1、大肠杆菌生产制备重组人胰岛素工艺1.提取目的基因 :既从人的 DNA 中提取胰岛素基因 ,可使用限制性内切酶将 目的基因从原DNA 中 分离.2.提取质粒 :使用细胞工程 ,培养大肠杆菌 ,从大肠杆菌的细胞质中提取质粒 ,质粒为环状 DNA.3.基因重组 :取出目的基因 与质粒,先利用同种限制性内切酶将质粒切开 ,再使用 DNA 连接酶 将目的基因与质粒 缝合 ,形成一个能表达出胰岛素的 DNA 质粒 .4.将质粒送回大肠杆菌 :再大肠杆菌的培养液中加入含有 Ca+ 的物质,如 CaCl2 ,这使细胞会吸收外源基因 此时将重组的质粒也放入培养液中 ,大肠杆菌便会将 重组质粒 吸收 .5.胰岛素
2、的产生 :再大肠杆菌内 ,质粒通过表达转录与翻译后 ,便产生出胰岛素蛋白质 .通过大肠杆 菌的大量繁衍 ,便可大量生产出胰岛素 !学习要求知道DNA的粗提取与鉴定的原理; 掌握并能分析 DNA粗提取的技术 方法和要求;学会 DNA分子的鉴定方法【预习指导】在课前时间通过阅读教材、同学交流和讨论,完成下列问题,并 初步巩固。一、基础知识活动 1】阅读教材 P54“基础知识”,讨论并回答下列问题:1(记忆)提取生物大分子的基本思路是利用它们的理化性质的不同进行分离。2(记忆) DNA的溶解性特点:DNA在不同浓度 NaCl 溶液中溶解度不同; DNA不溶于酒精而蛋白质溶于酒精。【思考 1】据图 5
3、1 分析:DNA在不同浓度 NaCl 溶液中溶解度有何特点?在 0.14mol/L 时溶解度最小;要使 DNA溶解,需要使用什么浓度?较高浓度,可使 DNA溶解;要使 DNA析出,又需要使用什么浓度? 0.14mol/L 可使 DNA析出。【思考 2】利用 DNA不溶于酒精的原理,可以达到将 DNA和蛋白质进一步分离目 的。3(记忆) DNA的耐受性特点:蛋白酶能分解蛋白质而不能分解 DNA;在 6080时蛋白质变性沉淀而 DNA 分子不变性。洗涤剂能与蛋白质结合瓦解细胞膜而不破坏 DNA分子。4(记忆) DNA的鉴定原理当鉴定提取出的物质是否是 DNA时,需要使用二苯胺(甲基绿)进行鉴定。
4、在沸水浴条件下,该试剂与 DNA反应,呈现(浅)蓝色。、实验设计【活动 2】阅读教材 P55“实验设计”,讨论并回答下列问题:1(记忆) 实验材料的选取:选取材料时应本着 DNA含量高、材料易得、便于 提取的原则。【思考 3】你认为教材提供的材料中哺乳动物的血液不适合提取 DNA。2(记忆) 破碎细胞,获取含 DNA的滤液:鸡血:向鸡血细胞液中加入一定量蒸馏水并玻棒搅拌,用纱布过滤后,收集 滤液。洋葱:向研钵中加入一定量洗涤剂和食盐,搅拌研磨,用纱布过滤后,收集 滤液。【思考 4】在以上实验中,蒸馏水的作用是使血细胞大量吸水而胀裂,洗涤剂的 作用是瓦解细胞膜,食盐的作用是溶解 DNA物质。3(
5、学会) 去除滤液中的杂质:方案一: 30mL滤液加 NaCl 使 DNA溶解过滤得滤液加蒸馏水使 DNA析 出过滤得过滤物放到 2mol/LNaCl 溶液中溶解 DNANaCl 溶解液方案二: 30mL滤液加嫩肉粉(木瓜蛋白酶)静置 10 分钟得 DNA滤液方案三: 30mL滤液 6067处理过滤得 DNA滤液思考 5】以上三个方案的原理分别是什么?方案一原理: DNA在不同浓度 NaCl 溶液中溶解度不同;方案二原理:蛋白酶分解蛋白质,不分解 DNA;方案三原理: DNA耐高温而蛋白质不耐高温。【思考 6】方案一中:“加 NaCl 使 DNA溶解过滤得滤液”的目的是除去不溶 (可溶、不溶)于
6、 NaCl 溶液中的细胞杂质;“加蒸馏水使 DNA析出过滤得 过滤物”的目的是除去可溶(可溶、不溶)于 NaCl 溶液中的细胞杂质。4(记忆) DNA的析出:DNA滤液与等体积冷却酒精混合, 静置一段时间后析出的白色丝状物就是 DNA。5(记忆) DNA的鉴定:取 2 支洁净的试管,编号甲、乙,各加入等量的2mol/L NaCl 溶液。甲中放入少量白色丝状物,使之溶解。在甲、乙试管中各加4mL二苯胺,混合均匀。沸水浴 5min,观察颜色变化,甲试管呈现蓝色、操作提示注意事项:1在鸡血中加入柠檬酸钠防止凝固;鸡血静置或离心后除去血浆,以提高细胞悬液浓度2实验中使用塑料烧杯和尼龙布,以免 DNA被
