血清成分分析.docx
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血清成分分析
血清成分分析
摘要：
血清由许多化学成分组成，包括白蛋白、α1、α2、β、γ-球蛋白,甘油三酯,总胆固醇,谷丙转氨酶等。
本次实验，我们对血清成分进行分析，如用邻苯二甲醛法测定血清总胆固醇；用盐析、浓缩分离蛋白质并用醋酸纤维素薄膜电泳鉴定；用纸层折法观察肝脏谷丙转氨酶ALT的转氨作用；用分光光度法测定血清丙转氨酶的活力。
在掌握各种鉴定方法之外，为应用与生活提供理论与实验基础。
关键词：
血清、家鸡、乌鸡、胆固醇、清蛋白、γ-球蛋白、谷丙转氨酶
前言：
血清，指血液凝固后，在血浆中除去纤维蛋白分离出的淡黄色透明液体或指纤维蛋白已被除去的血浆。
其主要作用是提供基本营养物质、提供激素和各种生长因子、提供结合蛋白、提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤、对培养中的细胞起到某些保护作用。
胆固醇在血液中存在于脂蛋白中，在血中存在的胆固醇绝大多数都是和脂肪酸结合的胆固醇酯，仅有10%不到的胆固醇是以游离态存在的。
通过对血液中胆固醇含量的测定，能够判断身体健康状况，从而来调整饮食。
谷丙转氨酶，主要存在于肝脏、心脏和骨骼肌中。
肝细胞或某些组织损伤或坏死，都会使血液中的谷丙转氨酶升高。
我们通过对血液中谷丙转氨酶的测定，可以来判断肝功能。
本次实验通过对血清总胆固醇含量测定，分离蛋白质并鉴定；观察肝脏谷丙转氨酶ALT的转氨作用；测定血清丙转氨酶的活力，对应用与医学生理的基础实验进行进一步的探究。
并提升生化实验技能。
1实验材料和方法：
1.1实验材料：
乌鸡和家鸡血清及肝脏
1.2实验方法：
1.2.1血清胆固醇的定量测定（邻苯二甲醛法）
1、标准曲线的绘制
取清洁干燥试管5支，编号，按表2加入试剂。
表2邻苯二甲醛法测定血清总胆固醇——标准曲线的绘制
编号
试剂
编号
编号
编号
编号
编号
0
1
2
3
4
标准胆固醇应用液/mL
0
0.1
0.2
0.3
0.4
醋酸/mL
0.4
0.3
0.2
0.1
0
邻苯二甲醛试剂/mL
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
蒸馏水/mL
0.01
0.01
0.01
0.01
0.01
混合酸/mL
4.0
4.0
4.0
4.0
4.0
100mL血清中总胆固醇含量/mg
0
100
200
300
400
A550nm
加毕，混匀，静置10min，以550nm波长比色测定，以吸光度值为纵坐标，胆固醇含量为横坐标，做标准曲线。
2、样品的测定
取2支清洁干燥试管，编号后，按表3加入试剂。
表3邻苯二甲醛法测定血清总胆固醇——样品的测定
试管
试剂
对照
样品
醋酸/mL
0.4
0.4
血清/mL
0.01
0.01
邻苯二甲醛试剂/mL
0
0.2
无水乙醇/mL
0.2
0
混合酸/mL*
4.0
4.0
*硫酸含量的高低对显色有影响，故混合酸的配制和测定过程中的加量都应准确。
显色时要避免高温，采用混合酸液反应时温度不会升得太高，一般在4~32℃时，颜色能稳定2h。
加毕，混匀，静置10min，于550nm波长比色，以对照管校零点，对照标准曲线即知100mL样品中总胆固醇含量（mg）。
1.2.2血清清蛋白与γ-球蛋白的分离与鉴定
1.2.2.1血清清蛋白与γ-球蛋白的盐析
血清清蛋白与γ-球蛋白的盐析实验步骤
取离心管一支，加入2mL血清
加入2mLPBS（稀释血清），摇匀
逐滴加入pH=7.2的（NH4）2SO4溶液2mL，边加边摇
静止30min，离心20min（v=3000rpm）
上清液（主要含有清蛋白）
沉 淀（主要含有γ-球蛋白）
加入3.132g（NH4）2SO4，使上清液饱和
加1mLPBS溶解
静止30min
逐滴加入饱和（NH4）2SO4溶液0.5mL
