SARS病毒研究概述.docx

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SARS病毒研究概述

SARS冠状病毒研究概述

[摘要]：

本文分为两个部分，第一部分是对SARS冠状病毒在分类学、形态学以分子遗传机制进行一个总体的介绍，第二部分是针对SARS的治疗以及抗SARS病毒新药的研究思路来进行阐述的。

关键词：

SARS冠状病毒治疗新药研究思路

自2002的11月中旬以来，严重急性呼吸综合症（severeacuterespiratorysyndrome，SARS）首先出现在中国的广东省，接着在中国香港、台湾、加拿大、新加坡、美国和欧洲相继出现，以至演变为一场席卷全球的风暴。

这场风暴给整个社会带来了巨大的冲击力，同时给全球经济带来了严重的损失。

人们和SARS打起了一场看不到硝烟的战争。

在1980年，科学家用了两年的时间发现AIDS的病原是HIV，在2003年，WHO成立了一个由全球10个国家和地区13个实验室组成的合作研究网络，在两个星期后正式宣布一种以前未知的冠状病毒，为引起严重急性呼吸综合症的病原体，并命名为SARS冠状病毒。

继SARS病毒分离成功和病毒全基因组测序成功之后，科学家们对SARS的研究主要围绕以下几个方面：

用生物信息学方法对SARS冠状病毒的基因组进行诠释，SARS的诊断和SARS病毒疫苗的研制，寻找抗SARS的药物。

下面对研究情况进行概述。

1．SARS病毒概述

1.1SARS病毒的分类学地位

SARS冠状病毒（SARS-Cov），属于巢状病毒目（Order：

Nidovirales）,冠病毒科（Family：

Coronaviridae），冠状病毒属（Genus：

Coronavirus）。

根据其基因组结构分类，它属于单链正义RNA病毒，病毒基因组约为30Kb，是所有RNA病毒中最大的基因组。

在SARS病毒以前，人类共发现了大约15种不同的冠状病毒。

这些已知的冠状病毒，根据血清学证据和种属发生学规律，分为3个Group。

其中Group1来自牛等动物，Group2包括猪、老鼠等哺乳动物冠状病毒，Group3仅有鸟感染性支气管炎病毒（Avianinfectiousbronchitisvirus,IBV）。

2003年5月，《TheGenomeSequenceoftheSARS-AssociatedCoronvirus》和《CharacterizationofaNovelCoronavirusAssociatedwithSevereAcuteRespiratory》发表在《Science》上，两篇文章的共同点都是通过对SARS冠状病毒的全基因组的完整测序，来对SARS病毒的基因组注释。

文章的作者都认为它的基因组结构和其他3个种群的冠状病毒有一定相关性，但是，通过比较遗传史和序列比对表明SARS－cov的特征和已知的三类冠状病毒的特征并不完全相似，包括两种人类病毒HCoV-OC43和HCoV-229E在内的几种冠状病毒中的任何一种，它不仅表现有其他冠状病毒共有的特征，还有SARS－CoV本身特有的特征，因此认为新病毒构成了冠状病毒的第4个株系（第4组），是一种新的冠状病毒，从而形成一个独特的group（Paul&Marco,2003）。

同样，发表在NewEnglandMedicine的两篇文章也支持了这个观点，在已知的基因片段中，它和已知的冠状病毒核酸水平的同源性不超过50％，而氨基酸水平的同源性在75％左右；在进化树的分析中，与已知的冠状病毒的距离很远（Drosten&Ksiazek,2003），因此认为这是一个全新的冠状病毒。

下图为SARS冠状病毒与其他冠状病毒的种系进化关系图：

图1：

种系发生关系图（fromMicrobiology&Immunology）

1.2SARS冠状病毒的形态与结构

病人样本和培养细胞上清的负染透射电镜扫描显示了多晶体的、密封的冠状病毒颗粒，其直径在60-130nm之间。

大部分但并非所有的病毒颗粒显示出这种特征性表面喷射状，酷似中世纪欧洲帝王王冠（crown）的结构，由此而产生了该病毒的名字，正是其“名字”Coronavirus的来源（corona在拉丁语中=冠状）。

下面是冠状病毒的结构图。

图2：

冠状病毒结构图（fromKathrynV.,Holmes,2003）

如上图所示，已知的冠状病毒粒子的包膜上主要有三种糖蛋白：

S蛋白、E蛋白和M蛋白。

纤突为Ｓ蛋白（Spikeprotein）,呈“棒棒糖”状的膜蛋白，由两个domain组成，靠近N端的部分形成一个球状的domain，靠近C端的部分形成一个穿膜的棒状结构。

