分子克隆常规操作B.docx

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分子克隆常规操作B

分子生物学实验常规技术操作

目录

1.质粒提取

1.1小提质粒

1.2小量快提质粒鉴定：

1.3大提质粒：

2.酶切

2.1制备型酶切

2.2小量酶切鉴定

2.3DNA片段5'突出端的补平

3.琼脂糖凝胶电泳

4.回收

4.1从低熔点琼脂糖凝胶中回收DNA片段

4.2小量胶回收DNA片段试剂盒操作（见操作手册）

4.3无水乙醇沉淀回收

5.连接

5.1一般连接

5.2平端动态连接

6.转化

6.1质粒快速转化

6.2连接物转化

7.制普通固体培养板

8.涂板

9.挑菌

10.血清中病毒核酸的提取（蛋白酶K法）

哺乳动物细胞单克隆株分离

常用溶液、培养基配制

1.质粒提取：

1.1小提质粒：

本实验室在常规条件下采用碱裂解法小量提取质粒

（1）从平板上挑取单菌落或摇甘油菌（5～50uL），接种于3mLLB液体培养基中（加有相应的抗生素），37℃振荡培养至OD6002.0以上，但也无需过浓。

*通常DH5а菌株摇12～14hr;JM1017～8hr;ER256610～12hr*

（2）取1.5mL菌液于1.5mLEppendorf管（可取未灭菌的新管）中，12000rpm离心15～30sec，弃上清。

通常可取1.5mL菌液再离心一次，弃去上清后在纸上扣干。

*不要忘记将用完的试管及管盖放入指定处以备回收处理*

（3）加入100uL溶液I，振荡使菌体沉淀充分悬浮。

*务必悬浮完全*

（4）加入200uL溶液II，立即轻轻翻转几下，使菌体裂解。

*可观察到原浑浊的菌悬液变清变粘*

（5）加入150uL溶液Ⅲ，立即上下颠倒充分混匀7～10次，不宜太剧烈。

*可观察到白色絮状沉淀出现。

*

（6）12000rpm离心3-5分钟。

（8）在离心过程中可取未灭菌的新1.5mLEppendorf管，加入等体积（350～400uL即可）酚-氯仿（25:

24）备用；取灭菌过的新1.5mLEppendorf管，加入等体积（350-400即可）的异丙醇备用。

*加酚-氯仿-异戊醇时要小心，应吸位于下层的酚相，而不要带入上层的Tris-cl保护液*

（9）离心完将上清迅速倒入已加好的酚-氯仿中,充分混匀。

*小心不要将白色沉淀物倒入酚-氯仿-异戊醇中*

（10）12000rpm离心3～5分钟。

（11）吸水相，加入已加好的异丙醇中,颠倒混匀几次。

*小心不要吸入酚相，没把握时宁愿放弃一些水相*

（13）12000rpm离心3-5分钟。

（14）迅速弃上清，沉淀用适量70%乙醇洗一次，于纸上扣干。

*小心不要将沉淀洗掉*

（15）置于恒温器上干燥（55℃）至无色透明或无乙醇气味，一般大约5min。

（16）加入30～40uL1×TE或ddH2O缓冲液溶解沉淀，-20℃储存备用。

*做完实验请及时收拾实验台*

1.2小量快提质粒鉴定：

（目前较少采用）

（1）取培养的菌液1mL，12000rpm离心30s，收集菌体，在纸上扣干残留培养液。

（2）用50uL无菌水充分悬浮菌体。

（3）每管加入50uL酚-氯仿-异戊醇（25：

24：

1）并充分混匀。

（4）12000rpm离心10分钟。

（5）小心吸取5uL上清上样电泳。

（对于插入片段足够大的重组子，其迁移率应低于未插入片段的对照质粒。

）

*做完实验请及时收拾实验台*

1.3大提质粒：

（1）从－20℃保存的甘油菌吸取50uL菌液，接种到3～4mL的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600为1.6～1.8。

