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三聚氰胺的性质及检测方法
三聚氰胺的性质及检测方法
2011级食工一班郭佳170112011011
1三聚氰胺的理化性质
三聚氰胺（英文：
Melamine）分子式为C3H6N6,分子量为126.12,俗称密胺、蛋白精，IUPAC命名为“1,3,5-三嗪-2,4,6-三胺”，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，为白色单斜晶体,无毒、无味,不可燃烧,可溶于甲醇、甲醛、乙酸、甘油及吡啶等,微溶于水、乙醇,不溶于苯、乙醚、四氯化碳。
相对密度为1.573g/cm3,熔点为354℃高温下可分解产生含氢化氰、氮氧化物和氨等有毒和刺激性的烟雾。
三聚氰胺呈弱碱性,在中性或弱碱性环境下能与甲醛缩合形成各种羟甲基三聚氰胺,但在微酸性（pH值5.5~6.5）环境下,可以与羟甲基的衍生物进行缩聚反应而生成树脂产物。
另外,三聚氰胺三种同系物:
三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸二酰胺。
三聚氰胺是一种用途十分广泛的有机化工原料，对身体有害，不可用于食品加工或食品添加物。
三聚氰胺部分物理性质：
熔点（℃）：
>300（升华）
相对密度（水=1）：
1.573
相对蒸气密度（空气=1）：
4.34
饱和蒸气压（kPa）：
6.66
水中溶解度（20℃）：
0.33g
2三聚氰胺的毒性
动物长期摄入三聚氰胺会造成生殖、泌尿系统的损害,膀胱、肾部出现结石,并可进一步诱发膀胱癌对于肾脏，短期高浓度接触后会引起肾结石、急性肾衰，长期接触还会造成肾脏组织损伤。
。
三聚氰胺同系物具有三聚氰胺一样的毒性效应,很多研究都将它们作为三聚氰胺复合物（MCs）进行总体毒理学评价。
3第一法高效液相色谱法（HPLC）
3.1原理
试样用三氯乙酸溶液-乙腈提取，经阳离子交换固相萃取柱净化后，用高效液相色谱测定，外标法定量。
3.2试剂与材料
除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。
甲醇
乙腈
氨水
三氯乙酸
柠檬酸
辛烷磺酸钠
甲醇水溶液
三氯乙酸溶液（1％）
氨化甲醇溶液（5％）
离子对试剂缓冲液
三聚氰胺标准品
三聚氰胺标准储备液
阳离子交换固相萃取柱
定性滤纸
海砂
微孔滤膜
氮气
3.3仪器和设备
高效液相色谱（HPLC）仪
分析天平
离心机
超声波水浴
固相萃取装置
氮气吹干仪
涡旋混合器
具塞塑料离心管
研钵
3.4样品处理
3.4.1提取
3.4.1.1液态奶、奶粉、酸奶、冰淇淋和奶糖等
称取2g（精确至0.01g）试样于50mL具塞塑料离心管中，加入15mL三氯乙酸溶液和5mL乙腈，超声提取10min，再振荡提取10min后，以不低于4000r/min离心10min。
上清液经三氯乙酸溶液润湿的滤纸过滤后，用三氯乙酸溶液定容至25mL，移取5mL滤液，加入5mL水混匀后做待净化液。
3.4.1.2奶酪、奶油和巧克力等
称取2g（精确至0.01g）试样于研钵中，加入适量海砂（试样质量的4倍～6倍）研磨成干粉状，转移至50mL具塞塑料离心管中，用15mL三氯乙酸溶液分数次清洗研钵，清洗液转入离心管中，再往离心管中加入5mL乙腈，余下操作同3.4.1.1中“超声提取10min，加入5mL水混匀后做待净化液”。
注：
若样品中脂肪含量较高，可以用三氯乙酸溶液饱和的正己烷液-液分配除脂后再用SPE柱净化。
3.4.2净化
将3.4.1中的待净化液转移至固相萃取柱中。
依次用3mL水和3mL甲醇洗涤，抽至近干后，用6mL氨化甲醇溶液洗脱。
整个固相萃取过程流速不超过1mL/min。
洗脱液于50℃下用氮气吹干，残留物（相当于0.4g样品）用1mL流动相定容，涡旋混合1min，过微孔滤膜后，供HPLC测定。
3.5高效液相色谱测定
3.5.1标准曲线的绘制
用流动相将三聚氰胺标准储备液逐级稀释得到的浓度为0.8、2、20、40、80μg/mL的标准工作液，浓度由低到高进样检测，以峰面积-浓度作图，得到标准曲线回归方程。
基质匹配加标三聚氰胺的样品HPLC色谱图参见附录A中的图A1.