对已知的冠状病毒的研究已经证明，Spikeprotein和冠状病毒侵入细胞的过程密切相关。

M蛋白（Membraneprotein）是一种跨膜糖蛋白,其大部分位于包膜内,仅有糖基化的小部分暴露在双层脂质外面,在病毒的包膜形成与出芽（budding）过程中起重要作用。

E蛋白（Envelopeprotein）是一种相对较小的蛋白，散布在包膜上。

部分的冠状病毒有HE蛋白（Haemagglutinin－esterase），但是SARS冠状病毒是没有HE蛋白的。

N蛋白（Nucleocapsidphosphoprotein）是冠状病毒中一种重要的结构蛋白，它与病毒的正股RNA紧密结合,构成病毒的核心,核心呈螺旋式结构。

它含有其它冠状病毒N蛋白中不存在的核转移的信号序列，研究推测SARS病毒在侵入宿主细胞以后是通过这个核转移信号序列进入到细胞核中，并与宿主DNA发挥其生物学作用（Marcoetal，2003）。

下面分别是用VeroE6分离出来的SARS冠状病毒的电鏡照片和它的模式图。

图3：

SARS病毒电鏡照片（fromThomasetal，2003）图4：

模式图（fromOxfordetal，2003）

1.3SARS冠状病毒的分子遗传机制

冠状病毒的宿主只限于脊椎动物，包括哺乳动物和鸟类，它与人类和家禽的一系列疾病相关，包括呼吸道、胃肠道、中枢神经系统和肝方面的疾病。

然而，动物的冠状病毒可能在动物引起严重的疾病，例如鸟传染性支气管炎病毒（IBV），鼠肝炎病毒（MHV），猪传染性胃肠炎病毒（porcinetransmissiblegastroenteritisvirus）等等（Luis，2001），人冠状病毒以前只与轻度疾病相关。

在第1组（HcoV-229E）和第2组（HcoV-OC43）中都能找到人冠状病毒（HCoVs），它是轻度的呼吸疾病的一个主要原因（Makela，1998）。

它们能偶尔地引起小孩和成人的严重下呼吸道感染及新生儿坏死性小肠结肠炎，SARS冠状病毒似乎是能够引起人类严重疾病的第一个冠状病毒。

冠状病毒是在宿主细胞的细胞质中进行复制的。

正股单链RNA基因组的5'端有帽子结构，3'端有PolyA尾巴，具有mRNA的功能和传染性。

感染宿主细胞后，其基因组RNA既可作为mRNA翻译出病毒特异性蛋白质，又可作为模板转录互补的负链RNA。

首先，病毒基因组5'端的开放读码框会翻译成一条多肽链，然后被病毒编码的蛋白酶切割为几条非结构蛋白，包括RNA-dependentRNApolymerase（Rep）和ATPasehelicase（Hel），通过这些蛋白来完成病毒基因组的复制、亚基因组mRNA的合成。

接着，合成的负链作为模板转录出具有mRNA功能的基因组RNA，同时也可作为其他几种大小不同的亚基因组的模板。

这些亚基因组mRNA可以指导合成不同的结构蛋白和非结构多肽。

冠状病毒合成亚基因组mRNA的一个突出的特点是非连续性，从而省略了转录后的修饰剪切过程，这种基因定位的机制到现在还没有完全搞清楚，然而，最近的一些证据表明在它是通过识别基因组5'端的转录调节信号（transcriptionregulationsignal，TRS），来指导这种非连续性的亚基因组mRNA的合成的（Marco，2003）。

TRS除了在SARS冠状病毒基因组的开头出现一次之外，在基因组的其他位置还出现了六次。

根据TRS的背景，再结合计算机分析，计算出SARS冠状病毒粒子将会出现8.3,4.5,3.4,2.5,2.0和1.7kb的mRNA，在对SARS冠状病毒RNA进行Northern杂交实验中，Paul等用3˙端非翻译区作为探针，分别检测到了8.3kb（对应S蛋白）,1.7kb（N蛋白），4.5kb（包括x1，x2和E蛋白），3.4kb（M蛋白和x3）,2.5（x4和x5），实实在在说明了SARS冠状病毒中S、N、E和M等结构蛋白的存在（Paul，2003）。

结构蛋白和基因组RNA复制完成之后，将在宿主细胞内质网处装配，形成新的冠状病毒颗粒，并通过高尔基体分泌至细胞外，完成其生命周期。

下图为冠状病毒细胞内复制模式图：

图5：

冠状病毒细胞内复制模式图（fromMicrobiology&Immunology）

1.4SARS冠状病毒基因组测序和分析

从香港大学微生物系实验室在世界上第1个报道了SARS可能是由一种新型的冠状病毒所致，至今为止，全世界完成全基因组测序并提交到Genebank的病毒株已达到11株（分别为：