（2）取0.5mL菌液接种到200mLLB培养基中，37℃振荡培养至OD600为2.0以上，再加入氯霉素至170ug/mL，37℃继续振荡培养12～16hr。

（3）将摇好的菌液4000rpm离心15min。

（4）弃上清，敞开离心管口倒置，尽量让上清全部流尽。

（5）用预冷的40mLSTE充分悬浮菌体沉淀。

（6）4℃，4000rpm离心10min。

（7）弃上清，敞开离心管口倒置，让上清全部流尽。

（8）用预冷的4mL溶液Ⅰ充分悬浮菌体沉淀。

（9）加入新鲜配制的溶液Ⅱ8mL，上下颠倒几次，液体会变得澄清，置于4℃10min。

（10）加入预冷的溶液Ⅲ6mL，上下颠倒混匀后，4℃中放置30min。

（11）4℃，12000rpm离心10min。

（12）收集上清，加等体积的异丙醇，4℃放置30min。

（13）4℃，10000rpm离心10min。

（14）弃上清，用70％的乙醇洗沉淀一次，室温吹干，溶于1mL1×TE中。

（15）加50uLRNaseA，37℃作用2小时。

（16）加1mL新配制的13％的PEG8000溶液（13%PEG8000，1.6MNaCl），充分混匀，4℃放置30min。

（17）4℃，12000rpm离心15min。

（18）吸去上清，用400uL1×TE溶解沉淀。

（19）加1/4体积4MLiCl，室温放置5min，12000rpm离心5min。

（20）取上清，用酚、酚－氯仿-异戊醇各抽提一次。

（21）将水相转入一新的Eppendorf管中，加入1/10体积4MLiCl，2倍体积的无水乙醇，－20℃放置30min。

（22）4℃，12000rpm离心10min，去上清，70％的乙醇洗沉淀一次，室温晾干。

（23）加200uL1×TE溶解沉淀，测定质粒DNA的浓度后于－20℃保存备用。

*做完实验请及时收拾实验台*

2.酶切：

2.1制备型酶切：

（1）在灭菌过的新0.5mLEppendorf管中加入下列成分混合：

注意：

酶切时酶要在最后才加，加酶时要用新的枪头，动作要迅速，酶不要在空气中暴露过久；要尽量保持低温，不要用手直接接触储存管上装酶的部位；用完后要盖紧放回原处；要用新酶或有问题时请找管理员xxy。

注意：

酶切时用酶量不能过大，过大会影响酶切并且可能会有星号效应。

引起酶切效果不佳的原因一般多是质粒没有提好。

除个别特殊位点或内切酶外，酶切时间均不宜过长。

DNA样品

20uL

10×反应缓冲液*

4uL

RnaseA

1.5uL

ddH2O

12.5

限制性内切酶A

（限制性内切酶B

1uL

1uL

反应总体积

40uL

*为了保证酶切效率（至少在75%以上），需选用合适的反应缓冲液，不同公司的酶切反应缓冲液基本上可以通用。

但需注意有的要另外加BSA（10×和100×的都有）。

（2）37℃反应4小时（可依据所使用酶的需要，选用合适的酶切时间和温度）。

（3）取1～2uL电泳鉴定。

*做完实验请及时收拾实验台*

2.2小量酶切鉴定

（1）在灭菌过的新0.5mLEppendorf管中加入下列成分混合：

注意：

酶切时酶要在最后才加，加酶时要用新的枪头，动作要迅速，酶不要在空气中暴露过久；要尽量保持低温，不要用手直接接触储存管上装酶的部位；用完后要盖紧放回原处；要用新酶或有问题时请找管理员xxy。

注意：

酶切时用酶量不能过大，过大会影响酶切并且可能会有星号效应。

引起酶切效果不佳的原因一般多是质粒没有提好。

除个别特殊位点或内切酶外，酶切时间均不宜过长。

注意：

做小量酶切鉴定时要尽量选用较为廉价的酶

DNA样品

5uL

10×反应缓冲液*

1.5uL

RNaseA

0.5uL

ddH2O

8uL

限制性内切酶A

（限制性内切酶B

0.1uL

0.1uL

反应体积

15uL

*请根据保证酶切效率（至少在75%以上）的需要选用合适的反应缓冲液，不同公司的酶切反应缓冲液基本上可以通用。

但需注意有的要另外加BSA（10×和100×的都有）。

（2）37℃反应2～3小时（可依据所使用酶的需要，选用合适的酶切时间和温度）。

（3）取1～2uL电泳鉴定。

*做完实验请及时收拾实验台*

2.3DNA片段5'突出端的补平:

（1）在灭菌过的新0.5mLEppendorf管中加入下列成分混合：

注意：

酶要在最后才加，加酶时要用新的枪头，动作要迅速，酶不要在空气中暴露过久；要尽量保持低温，不要用手直接接触储存管上装酶的部位；用完后要盖紧放回原处；要用新酶或有问题时请找管理员xxy。

欲处理的DNA样品

2ug

10×Klenowbuffer

3～4uL

10mMdNTP

2uL

ddH2O

适量

DNA聚合酶I（Klenow大片段）

5～10U

反应体积

30～40uL

（2）37℃反应1小时后，低熔点琼脂糖凝胶回收。

*做完实验请及时收拾实验台*

3.琼脂糖凝胶电泳：

（1）制备凝胶：

根据需要，在指定的三角瓶中配制50/100mL特定浓度的琼脂糖凝胶。

首先在电子天平上称取一定量的琼脂糖粉，倒入指定的三角瓶中，加入100mL1×TAE,再加入3～4uL溴化乙锭（EB）,混匀，在微波炉中煮化（大约4～5min），混匀后倒入插好样品梳的凝胶槽中,凝固后备用。

*溴化乙锭（EB）有潜在的致癌性，操作时要戴手套，并且注意不要污染其它操作区*

*在微波炉中煮化时要小心不要让凝胶暴沸*

*倒胶时不要倒太厚，一般可插入梳子5mm左右即可*

*倒回收胶要使用专用的样品梳和凝胶槽*

*分离不同大小的DNA片段请选用合适浓度的琼脂糖凝胶*

琼脂糖凝胶（%）

线性DNA的有效分离范围（kb）

0.5

2～30

0.8

1.5～10

1.01.0～7

1.2

0.7～6

1.5

2.0

2.5

3.0

0.5～3

0.2～2

0.1～1.5

0.07～1.0

（2）待胶凝固后，小心拔去梳子，拔出时注意不要破坏胶孔。

（3）用刀片切下所需的胶块，放入加有足够电泳缓冲液（1×TAE）的电泳槽中，缓冲液面高于凝胶表面3～5mm即可。

*注意电泳时使用的是1×TAE缓冲液，而母液是50×的，配制时要留神*

*在放入凝胶要上样前，最好检查一下样品孔是否有破损泄漏，尤其是上回收样品之前*

（4）可在一干净手套上点滴适量（1～3uL）的3×溴酚兰上样缓冲液（深绿色），用枪移取适量的样品（1～10uL）与滴加好的溴酚兰上样缓冲液混合（可观察到混合液变为蓝色），再将混合液小心加入胶上的样品孔中。