3.5.2定量测定
待测样液中三聚氰胺的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应稀释后再进样分析。
3.5.3结果计算
试样中三聚氰胺的含量由色谱数据处理软件或按式
（1）计算获得：
A×c×V×1000X=×f……………………
（1）
As×m×1000式中：
X——试样中三聚氰胺的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；
A——样液中三聚氰胺的峰面积；
c——标准溶液中三聚氰胺的浓度，单位为微克每毫升（µg/mL）；
V——样液最终定容体积，单位为毫升（mL）；
As——标准溶液中三聚氰胺的峰面积；
m——试样的质量，单位为克（g）；
f——稀释倍数。
3.6空白实验
除不称取样品外，均按上述测定条件和步骤进行。
3.7方法定量限
本方法的定量限为2mg/kg。
3.8回收率
在添加浓度2mg/kg～10mg/kg浓度范围内，回收率在80%～110%之间，相对标准偏差小于10%。
3.9允许差
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
4第二法液相色谱-质谱/质谱法（LC-MS/MS）
4.1原理
试样用三氯乙酸溶液提取，经阳离子交换固相萃取柱净化后，用液相色谱-质谱/质谱法测定和确证，外标法定量。
4.2试剂与材料
除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。
乙酸。
乙酸铵。
乙酸铵溶液（10mmol/L）：
准确称取0.772g乙酸铵于1L容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混匀后备用。
其他同3.2。
4.3仪器和设备
液相色谱-质谱/质谱（LC-MS/MS）仪：
配有电喷雾离子源（ESI）。
其他同3.3。
4.4样品处理
4.4.1提取
奶粉
称取1g（精确至0.01g）试样于50mL具塞塑料离心管中，加入8mL三氯乙酸溶液和2mL乙腈，超声提取10min，再振荡提取10min后，以不低于4000r/min离心10min。
上清液经三氯乙酸溶液润湿的滤纸过滤后，做待净化液。
4.4.2净化
将4.4.1中的待净化液转移至固相萃取柱中。
依次用3mL水和3mL甲醇洗涤，抽至近干后，用6mL氨化甲醇溶液洗脱。
整个固相萃取过程流速不超过1mL/min。
洗脱液于50℃下用氮气吹干，残留物（相当于1g试样）用1mL流动相定容，涡旋混合1min，过微孔滤膜后，供LC-MS/MS测定。
4.5液相色谱-质谱/质谱测定
4.5.1标准曲线的绘制
取空白样品按照4.4处理。
用所得的样品溶液将三聚氰胺标准储备液逐级稀释得到的浓度为0.01、0.05、0.1、0.2、0.5μg/mL的标准工作液，浓度由低到高进样检测，以定量子离子峰面积-浓度作图，得到标准曲线回归方程。
基质匹配加标三聚氰胺的样品LC-MS/MS多反应监测质量色谱图参见附录A中的图A.2。
4.5.2定量测定
待测样液中三聚氰胺的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应稀释后再进样分析。
4.5.3定性判定
按照上述条件测定试样和标准工作溶液，如果试样中的质量色谱峰保留时间与标准工作溶液一致（变化范围在±2.5%之内）；样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度与浓度相当标准溶液的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过表1的规定，则可判断样品中存在三聚氰胺。
表1定性离子相对丰度的最大允许偏差
相对离子丰度