BJ01、CUHK-W1、CUHK-Su10、HKU-39849、Tor2、Urbani、SIN系列5条）。

5月1日至2日，加拿大、美国和中国三个研究组分别发表了各自完成测序的病毒株的基因组分析论文（Paul,Marco&QIN,2003）。

比较美国（CDC,USA）和加拿大（BCCAGenomeCentre）已经公开的病毒全基因组序列，发现有很小的差异。

美国Urbani株长度为29，727nt，其5ˊ端多出一段TTATTAGGTTTTTAC（15nt）；加拿大Tor株长度为29，736nt，通过计算机预测，有14个Orf，其3ˊ端多出24个A，中国BJ01病毒株长度为29，725nt。

相对于Urbani株，加拿大Tor株其他位置的差别依次为：

7919（T→C），16622（T→G），19064（G→A），19183（C→T），20596（A→G），20910（G→T），23220（T→G），24872（C→T），26857（C→T）。

SARS病毒基因组与其他冠状病毒的基因组结构相似，基因组的前三分之二中有2个开放阅读框（ORF）1a和1b，编码RNA聚合酶，ORF1b的下游是一些编码结构和几种非结构蛋白的基因。

以Urbani株为例，它的基因组序列，包含了除RNA聚合酶（Rep）以外的编码信息，自5端到3端共有10个开放性阅读框（如图），其中E和X2有交叉重叠，其余ORF之间由内含子隔开，S、E、M、NORF为病毒结构蛋白编码基因，分别对应S蛋白（Spikeprotein），E蛋白（Envelopeprotein），M蛋白（Membraneprotein），N蛋白（Nucleocapsidphosphoprotein），其余为非结构蛋白编码基因。

图6：

SARS冠状病毒urbani株基因组结构图（fromPauletal，2003）

通过和其他冠状病毒的S蛋白、E蛋白的序列比较，SARS冠状病毒和其他冠状病毒蛋白之间的相似性都不高，通过冠状病毒之间的蛋白进行种系发育分析，SARS病毒的蛋白都处于一个独立的分支上。

可以看出，SARS病毒明显不同于同其他三个冠状病毒群，可能归属于新的冠状病毒群。

SARS冠状病毒蛋白与其他类冠状病毒的蛋白的相似性如下表：

图7：

冠状病毒蛋白同源性比较（fromPauletal，2003）

对SARS冠状病毒基因组测序所得到的数据，都支持了这样一个观点：

SARS病毒并没有和其他的病毒（包括已知的三种冠状病毒）发生过重组或交换事件，据此我们可以推测SARS冠状病毒原来寄生于某一种动物上，通过突变而获得了侵染人类致病的能力，也有可能SARS病毒是从原来一种对人无害的人冠状病毒进化而来。

但是最初的实验证明了没有接触过SARS冠状病毒的人血清里面不含针对它的抗体，这个暗示在人体里没有一种与SARS冠状病毒很相近的但是没有致病性的病毒。

要阐明SARS病毒的来源和动物宿主还必须通过进一步的调查、实验和数据分析来获得（Marco，2003）。

而在中国研究组发表的病毒基因组分析论文中，除了对BJ01这病毒株进行注释外，还将其与加拿大、美国和香港科学家完成的4株冠状病毒全基因组测序进行了对比分析。

在同其他四株已测定病毒的比较中发现，SARS病毒的S蛋白质（Spikeprotein）和M蛋白质（membraneprotein）具有极强的变异性，在5株病毒中，S蛋白质和M蛋白质的变异点位达到31个，其中有9个点位的变异都能在2株或3株病毒的基因组序列中获得印证。

这说明SARS病毒具有极强的变异能力，意味着研究SARS疫苗可能会同研究流感疫苗一样困难重重。

2．SARS病毒引起的非典型性肺炎的治疗方案

目前SARS还缺乏特效的治疗，目前的治疗包括抗病毒治疗如利巴伟林（病毒唑），奥司他伟，血清疗法等；用激素降低免疫系统对肺的损伤；用抗生素治疗潜在的细菌感染；辨证的中西医结合治疗；呼吸机的应用以及应激和ARDS（Acuterespiratorydistresssyndrome）的对症支持治疗等。

