大肠杆菌生产制备重组人胰岛素工艺.docx
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大肠杆菌生产制备重组人胰岛素工艺
1.提取目的基因:
既从人的DNA中提取胰岛素基因,可使用限制性内切酶将目的基因从原DNA中分离.
2.提取质粒:
使用细胞工程,培养大肠杆菌,从大肠杆菌的细胞质中提取质粒,质粒为环状DNA.
3.基因重组:
取出目的基因与质粒,先利用同种限制性内切酶将质粒切开,再使用DNA连接酶将目的基因与质粒"缝合",形成一个能表达出胰岛素的DNA质粒.
4.将质粒送回大肠杆菌:
再大肠杆菌的培养液中加入含有Ca+的物质,如CaCl2,这使细胞会吸收外源基因此时将重组的质粒也放入培养液中,大肠杆菌便会将重组质粒吸收.
5.胰岛素的产生:
再大肠杆菌内,质粒通过表达转录与翻译后,便产生出胰岛素蛋白质.通过大肠杆菌的大量繁衍,便可大量生产出胰岛素!
〖学习要求〗知道DNA的粗提取与鉴定的原理;掌握并能分析DNA粗提取的技术方法和要求;学会DNA分子的鉴定方法
【预习指导】在课前时间通过阅读教材、同学交流和讨论,完成下列问题,并初步巩固。
一、基础知识
活动1】阅读教材P54“基础知识”,讨论并回答下列问题:
1.(记忆)提取生物大分子的基本思路是利用它们的理化性质的不同进行分离。
2.(记忆)DNA的溶解性特点:
DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同;DNA不溶于酒精而蛋白质溶于酒精。
【思考1】据图5-1分析:
DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度有何特点?
在0.14mol/L时溶解度最小;
要使DNA溶解,需要使用什么浓度?
较高浓度,可使DNA溶解;
要使DNA析出,又需要使用什么浓度?
0.14mol/L可使DNA析出。
【思考2】利用DNA不溶于酒精的原理,可以达到将DNA和蛋白质进一步分离目的。
3.(记忆)DNA的耐受性特点:
蛋白酶能分解蛋白质而不能分解DNA;在60~80℃时蛋白质变性沉淀而DNA分子不变性。
洗涤剂能与蛋白质结合瓦解细胞膜而不破坏DNA分子。
4.(记忆)DNA的鉴定原理
当鉴定提取出的物质是否是DNA时,需要使用二苯胺(甲基绿)进行鉴定。
在沸水浴条件下,该试剂与DNA反应,呈现(浅)蓝色。
、实验设计
【活动2】阅读教材P55“实验设计”,讨论并回答下列问题:
1.(记忆)实验材料的选取:
选取材料时应本着DNA含量高、材料易得、便于提取的原则。
【思考3】你认为教材提供的材料中哺乳动物的血液不适合提取DNA。
2.(记忆)破碎细胞,获取含DNA的滤液:
鸡血:
向鸡血细胞液中加入一定量蒸馏水并玻棒搅拌,用纱布过滤后,收集滤液。
洋葱:
向研钵中加入一定量洗涤剂和食盐,搅拌研磨,用纱布过滤后,收集滤液。
【思考4】在以上实验中,蒸馏水的作用是使血细胞大量吸水而胀裂,洗涤剂的作用是瓦解细胞膜,食盐的作用是溶解DNA物质。
3.(学会)去除滤液中的杂质:
方案一:
30mL滤液→加NaCl使DNA溶解→过滤得滤液→加蒸馏水使DNA析出→过滤得过滤物→放到2mol/LNaCl溶液中溶解→DNA-NaCl溶解液
方案二:
30mL滤液→加嫩肉粉(木瓜蛋白酶)→静置10分钟→得DNA滤液
方案三:
30mL滤液→60~67℃处理→过滤得DNA滤液
思考5】以上三个方案的原理分别是什么?