>50%
>20%至50%
>10%至20%
≤10%
允许的相对偏差
±20%
±25%
±30%
±50%
4.5.4结果计算
同3.5.4。
4.6空白实验
除不称取样品外，均按上述测定条件和步骤进行。
4.7方法定量限
本方法的定量限为0.01mg/kg。
4.8回收率
在添加浓度0.01mg/kg～0.5mg/kg浓度范围内，回收率在80%～110%之间，相对标准偏差小于10%。
4.9允许差
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。
5第三法气相色谱-质谱联用法（GC-MS和GC-MS/MS）
5.1原理
试样经超声提取、固相萃取净化后，进行硅烷化衍生，衍生产物采用选择离子监测质谱扫描模式（SIM）或多反应监测质谱扫描模式（MRM），用化合物的保留时间和质谱碎片的丰度比定性，外标法定量。
5.2试剂与材料
除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。
吡啶
乙酸铅
衍生化试剂：
N,O-双三甲基硅基三氟乙酰胺（BSTFA）＋三甲基氯硅烷（TMCS）（99＋10）。
乙酸铅溶液（22g/L）
三聚氰胺标准溶液
氩气
氦气
其他同3.2。
5.3仪器和设备
气相色谱-质谱（GC-MS）仪
气相色谱-质谱/质谱（GC-MS/MS）仪：
配有电子轰击电离离子源（EI）。
电子恒温箱。
其他同3.3。
5.4样品处理
5.4.1GC-MS法
5.4.1.1提取
奶粉
称取5g（精确至0.01g）样品于50mL具塞比色管，加入25mL三氯乙酸溶液，涡漩振荡30s，再加入15mL三氯乙酸溶液，超声提取15min，加入2mL乙酸铅溶液，用三氯乙酸溶液定容至刻度。
充分混匀后，转移上层提取液约30mL至50mL离心试管，以不低于4000r/min离心10min。
上清液待净化。
5.4.1.2净化
准确移取5mL的待净化滤液至固相萃取柱中。
再用3mL水、3mL甲醇淋洗，弃淋洗液，抽近干后用3mL氨化甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，50℃下氮气吹干。
5.4.2GC-MS/MS法
奶粉
称取0.5g（精确至0.01g）试样，加入5mL甲醇水溶液，涡旋混匀2min后，超声提取15min~20min，以不低于4000r/min离心10min，取上清液200µL用微孔滤膜过滤，50℃下氮气吹干。
5.4.3衍生化
取上述氮气吹干残留物，加入600μL的吡啶和200μL衍生化试剂，混匀，70℃反应30min后，供GC-MS或GC-MS/MS法定量检测或确证。
5.5气相色谱-质谱测定
5.5.1标准曲线的绘制
5.5.1.1GC-MS法
准确吸取三聚氰胺标准溶液0、0.4、0.8、1.6、4、8、16mL于7个100mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度。
各取1mL用氮气吹干，按照5.4.3步骤衍生化。
配制成衍生产物浓度分别为0、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2μg/mL的标准溶液。
反应液供GC-MS测定。
以标准工作溶液浓度为横坐标，定量离子
质量色谱峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。
标准溶液的GC-MS选择离子质量色谱图参见附录A中的图A.3，三聚氰胺衍生物选择离子质谱图参见附录A中的图A.4。
5.5.1.2GC-MS/MS法
准确吸取三聚氰胺标准溶液0、0.04、0.08、0.4、0.8、4、8mL分别于7个100mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度。