（相当于33%饱和（NH4）2SO4溶液）
离心、沉淀
加1mLPBS溶解沉淀
放置30min
放入透析袋
离心20min（v=3000rpm）*
*放弃离心后的上清液（主要是α、β球蛋白），沉淀即为初步纯化的γ-球蛋白
1.2.2.2血清清蛋白与γ-球蛋白的透析与浓缩
1.取玻璃纸（15cm×15cm）两张，折成袋状。
将前面第一次盐析得到的含有清蛋白的上清液和γ-球蛋白分别倒入两个透析袋中，用线绳系紧上口。
2.用玻璃棒悬挂在盛有半杯蒸馏水的100mL烧杯中，使透析袋下半部浸入水中，将烧杯放在微量振荡器上振荡1h（中间换水1-2次）。
3.将透析袋取下，小心将线绳解开，用滴管吸收袋内的液体放入干净的试管中。
4.用双缩脲法分别检查袋内外液体蛋白质。
在用BaCl溶液检查烧液体的NH4+和SO42-。
记录实验现象，观察透析法除盐的结果。
5.将两透析袋取出，埋入蔗糖中浓缩。
1.2.2.3血清清蛋白与γ-球蛋白的鉴定（醋酸纤维素薄膜电泳法）
醋酸纤维素薄膜电泳实验步骤
浸泡
将醋酸纤维素薄膜在缓冲溶液中浸泡20min，取出识别光面和麻面。
点样
用镊子将薄膜置于滤纸上，吸收多余的液体，用铅笔在薄膜麻面一端2cm处画一细线，利用载玻片一侧蘸取样品，于细线处点样。
电泳
将薄膜麻面朝下，平悬于电泳槽支架的滤纸桥上，点样一端靠近负极；通电后先使U=80V，待10min后，使U=120V电泳40min。
染色
将薄膜取出后，置于氨基黑10B染色剂重，染色10min。
漂洗
将薄膜取出后，移至漂洗液中，漂洗若干次，至无蛋白区无蓝黑色。
1.2.3谷丙转氨酶活性的鉴定及活力单位的测定
1.2.3.1谷丙转氨酶活性的鉴定（纸层析法）
1.2.3.1.1谷丙转氨酶提取液制备
谷丙转氨酶提取液制备方法
2g肝脏+0.9%NaCl6mL+海砂200mg
在低温下，研磨成浆
用脱脂棉过滤，得提取液（滤液不清）
1.2.3.1.2转氨作用
试 剂
对照管
测试管
0.1moL/L谷氨酸
0.50
0.50
0.1moL/L丙酮酸钠
0.50
0.50
0.1%KHCO3
0.50
0.50
0.025%一溴乙酸
0.25
0.25
煮沸的酶液
0.50
—
酶液
—
0.50
加脱脂棉塞，45℃水浴，1.5h，时时振荡内容物
2%乙酸
6滴
6滴
沸水浴2min，使蛋白质完全沉下，过滤，作层析
1.2.3.1.3纸层析
纸层析方法
取圆形层析滤纸1张，在圆心处用圆规绘出直径为3cm的同心圆
通过中心将滤纸绘成四等分扇形，用毛细管点样2-4次（直径不超过2mm）
在滤纸的圆心上剪一小孔，直径约1-2mm
取一小滤纸条，将下端剪成刷状，在卷成灯芯插入圆形小孔，不能使灯芯突出纸面
将圆形滤纸平放在盛有层析液（水饱和酚）培养皿上，使灯芯向下与溶剂接触
用大小相同的培养皿盖在滤纸上
溶剂通过灯芯上升到滤纸上向四周展层，直到溶剂前沿移至距滤纸边缘约1cm处时停止（展层时间为1h）
80-100℃烘箱干燥，喷洒水合茚三酮的正丁醇溶液，80-100℃显色
1.2.3.2血清谷丙转氨酶活力单位测定
1、标准曲线的绘制
试 剂
试管号
0
1
2
3
4
5
丙酮酸钠标准液（mL）
—
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
GPT基质液（mL）
0.50
0.45
0.40
0.35
0.30
0.25
pH7.4磷酸缓冲液（mL）
0.10
0.10
0.10
0.10
0.10
0.10
充分摇匀后，置于37℃水浴，保温10min
2，4-二硝基苯肼（mL）
0.50
0.50
0.50
0.50
0.50
0.50
充分摇匀后，置于37℃水浴，保温20min
0.4mol/LNaOH（mL）
5.00
5.00
5.00
5.00
5.00
5.00
充分摇匀，室温静置30min后，以0号管为空白，520nm波长下比色
A520nm值
各管所含丙酮酸量（μmol）
—
0.10