我国钟南山院士提出四条有效的临床治疗经验：

（1）在起病初期病人出现类似流感症状时，用中西医结合方法，清热解毒治疗有效；

（2）肺纹理或病理改变酷似纤维化病程时，及时使用大剂量的糖皮质激素；（3）病人出现缺氧，呼吸困难时，及早使用无创通气；（4）对中后期严重免疫功能低下者，关注患者的继发感染。

利巴伟林是一种嘌呤类似物，结构上和鸟嘌呤相似，能够拮抗多种RNA病毒。

血清疗法是病人经过静脉输入康复者的血清。

香港中文大学内科及药物治疗系主任沈祖尧说，SARS病人如果在发病两个星期内使用血清，病人的住院时间和发烧期会较短，死亡率会较低。

广州中山大学附属第三医院从2003年2月2日开始，对21例SARS患者进行了血清中IgM和IgG浓度的跟踪调查，历时三个月，他们发现：

患者发病一周内两种抗体均未产生，10～14天，IgM开始出现并很快达到高峰，60天时，约有1/3的患者可以检测到IgM，90天时基本消失，IgG抗体也在10～14天开始出现，60天达高峰，90天仍持续高水平，从这可以推断SARS的保护性抗体很有可能是IgG，这为康复病人的血清可以治疗重症病人提供了依据（李黔等，2003）。

3．开发抗SARS新药的研究思路和方法

SARS病毒基因序列的明确对确定SARS病原，分析病毒转播和发病机理具有重要意义，同时为后续的开发诊断试剂、疫苗和预防治疗药物研究提供了很多便利。

现在德国的BernhardNocht研究中心开发了世界首个非典型性肺炎的病原体/冠状病毒的定量检测试剂盒。

该试剂盒利用RT-PCR反应来对这种新型的冠状病毒基因组的一段80bp的区段进行扩增并定量检测。

在国内，清华大学生物芯片国家工程研究中心与国家疾病预防控制中心已经研制出SARS快速早诊基因芯片，并用于临床样本检测获得成功。

中山大学生物技术研究所以RT-PCR技术为基础，研制出早期快速诊断的检验试剂盒。

在筛选抗SARS冠状病毒的药物方面，虽然到现在还缺乏特效药，但是从事这方面研究的科学家提出了很多重要的观点。

美国科罗拉多大学微生物学教授KathrynV．Holmes博士是研究冠状病毒的顶尖人物，他指出，SARS冠状病毒本身有一些潜在的理想靶点可以用来设计药物。

例如，针对RNA聚合酶的抑制剂可以用来抑制SARS冠状病毒的复制。

还有，S蛋白在宿主识别、抗体产生、介导细胞毒等密切相关，它的基因突变会影响病毒的毒力和宿主的选择（Thomas，2001），所以，针对S蛋白的抗体将会阻断SARS病毒和宿主细胞的融合，可能有效的防止SARS病毒的感染（Kathryn，2003）。

从上面所述的病毒的复制及其阻断的机理入手研究防治药物,上海生命科学研究院的研究人员成功克隆了SARS病毒中的S、M、N、E及RNA聚合酶、（3CL）蛋白水解酶等6种主要蛋白基因，并在病毒重要蛋白质基因的表达、分离、纯化实验中，获得了SARS病毒中E蛋白、N蛋白和（3CL）蛋白水解酶等三种蛋白的表达样品（SHENXu，etal，2003），结果显示基因工程表达S蛋白可以与特异性抗体结合，6个主要蛋白基因表达样品已进行药物虚拟筛选。

与此同时，德国Lübeck大学生物化学研究所Anand研究小组，在自己以往对冠状病毒蛋白质结构研究基础之上，获得了TGEV冠状病毒主要蛋白酶3CL蛋白水解酶的样品，同时根据氨基酸序列同源性，发表了蛋白酶的三级结构，并对于该蛋白的高级结构特征和已知的蛋白酶化学抑制剂的结合特征进行了详尽的分析，给出了一种可能作为药物筛选先导物（leader）的重要抑制剂-AG7088。

由于TGEV冠状病毒的3CL蛋白水解酶和SARS冠状病毒的3CL蛋白水解酶具有较高的同源性，同时通过计算机预测，它们的三维结构也相似，所以该工作为抗SARS药物设计和筛选，提供了重要的结构依据（Kanchan，etal，2003）。

接种疫苗是人类对付传染病的有力武器。

自从200年前牛痘疫苗消灭了天花之后，疫苗就成了人类对付众多传染病的终极法宝。

对某些冠状病毒的预防来说，疫苗也是一条可行的道路。

目前疫苗总共可分为六大类，即灭活疫苗、减毒活疫苗、DNA疫苗、抗体文库、马血清和利用腺病毒载体构建的疫苗。

例如通过接种减弱毒力的活病毒粒子（Avianinfectiousbronchitisvirus,IBV和Porcineepidemicdiarrheavirus）来预防禽类和猪由于冠状病毒引起的疾病。