7、吸附。3玻棒沿同一方向缓慢搅拌(细胞破裂时快速搅拌),玻棒不要碰到烧杯壁。4二苯胺试剂要现用现配。5为提高 DNA纯度,实验中通常使用的洗涤剂有 CTAB、 SDS等。【活动 4】观看视频:观看“ DNA的粗提取与鉴定”视频,体会并学会相关技术方法。课后学习1尝试从植物组织中提取 DNA分子。2基础训练册:将基础知识整理到作业本上;完成该节训练题。学习要求尝试 PCR技术的基本操作, 体验 PCR技术的分子生物学实验方法; 理解 PCR技术 的原理;讨论 PCR技术的应用【预习指导】在课前时间通过阅读教材、同学交流和讨论,完成下列问题,并 初步巩固。一、基础知识活动 1】阅读教材 P58“PC
8、R原理”,讨论并回答下列问题:1(记忆) PCR技术扩增 DNA的过程与细胞内的 DNA复制过程类似思考 1】填写下表: (记忆) 细胞内 DNA复制条件分析条件参与的组分在 DNA分子复制中的作用模板DNA的两条单链提供复制的模板原料四种脱氧核苷酸合成 DNA子链的原料酶解旋酶打开 DNA双螺旋RNA聚合酶合成 RNA引物DNA聚合酶催化合成 DNA子链;切除引物DNA连接酶将不连续的 DNA子链连接起来能量ATP为解螺旋和合成子链提供能量引物RNA为 DNA聚合酶提供合成的 3 端起点2(理解) 细胞内 DNA的复制1)DNA的结构:脱氧核苷酸分子通过 3,5 磷酸二酯键连接形成核苷酸长链
9、,两条脱氧核苷酸长链反向平行排列并螺旋化,形成 DNA双螺旋结构。2)DNA的复制:首先,在解旋酶的作用下,由 ATP供能, DNA发生解旋形成两 条 DNA单链。其次,在 DNA单链的 3端,在 RNA聚合酶在作用下, 合成 RNA 引物。再次,在 DNA聚合酶的作用下,从引物的 3端开始合成 DNA子链。 最后, DNA聚合酶将引物切去,并合成空缺处 DNA单链,再由 DNA连接酶将不连续的 DNA子链连接起来3(记忆) DNA分子复制的人工控制解开螺旋:在 80100时, DNA双螺旋打开,形成两条 DNA单链,称为变性。恢复螺旋:在 5060左右时,两条 DNA单链重新形成双螺旋结构,
10、称为复 性。复制条件:缓冲液, DNA模板、四种脱氧核苷酸、热稳定 DNA聚合酶、两种引 物。控制仪器: PCR仪(温度周期性自动调节仪)。【思考 2】缓冲液相当细胞内的什么成分?核液。【活动 2】阅读教材 P59“PCR的反应过程”,讨论并回答下列问题:1(记忆) 填写 PCR反应流程:2(理解) PCR反应过程是:在升温至 90以上时 DNA解旋;在降温至 50左 右时引物与 DNA单链结合;在升温至 72左右时合成 DNA子链。二、实验操作活动 3】阅读教材 P62“实验操作”,讨论并回答下列问题:1(记忆) 在 PCR反应体系的配方中,含有的成分有缓冲液、 DNA模板、四种 脱氧核苷酸
11、、热稳定 DNA聚合酶、两种 RNA引物、水。2(了解) 实验操作步骤:按照 PCR反应体系配方配制反应液;将 PCR反应体 系 50L 用微量移液器转移到微量离心管 (0.5mL)中;将微量离心管放到 PCR 仪中;设置 PCR仪的工作参数; DNA在 PCR仪中大量扩增。3(了解) 水浴法:将微型离心管依次在 95、 55、72恒温水浴锅中循环 处理。三、操作提示【活动 4】阅读教材 P62“操作提示”,讨论并回答下列问题:1(记忆) 避免外源 DNA污染,所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前高压灭菌。2(记忆) 将缓冲液和酶分装成小份, 20低温保存。3(记忆) 每添加一种反应成分,更换一个
12、移液器枪头。4(记忆) 混匀后离心处理,使反应液集中在离心管底部。四、结果分析与评价【活动 4】阅读教材 P63“结果分析与评价”,讨论并回答下列问题:1(记忆) 反应液稀释:取 2?LPCR反应液,添加 98?L 蒸馏水。2(记忆) 分光光度计调零:将 100?L 蒸馏水添加到比色杯中,在 260nm处将 分光光度计读数调节为零。3(记忆) 将 100?L 反应稀释液倒入比色杯中,测定在 260nm处的光吸收值。4(记忆) DNA含量计算: DNA含量( ?g) 50光吸收值稀释倍数。【活动 4】观看视频:观看 “多聚酶链式反应扩增 DNA 片段”视频,学会相关技术 方法。课后学习1尝试从植物组织中提取 DNA分子。2基础训练册:将基础知识整理到作业本上;完成该节训练题
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