各取1mL用氮气吹干，按照5.4.3步骤衍生化。
配制成衍生化产物浓度分别为0、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1μg/mL的标准溶液。
反应液供GC-MS/MS测定。
以标准工作溶液浓度为横坐标，定量离子质量色谱峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。
标准溶液的GC-MS/MS多反应监测质量色谱图
参见附录A中的图A.5。
5.5.2定量测定
待测样液中三聚氰胺的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应对净化液稀释，重新衍生化后再进样分析。
5.5.3定性判定
5.5.3.1GC-MS法
以标准样品的保留时间和监测离子（m/z99、171、327和342）定性，待测样品中4个离子（m/z99、171、327和342）的丰度比与标准品的相同离子丰度比相差不大于20%。
5.5.3.2GC-MS/MS法
以标准样品的保留时间以及多反应监测离子（m/z342>327、342>171）定性，其他定性判定原则同4.5.5。
5.5.4结果计算同3.5.4。
5.6空白实验
除不称取样品外，均按上述测定条件和步骤进行。
5.7方法定量限
本方法中，气相色谱-质谱法（GC-MS法）的定量限为0.05mg/kg，气相色谱-质谱/质谱法（GC-MS/MS法）的定量限为0.005mg/kg。
5.8回收率
GC-MS法：
在添加浓度0.05mg/kg～2mg/kg浓度范围内，回收率在70%～110%之间，相对标准偏差小于10%。
GC-MS/MS法：
在添加浓度0.005mg/kg～1mg/kg浓度范围内，回收率在90%～105%之间，相对标准偏差小于10%。
5.9允许差
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。
6表面活性剂增敏荷移反应紫外分光光度法测定三聚氰胺
6.1原理
CTMAB对三聚氰胺与四氯对苯醌（TCBQ）荷移反应产物具有显著的紫外光谱增敏作用，反应产物的吸光度值与三聚氰胺的浓度之间具有良好的线性关系。
据此建立了一种三聚氰胺的紫外光谱测定新方法。
三聚氰胺分子中-NH2上的氮原子有一对孤对电子，空间阻碍又小，是良好的电子供体，而TCBQ是一个很强的平面型π电子受体，因此，在乙腈溶液中MEL与TCBQ形成了n-π型荷移配合物。
用摩尔比法测得配合物的组成为1∶3，表明是一个三聚氰胺分子中通过三个-NH2上的氮原子与三个TCBQ分子进行荷移反应，形成了n-π型荷移配合物（TCBQ）3MEL，结构稳定，新出现的309nm吸收峰正是该荷移反应产物的特征吸收峰。
其形成原理可表示如下:
当向该体系加入CTMAB后，MEL+TCBQ+CTMAB溶液的特征吸收峰位不变，但峰高明显增强，反映出表面活性剂CTMAB对MEL与TCBQ的荷移反应具有增敏效应.
6.2仪器与试剂
UV-2550型紫外分光光度计;
PB-21型精密酸度计。
奶粉；
三聚氰胺（sigma试剂，＞99%）溶液
四氯对苯醌（TCBQ）
乙醇溶液（1.0×10-3mol/L）;
十六烷基三甲基溴化铵（CTMAB）溶液（0.2g/L）;
Tris-HCl缓冲溶液pH=7.55;
Tween-20;
十二烷基苯磺酸钠（SDBS）;
十二烷基硫酸钠（SDS）;
乙腈。
三聚氰胺分子印迹聚合物固相萃取柱:
自制。
所用试剂均为分析纯。
实验用水为二次蒸馏水。
6.3实验方法
三聚氰胺分子印迹固相萃取柱的制备：
以三聚氰胺为模板分子，以α-甲基丙烯酸为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，以乙醇-水（5:
1，V/V）为溶剂，60℃聚合24h，制备三聚氰胺分子印迹聚合物。
取适量聚合物粉末装入固相萃取空柱中，两端分别用滤膜垫片堵住，备用。
奶粉样品的制备：
参照国标法处理样品:
在离心管中分别准确移取1mL或1.0g牛奶样品，加入5mL1%三氯乙酸（pH=3.0）和乙腈混合液（3:
1，V/V），超声10min，振荡10min，以8000r/min离心10min，转移合并上清液，将上清液减压蒸干，水溶，用0.45μm微孔滤膜过滤得样液。
吸光度的测定：
于10mL比色管中，依次加入一定量MEL工作液、TCBQ溶液1.8mL、
CTMAB溶液0.5mL和Tris-HCl缓冲溶液1.2mL；再取一10ml比色管，依次加入一定量的奶粉样品、TCBQ溶液1.8mL、CTMAB溶液0.5mL和Tris-HCl缓冲溶液1.2mL。
所有比色管摇匀，用乙腈定容至5mL，于30℃水浴中反应40min后，取出冷却至室温，用1cm吸收池，以试剂空白为参比，在309nm处测其吸光度。
6.4数据处理
用所得的吸光度值做线性回归方程，求出样品中的三聚氰胺含量。
6.5共存物质的干扰
当三聚氰胺溶液浓度为1.0×10－6mol/L，测定的相对误差在±5%范围内时发现，牛奶中一些常见物质对三聚氰胺测定的最大允许倍数分别是:
Mg2+（200）K+
（200）、Fe3+（100）、Ca2+（50）、Zn2+（10）、蔗糖（50）、葡萄糖（200）、麦芽糖（200）、维生素C（100）。
2.2.6样品加标回收率
采用两种方法测定样液，均未检出三聚氰胺。
对样品进行三个浓度水平的加标回收率测定，结果见表2.1。
可见新建分光光度法测定三聚氰胺结果满意;用两种方法进行样品预处理时，方法2的加标回收率优于方法1，反映自制固相萃取柱预处理样品效果更好。
表2.1
方法1
编号
加入量
c/（μmol/L）
测量值
c/（μmol/L）
回收率
/%
RSD
/%
1
0.4
0.474
118.5
1.9
2
0.8
0.705
88.1
2.1
3
1.6
1.416
88.5
1.5
方法2
编号
加入量
c/（μmol/L）
测量值
c/（μmol/L）
回收率
/%
RSD
/%
1
0.4
0.413
103.2
1.3
2
0.8
0.788
98.5
0.7
3
1.6
1.579
98.7
1.1
7表面解吸常压化学电离质谱法
7.1实验原理
由于三聚氰胺呈碱性,在正离子模式下易质子化形成[M+H]+的分子离子,因而在质谱中获得很强的信号峰（m/z127）。
选择m/z127分子离子峰进行二级质谱研究,主要得到特征离子m/z110,85,68和60（如图2所示）,分别为母离子丢失NH3、NH2CN、NH2CN及NH3、HNCNCN所致,另外,二级质谱碎片离子m/z85的三级质谱中,可产生m/z68的碎片离子,为二聚氰胺质子化离子进一步丢失NH3所致。
为了确保结果的可靠性,实验还采用ESI-MS方法对三聚氰胺进行了MS/MS谱对照分析,,并且通过氘代三聚氰胺的SDAPCI-MS/MS谱图对有关特征离子的结构式（如图2及图3所示）进行了确认。
如果在实际样品中能够检测到信号峰m/z127,并且在MS/MS谱中观察到主要特征离子m/z110、85（基峰）、68和60,则可以判断该样品中含有三聚氰胺,如图3所示。
7.2仪器与试剂
SDAPCI离子源:
如图1所示。
LTQ-XL型线性离子阱质谱仪。
三聚氰胺,使用时配置成100.0mg/kg水溶液备用;奶粉样品。
7.3实验方法
线性回归方程建立：
配制0.010、0.10、1.0、10.0和100.0mg/kg的三聚氰胺标准溶液,分别取100uL滴在不含三聚氰胺的奶粉样品中,按前述实验方法进行SDAPCI-MS实验。
7.4数据处理
