误引发效率则应该严格控制在120points以下。
8，Oligo中每对引物的详细信息可以直接导出为一个文本文件：
首先点击“File”菜单中的“Print/SaveOptions”，在出现的对话框中的普通设定选中“Selected”；在“AnalyzeI”中选择需要保存的信息，在“AnalyzeII”中选中PCR。
单击确定按钮退出，这时再次点击“File”菜单，Save浮动命令中的“DataSaveas”，选择路径及文件名即可。
二，测序引物的设计：
在oligo中，测序引物设计过程与普通引物设计大部分都很相似。
还是以Mouse4E为例，假如我们要在600－800bp的位置设计一条测序引物。
Open－Search
在“Search”窗口中，选中“SequecePrimer”，同时去除负链Search的选中
在“SearchRange”窗口，输入正链的600－800bp
在“Parameters”中选定veryhigh，引物长度改为18bp
结果得到11条测序引物，与普通引物同理，根据其详细信息就可以挑选到一条最佳的测序引物。
三，探针的设计：
探针的设计与测序引物设计基本相同，只需使“Search”窗口的探针设计选中，改变探针的长度就可以。
四，评估引物对：
我们在各种文献中查到的引物，如果直接进行PCR，往往很难重复别人的实验结果。
这时就想到，是不是引物的质量有问题？
能不能用软件来对这些问题引物进行一些分析呢？
答案时肯定的。
1，点击File菜单中的New命令；
2，在“EditNewSequence”的窗口中用键盘输入上游引物；
3，如果该引物的首位置不是1的话，可以在“Edit”窗口中输入新的5’端位置数字，如20；
4，点击Accept/Discard菜单的Accept命令；
5，如果引物序列长度不同于当前的引物的话，可以从“Chang
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