方案一原理:
DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同;
方案二原理:
蛋白酶分解蛋白质,不分解DNA;
方案三原理:
DNA耐高温而蛋白质不耐高温。
【思考6】方案一中:
“加NaCl使DNA溶解→过滤得滤液”的目的是除去不溶(可溶、不溶)于NaCl溶液中的细胞杂质;“加蒸馏水使DNA析出→过滤得过滤物”的目的是除去可溶(可溶、不溶)于NaCl溶液中的细胞杂质。
4.(记忆)DNA的析出:
DNA滤液与等体积冷却酒精混合,静置一段时间后析出的白色丝状物就是DNA。
5.(记忆)DNA的鉴定:
取2支洁净的试管,编号甲、乙,各加入等量的
2mol/LNaCl溶液。
甲中放
入少量白色丝状物,使之溶解。
在甲、乙试管中各加
4mL二苯胺,混合均匀。
沸
水浴5min,观察颜色变化,甲试管呈现蓝色
、操作提示
注意事项:
1.在鸡血中加入柠檬酸钠防止凝固;鸡血静置或离心后除去血浆,以提高细胞
悬液浓度
2.实验中使用塑料烧杯和尼龙布,以免DNA被吸附。
3.玻棒沿同一方向缓慢搅拌(细胞破裂时快速搅拌),玻棒不要碰到烧杯壁。
4.二苯胺试剂要现用现配。
5.为提高DNA纯度,实验中通常使用的洗涤剂有CTAB、SDS等。
【活动4】观看视频:
观看“DNA的粗提取与鉴定”视频,体会并学会相关技术
方法。
课后学习〗
1.尝试从植物组织中提取DNA分子。
2.基础训练册:
将基础知识整理到作业本上;完成该节训练题。
〖学习要求〗
尝试PCR技术的基本操作,体验PCR技术的分子生物学实验方法;理解PCR技术的原理;讨论PCR技术的应用
【预习指导】在课前时间通过阅读教材、同学交流和讨论,完成下列问题,并初步巩固。
一、基础知识
活动1】阅读教材P58“PCR原理”,讨论并回答下列问题:
1.(记忆)PCR技术扩增DNA的过程与细胞内的DNA复制过程类似
思考1】填写下表:
(记忆)细胞内DNA复制条件分析
条件
参与的组分
在DNA分子复制中的作用
模板
DNA的两条单链
提供复制的模板
原料
四种脱氧核苷酸
合成DNA子链的原料
酶
解旋酶
打开DNA双螺旋
RNA聚合酶
合成RNA引物
DNA聚合酶
催化合成DNA子链;切除引物
DNA连接酶
将不连续的DNA子链连接起来
能量
ATP
为解螺旋和合成子链提供能量
引物
RNA
为DNA聚合酶提供合成的3'端起点
2.(理解)细胞内DNA的复制
1)DNA的结构:
脱氧核苷酸分子通过3,5-磷酸二酯键连接形成核苷酸长链,
两条脱氧核苷酸长链反向平行排列并螺旋化,形成DNA双螺旋结构。
2)DNA的复制:
首先,在解旋酶的作用下,由ATP供能,DNA发生解旋形成两条DNA单链。
其次,在DNA单链的3'端,在RNA聚合酶在作用下,合成RNA引物。
再次,在DNA聚合酶的作用下,从引物的3'端开始合成DNA子链。
最后,DNA聚合酶将引物切去,并合成空缺处DNA单链,再由DNA连接酶将
不连续的DNA子链连接起来
3.(记忆)DNA分子复制的人工控制
解开螺旋:
在80~100℃时,DNA双螺旋打开,形成两条DNA单链,称为变性。
恢复螺旋:
在50~60℃左右时,两条DNA单链重新形成双螺旋结构,称为复性。
复制条件:
缓冲液,DNA模板、四种脱氧核苷酸、热稳定DNA聚合酶、两种引物。
控制仪器:
PCR仪(温度周期性自动调节仪)。
【思考2】缓冲液相当细胞内的什么成分?
核液。
【活动2】阅读教材P59“PCR的反应过程”,讨论并回答下列问题:
1.(记忆)填写PCR反应流程:
2.(理解)PCR反应过程是:
在升温至90℃以上时DNA解旋;在降温至50℃左右时引物与DNA单链结合;在升温至72℃左右时合成DNA子链。
二、实验操作
活动3】阅读教材P62“实验操作”,讨论并回答下列问题:
1.(记忆)在PCR反应体系的配方中,含有的成分有缓冲液、DNA模板、四种脱氧核苷酸、热稳定DNA聚合酶、两种RNA引物、水。
2.(了解)实验操作步骤:
按照PCR反应体系配方配制反应液;将PCR反应体系50μL用微量移液器转移到微量离心管(0.5mL)中;将微量离心管放到PCR仪中;设置PCR仪的工作参数;DNA在PCR仪中大量扩增。
3.(了解)水浴法:
将微型离心管依次在95℃、55℃、72℃恒温水浴锅中循环处理。
三、操作提示
【活动4】阅读教材P62“操作提示”,讨论并回答下列问题:
1.(记忆)避免外源DNA污染,所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前高压灭菌。
2.(记忆)将缓冲液和酶分装成小份,-20℃低温保存。
3.(记忆)每添加一种反应成分,更换一个移液器枪头。
4.(记忆)混匀后离心处理,使反应液集中在离心管底部。
四、结果分析与评价
【活动4】阅读教材P63“结果分析与评价”,讨论并回答下列问题:
1.(记忆)反应液稀释:
取2?
LPCR反应液,添加98?
L蒸馏水。
2.(记忆)分光光度计调零:
将100?
L蒸馏水添加到比色杯中,在260nm处将分光光度计读数调节为零。
3.(记忆)将100?
L反应稀释液倒入比色杯中,测定在260nm处的光吸收值。
4.(记忆)DNA含量计算:
DNA含量(?
g)=50×光吸收值×稀释倍数。
【活动4】观看视频:
观看“多聚酶链式反应扩增DNA片段”视频,学会相关技术方法。
〖课后学习〗
1.尝试从植物组织中提取DNA分子。
2.基础训练册:
将基础知识整理到作业本上;完成该节训练题