*上样要迅速准确，上样量不要过大以致漫出样品孔*

*若样品要求无污染，可使用新的灭菌枪头上样*

*若样品无严格要求（如用来做小量酶切鉴定的样品），可用一个枪头多次上样，但每次上样前在电泳缓冲液中洗几下*

（5）接通电极进行电泳，电压一般可在140V～200V。

*注意要接对正负极，核酸是由负极向正极方向跑的*

*打开及关闭电泳仪时请特别注意，不要用沾染有EB的手套接触电泳仪*

（6）当溴酚兰迁移至足够距离时（至少1cm）,关闭电源，取出胶块放到紫外灯下观察。

*在紫外灯下观察时要注意保护眼睛，不要用裸眼直接观察*

*一般质粒样品电泳时，电泳迁移率从跨快倒慢依次是：

RNA、溴酚兰、cccDNA、LcDNA、OcDNA

那些始终跑不出孔的样品多是染色体

*观察结束后，要及时处理凝胶及手套，严禁随处抛弃*

*做完实验请及时收拾实验台*

4.回收：

4.1从低熔点琼脂糖凝胶中回收DNA片段

（1）将已经电泳确定的可回收的酶切产物在合适浓度的回收用琼脂糖凝胶中进行电泳。

*最好换用新的电泳缓冲液，即1×TAE*

（2）当溴酚蓝跑到一定距离后（至少2cm以上）在长波紫外灯下观察，用清洗过的刀片在目的片段前切下一与目的片段同长，宽度适当（一般1cm左右）的胶块。

*不要忘记在胶下垫一个新的塑料手套防止污染*

*小心不要将回收胶切裂,同时注意与目的带相邻的切面要尽量平整*

（3）将切好的回收胶块放在原回收胶槽内，在切去胶块处加入低熔点琼脂糖胶，待其凝固后将其小心放回电泳槽继续进行电泳。

*小心低熔点琼脂糖凝胶块与原回收胶块的交界面易断裂*

（4）待目的带完全进入低熔点琼脂糖凝胶后，在长波紫外灯下用清洗过的刀片切下含有所需DNA带的凝胶条，置于新的灭菌过的1.5mLEppendorf管中,加300uLTE。

（5）65℃水浴10min或更长使胶块完全融化。

（6）立即加入等体积（300-350uL）Tris-Cl饱和酚（pH8.0）,摇晃混匀。

（7）12000rpm离心5min。

（8）小心将水相移置另一1.5mLEppendorf管中，加入等体积的酚-氯仿-异戊醇，摇晃混匀。

*小心不要吸入下层杂质及酚相，没把握时宁愿放弃一些上层水相*

（9）12000rpm离心5min。

（10）小心将水相移置另一1.5mLEppendorf管中，加入2.5～3倍体积（780uL即可）预冷的无水乙醇。

*小心不要吸入下层杂质及酚相，没把握时宁愿放弃一些上层水相*

（11）置液氮3分钟，取出后可于-20℃放几分钟。

小心防止管子爆裂。

（12）12000rpm离心10min。

（13）迅速弃上清，一般在管底会有针尖大小的沉淀物，小心用无水乙醇后清洗后置于恒温器上干燥（55℃）5～10min至无乙醇气味，再加入20uLddH2O溶解。

（14）取2uL电泳定量后－20℃储存备用。

*做完实验请及时收拾实验台*

4.2小量胶回收DNA片段试剂盒操作（见操作手册）

（1）将已电泳确定的可回收的酶切产物或其它产物在合适浓度的回收用琼脂糖凝胶中进行电泳。

*要换用新的电泳缓冲液，即1×TAE*

（2）当溴酚蓝跑到一定距离后（至少2cm以上）在长波紫外灯下观察，用清洗过的刀片切取含目的DNA的琼脂糖凝胶，尽可能小，置于一新的已灭菌过的1.5mlEppendorf管。

*回收胶下要垫一个新的塑料手套防止污染*

（3）每100mg凝胶加入300uL/450uLS1液，55OC温育10min，每2min颠倒一次。

*务必完全溶解*

（4）加入1/3体积（100uL/150uL）异丙醇，混勻，55OC，温育1min。

（5）将混合液移入吸附柱，高速（10000rpm）离心1min，弃去收集管液。

（6）往吸附柱中加入450ulW1，静置1min，高速离心15sec，弃去收集管液。

（7）重复步骤（6）一次，但无需静置。

（8）弃去收集管液后再高速离心1min。

（9）将吸附柱放于一干净的已灭菌的1.5mlEppendorf管，在吸附膜中央滴入30～40ulT1液或ddH2O，室温静置1min，当用ddH2O溶解时可在37OC置5min。