将二级质谱中获得的信号扣除背景后以m/z85的净响应信号强度表示,每个浓度的标准样品测定6次,测定净响应信号强度平均值及相应相对标准偏差。
信号强度与样品浓度分别取对数,绘制工作曲线。
在0.01~100mg/kg范围内,离子强度的对数（Y）与浓度的对数（X）具有较好的线性关系。
对0.10mg/kg标准样品进行测定,获得净响应信号强度为72（n=6）。
本方法三聚氰胺的检出限为8.8Lg/kg。
7.5线性范围、检出限、回收率和精密度
配制0.010、0.10、1.0、10.0和100.0mg/kg的三聚氰胺标准溶液,分别取100LL滴在不含三聚氰胺的奶粉样品中,按前述实验方法进行SDAPCI-MS实验。
将二级质谱中获得的信号扣除背景后以m/z85的净响应信号强度表示,每个浓度的标准样品测定6次,测定净响应信号强度平均值及相应相对标准偏差（括号内）依次为:
58（9.2%）、72（3.9%）、98（5.6%）、145（8.3%）、205（5.8%）。
信号强度与样品浓度分别取对数,绘制工作曲线。
在0.01~100mg/kg范围内,离子强度的对数（Y）与浓度的对数（X）具有较好的线性关系。
线性回归方程Y=0.1402X+2.0168,相关系数r=0.990。
对0.10mg/kg标准样品进行测定,获得净响应信号强度为72（n=6）,并测得空白样品的3倍标准偏差为6.336（S/N=3,n=20）,计算得本方法对三聚氰胺的检出限为8.8Lg/kg。
回收实验时,在9份0.1g奶粉样品中,3份加入100LL水,6份分别加入100LL1.0mg/kg和5.0mg/kg（各3份）三聚氰胺的标准溶液,按照实验方法进行测定。
获得样品中三聚氰胺含量为2.2mg/kg（n=6）,加标回收率分别为:
93.1%、105.4%、112.8%、97.5%、86.7%、10312%。
这可能是由于手动进样时的不稳定性（如抖动等原因）和样品表面不均匀性造成的,如果采用自动进样则可能克服此问题,进一步提高其分析性能。
8超高效液相色谱-串联质谱法
8.1原理
三聚氰胺是一种弱碱性化合物,微溶于冷水,可溶于甲醇、乙腈、甲醛、乙酸、三氯乙酸、热乙二醇、甘油、吡啶等。
本实验以含5%乙酸铅的三氯乙酸的溶液做为提取液,能够有效沉淀样品基质中的蛋白。
样品经过甲基叔丁基醚的液液萃取,能有效地除去基质中的油脂。
采用混合阳离子交换固相萃取柱能进一步除去样品基质干扰,提高方法的回收率及灵敏度。
8.2实验仪器与试剂
Agilent1200超高效液相色谱仪
离心机
涡旋混合器
固相萃取仪
氮吹仪
乙腈（HPLC级）,甲醇（HPLC级）,乙酸铵（HPLC级）,超纯水,三聚氰胺标准品（纯度>99%）,三氯乙酸（分析纯）,乙酸铅（分析纯）,氨水（分析纯）,水（超纯水）,PCX混合阳离子交换柱（60mg/3mL）。
三聚氰胺标准储备液（1mg/mL）,三聚氰胺标准工作液（5Lg/mL）。
三聚氰胺标准溶液（1~1000ng/mL）。
8.3实验步骤
样品提取：
准确称取2.0±0.01g待测样品于50mL离心管中,加入20mL提取液（含5%乙酸铅的三氯乙酸溶液）,液体样品加提取液定容至20mL,涡旋2min,超声提取25min,静置2min,10000rPmin离心10min。
样品净化：
将离心液倒入装有20mL甲基叔丁基醚的分液漏斗中,剧烈震荡2min,静置10min,收集下层液。
分别用3mL甲醇,3mL水活化混合型阳离子交换固相萃取柱,准确移取10mL收集液分次上柱,控制过柱速度在1mLPmin以内,再用3mL水和3mL甲醇洗涤混合型阳离子交换固相萃取柱,抽近干后用3mL氨化甲醇（V（氨水）BV（甲醇）=5B95）洗脱,收集洗脱液于50e氮吹下吹干
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