0.20
0.30
0.40
0.50
各管相当GPT单位数
—
100
200
300
400
500
以酶的活力单位数为横坐标，以光吸收值为纵坐标，绘制A520nm与对应的酶活力单位数的标准曲线。
（1）丙酮酸钠标准液mL数×摩尔浓度（2μmol/mL）；
（2）GPT活力单位为：
每mL血清在37℃与pH=7.4的基质液作用60min，生成1μmol丙酮酸为一个单位（U）。
本实验（临床检验）取血清量为0.1mL，报告数据以100mL血清计算，因此将实际测得结果×1000即可。
2、酶活力的测定
试 剂
测定管
对照管
1
0
GPT基质液（mL）
0.50
0.50
37℃水浴，预温10min
血清（mL）
0.10
—
PH7.4磷酸缓冲液（mL）
—
0.10
充分摇匀后，置于37℃水浴，保温60min
2，4-二硝基苯肼（mL）
0.50
0.50
充分摇匀后，置于37℃水浴，保温20min
0.4mol/LNaOH（mL）
5.00
5.00
充分摇匀后，室温静置30min后，520nm波长下比色
A520nm值
相当于GPT单位（mL）
2实验结果
2.1血清胆固醇的定量测定
100ml血清中总胆固醇含量/mg
0
100
200
300
400
A550
0
0.169
0.456
0.642
0.880
由标准曲线得：
项目
种类
家鸡
乌鸡
吸光度
0.095
0.072
100ml血清中总胆固醇含量/mg
43.18
32.73
2.2血清清蛋白与γ-球蛋白的分离与鉴定
清蛋白
全血清
γ-球蛋白
2.3谷丙转氨酶活性的鉴定及活力单位的测定
2.3.1谷丙转氨酶活性的鉴定
纸层析结果：
丙氨酸
对照
谷氨酸
乌鸡
由于谷氨酸转化为丙氨酸为可逆反应，所以乌鸡组有两条带，分别为谷氨酸和丙氨酸，对照组有一条带为谷氨酸，标准谷氨酸和丙氨酸也为一条带，分别为自身。
2.3.2血清谷丙转氨酶活力单位测定
酶活力单位数
0
100
200
300
400
500
A520
0
0.090
0.211
0.303
0.423
0.522
项目
种类
家鸡
乌鸡
吸光度
0.065
0.080
100ml血清中酶活力单位数
62
77
3分析与讨论
3.1胆固醇含量测定结果表明：
家鸡血清中总胆固醇含量略高于家鸡。
生活中，可以通过不同种类鸡蛋的选择来控制胆固醇的摄入量。
3.2醋酸纤维素薄膜电泳总体效果尚可。
γ-球蛋白由于点样与电泳时间间隔较长，电泳效果不太理想，条带不连贯。
全血清电泳应该有4条带，但结果只有3条，分析原因可能是：
（1）搭桥时，薄膜未绷直，中间塌陷，导致中间两条带分离不明显。
（2）电泳时间不够长。
在漂洗环节，由于漂洗液不够，导致漂洗效果较差。
3.3从纸层析结果看谷氨酸转化为丙氨酸的效果不理想。
可能是操作时手指接触滤纸，干扰最后的显色，或者是点样不够均匀。
3.4谷丙转氨酶活力测定结果表明：
乌鸡血清中谷丙转氨酶活力高于家鸡，说明乌鸡体内蛋白质代谢更加旺盛。
分光光度计存在一定误差，可能对实验最后的数据有一些影响。
参考文献：
1.酸菜中降胆固醇功能植物乳杆菌的体外筛选-食品与生物技术学报-2011年第3期（30）
2.地沟油中胆固醇的LC／MS／MS定性定量检测-重庆理工大学学报：
自然科学-2011年第12期
3.蛋白质、胆固醇对卵磷脂囊泡稳定性的影响-厦门大学学报：
自然科学版-2011年第1期（50）
4.甲氰菊酯对尼罗罗非鱼组织乙酰胆碱酯酶、谷丙转氨酶和谷胱甘肽活性的影响-淡水渔业-2011年第3期（41）
5.乙型肝炎病毒阳性与谷丙转氨酶测定的相关性-现代中西医结合杂志-2011年第7期（20）
6.对某院体检谷丙转氨酶异常状况的分析-求医问药：
下半月刊-2011年第10期（9）
7.血清详解．健德堂．2011-11-11[引用日期2012-12-15]
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