（9）高速离心1min，弃去吸附柱。

（10）取2uL电泳定量后－20℃储存备用。

*做完实验请及时收拾实验台*

4.3无水乙醇沉淀回收：

（1）将已确定的可回收产物溶于加有300uL1×TE缓冲液的灭菌过的新1.5mLEppendorf管。

（2）加入等体积的酚-氯仿-异戊醇，摇晃混匀。

（3）12000rpm离心5min。

（4）小心将水相移置另一灭菌过的新1.5mLEppendorf管中，加入2.5～3倍体积（780uL即可）预冷的无水乙醇。

*小心不要吸入下层杂质及酚相，没把握时宁愿放弃一些上层水相*

（5）置液氮3分钟，取出后可于-20℃放几分钟。

小心防止管子爆裂。

（6）12000rpm离心10min。

（7）迅速弃上清，一般在管底会有针尖大小的沉淀物，小心用无水乙醇后清洗后置于恒温器上干燥（55℃）5～10min至无乙醇气味，再加入20uLddH2O溶解。

（8）取2uL电泳定量后－20℃储存备用。

*做完实验请及时收拾实验台*

5.连接：

5.1一般连接：

（1）在灭菌过的新0.5mLEppendorf管中加入下列成分混合：

载体

0.5～1.5uL

目的基因*

适量

10×T4LigaseBuffer

1～1.5uL

T4DNA连接酶

ddH2O

1uL

适量

反应总体积

10～15uL

*目的片段所需量（ng）=载体量（ng）×目的片段长度×3/载体长度

（2）14～16℃连接2～14小时。

*做完实验请及时收拾实验台*

5.2平端动态连接

（1）在灭菌过的新0.5mLEppendorf管中加入下列成分混合:

线性化载体（平端酶SmaI/EcoRV/HincII处理）

目的片段

10×T4LigaseBuffer

相应平端酶（SmaI/EcoRV/HincII）

T4DNA连接酶

ddH2O

200ng

适量*

2uL

5～8U

10U

适量

反应总体积

20uL

*目的片段所需量（ng）=载体量（ng）×目的片段长度×3/载体长度

（2）25℃（SmaI）或37℃（EcoRV/HincII）作用3～4小时，将内切酶及连接酶灭活后转化。

*做完实验请及时收拾实验台*

6.转化

6.1质粒快速转化：

（1）根据需要，从超低温冰箱中迅速取出一管感受态细胞，用手捂化后，置于冰浴中10min以上，并请注明取出的日期时间。

不要取出后立即使用或使用已放置6hr以上的感受态细胞。

（2）在超净工作台内取一转化用1.5mlEppendorf管，先吸取20uL感受态细胞，再加入质粒（若质粒浓度大，只要枪头蘸一下即可，若低可取1～2uL用于转化）与之混合，混匀后冰浴15min。

*小心不要污染*

（3）42℃热休克90～120sec，取出迅速置冰浴中2min。

（4）加入200uLLB培养基（无抗性）,37℃振荡培养15-30min。

（5）取相应抗性的平板置于37℃预热。

（6）振荡培养15～30min后取100uL菌液涂板。

（7）37℃培养适当时间（菌株不同，培养温度和时间均有不同）。

通常DH5а菌株培养12～14hr;JM1017～8hr;ER256610～12hr；BL219-11hr

GI72430℃培养20～24hr（IMC平板）

*做完实验请及时收拾实验台*

6.2连接物转化：

（1）根据需要，从超低温冰箱中迅速取出一管感受态细胞，用手捂化后，置于冰浴中15min以上,并请注明取出的日期时间。

不要立即使用或使用已放置6hr以上的感受态细胞。

（2）在超净工作台内取一转化用1.5mlEppendorf管，吸取40uL感受态细胞和5uL连接物混合，混匀后冰浴30min。

*小心不要污染*

（3）42℃热休克90～120sec，取出迅速置冰浴中2min。

（4）加入200-300uLLB培养基（无抗性），37℃振荡培养40～60min。

*若连接物需用蓝白斑来鉴定，则在菌液涂板前30min，需预先在平板上均匀涂布上适当浓度的X-gal与IPTG，并在37℃中正放30min。

*

（5）取相应抗性的平板置于37℃预热。

（6）振荡培养40～60min后涂布平板。

（7）37℃培养适当时间（菌株不同，培养温度和时间均有不同）。

通常DH5а菌株培养12～14hr;JM1017～8hr;ER256610～12hr；BL219-11hr

GI72430℃培养20～24hr（IMC平板）

*做完实验请及时收拾实验台*

7.制普通固体培养平板：

（1）固体琼脂培养基的配制：

本实验室常用的是LB固体琼脂平板，浓度为1.5%，即在100mLLB液体培养基中加入1.5g的琼脂，灭菌后可使用。

（2）使用时取一瓶灭过菌的固体琼脂培养基，放在电炉上小心煮化。

*在电炉上煮化时一定要小心看守，防止其暴沸*

*有时会有部分固体琼脂沉积在瓶底，在煮化时要小心不要煮焦*

（3）将固培冷却至45～60℃，在超净工作台内按比例加入需要的抗生素，混匀。

*固培煮化后，可在流水下冷却，但须小心玻璃会卒冷爆裂*

*当冷却至手摸不烫时即可，冷却过头易于凝固*

（4）在超净工作台内按比例加入需要的抗生素，混匀后，将培养基倒入已灭菌过的平皿内，厚度适当。

*培养基不要倒太厚，一般3～5mm即可，也不要过薄，涂板时易涂破*

（5）平皿可正放在超净工作台内，待其冷却凝固后使用或放入冰箱4℃储存备用。

*在放入冰箱4℃前，要在平板上标记清楚所加的抗生素*

*做完实验请及时收拾实验台*

8.涂板：

（1）若所要使用的平板储存于冰箱4℃，则使用前须预先取出放在室温或37℃中预热一段时间。

*取用平板时一定要注意抗性*

*平板预热时最好倒置*

（2）在超净工作台内用枪将所要涂布的菌液移入平板。

*质粒转化一般只要涂100uL左右的菌液，连接物涂200～400uL*

（3）将涂布器先在酒精灯的外焰上灼烧，再浸入乙醇中，取出后再通过灯焰，燃尽其上的乙醇，待其冷却后方可使用。

*如平板的盖子内面上覆有水珠，可用于冷却涂布器*

*涂板时不要心急，一定要等涂布器充分冷却后方可使用*

（4）用涂布器将平板上的菌液涂布均匀，平板倒置放在培养箱中培养，除GI724（30℃）外，其它菌株均在37℃中培养。

*做完实验请及时收拾实验台*

9.挑菌：

（1）待平板上的菌落长至足够大即达到可挑的水平。

（2）在超净工作台中，在灭菌过的试管内倒入3～4mL灭菌过的培养基，培养基根据需要预先加入抗生素（由菌落所携带的质粒上的抗性基因决定）。

*抗生素要按比例加入培养基，并要加了抗生素的培养基上做清楚标记，没有用完的培养基要封好放入冰箱4℃，不要放在外面*

*请尽量使用冰箱内已加好抗生素的培养基*

（3）用镊子夹取灭菌过的牙签挑取平板上的单菌落，在试管内的培养基中蘸洗几下，旋紧管盖后再将牙签丢弃于超净台外的收集桶内，并请您扔准。

*挑菌时不提倡将牙签直接投入培养基中*

*挑菌时一定要挑清晰正常的单菌落*

*挑过菌的牙签一定不能留在超净工作台中*

（4）挑菌后请将装灭菌牙签的小烧杯封好，并及时将工作台清理干净。

（5）接种过菌落的试管放在摇床中在合适温度下摇动培养，摇速一般170～230r/min。

*试管要在摇床放好，有适当的倾斜角度（45。

左右）*

*要注意不同的菌株和摇菌目的，可能需要不同的温度和摇速。

*

*做完实验请及时收拾实验台*

10.血清中病毒核酸的提取（蛋白酶K法）：

（1）将血清装入新的灭菌过的1.5mLEppendorf管，每管200uL。

*使用血清，尤其是未灭活的血清时要注意安全，不要污染环境*

*一旦发生血清污染环境，请立即用84消毒液处理*

（2）在每管中加入STE156uL

10%SDS40uL

100×Pro-K4uL

然后在56℃中水浴2-3小时，每几分钟（一般5～10min）轻轻摇晃混匀一次。

*管子一定要仔细盖严，防止泄漏及外面的水进入*

（3）加入400uL的酚-氯仿-异戊醇，摇匀后静置几分钟（