然而，用灭活的SARS冠状病毒作为免疫原对于人来说有潜在的危险，而且，灭活菌体疫苗需要通过体外培养大量病毒，SARS病毒的致病性如此强大，不能有任何泄露，只有在万无一失的前提下才能大量生产，否则将对生产工人和环境造成无法挽救的损失，第三，有些疫苗有时反而会加重病情，例如，当接种了猫冠状病毒的疫苗的动物接触到野生型的病毒粒子时，由于机体过度的免疫反应，病情相比更为严重（Kathryn，2003）。

我国防治非典型肺炎指挥部科技攻关组已于4月底组织国内一些科研和生产单位正式启动了非典疫苗的研制工作，集中力量研制“灭活疫苗”。

疫苗的安全性已被初步证明，下一步科研人员可以进行大规模动物实验，研制工作进度将大大加快。

如果在免疫病理研究等方面不出意外的话，我国有望于今年10月底前批准“灭活疫苗”进入临床研究阶段。

此外，生物制药公司GenVec公司从另外一个途径来开发抗SARS病毒的疫苗，该公司与美国国立卫生研究院（NIH）合作，用腺病毒载体技术开发SARS疫苗。

GenVec的腺病毒载体技术的原理是将腺病毒的有毒物质去除，留下病毒的外壳作为遗传物质的载体，将SARS冠状病毒特定的DNA序列重组到腺病毒中，这些DNA编码一定的蛋白，进入人体细胞后便会表达特定蛋白。

这些蛋白则会触发人体的自然免疫反应达到对抗外来入侵物质的目的。

通过采用基因工程方法研制非典防治药物，表达SARS病毒主要抗原蛋白，发展阻断病毒和细胞的结合或病毒自身的复制的防治制剂，或利用传统疫苗使生物体内形成免疫能力，这些方法是在SARS防治领域中研究的两大方向。

除此以外，国内外已有研究机构将RNA干扰技术用于SARS治疗的攻关研究。

RNA干扰（RNAinterference）是一种由双链RNA诱发的基因沉默（genesilencing）。

在此过程中，与双链RNA有同源序列的信使RNA（mRNA）被降解，从而抑制了该基因的表达。

RNA干扰是存在于许多生物（包括植物和人）体内的一种自身防御机制，同时也可能是一种内源性基因表达的调控机制。

通过RNA干扰抑制基因表达具有高特异性和高效率。

尽管RNA干扰的详细机制尚不清楚，大量的体外实验研究资料已经显现出该技术在基因功能研究中的应用前景和新药开发中的巨大潜力，但是，RNA干扰技术用于治疗人类疾病的安全性仍是个未知数。

中国科学院生物化学细胞所的抗SARS反义核酸药物和核糖核酸干扰药物研究已全面启动，其中，由金由辛教授领导的科研小组具体从事核酸研究，他们准备利用两种途径研究两种药物。

其中一种是反义寡脱氧核苷酸药物，这也是美国AVI公司宣布要做的抗病毒药物。

此类药物可在转移核糖核酸水平阻断蛋白质的生物合成，从而抑制病毒的生长。

另一种是核糖核酸干扰药物研究。

他们首先对所知道的约3万个核苷酸长度的SARS冠状病毒基因组核糖核酸，以及编码主要蛋白的信使核糖核酸的结构进行了计算机模拟，同时检查人类基因是否含有这些靶点，如果有，就会对人类造成伤害，目前，他们已经通过检索，证明在人类基因组中不含有这些靶点。

从4月27日开始，他们开始在细胞水平上进行实验，对这两类药物进行检查，看是否能抑制SARSＳ病毒中重要基因的表达。

因为SARS病毒在细胞中生长，他们将在细胞中加入药物进行实验，希望从中筛选出有效靶点，同时与其他单位协作，进行抑制病毒生长的试验，最终目的是将它们制成喷雾剂，直接喷入SARS病人气管以杀死病毒。

4.问题与展望

在6月中旬，WHO宣布中国北京为SARS非疫区，这说明我们在这一场战役中打了胜仗，基本控制了SARS疫情。

但是应该认识到，人类与传染病的斗争始终贯穿于整个人类发展史，如在与血吸虫病、结核病和霍乱等疾病的斗争中，人类每次都是在付出巨大代价后取得了最终的胜利。

SARS病毒是一种新的冠状病毒，其毒力远远强于其它已知的家族成员，SARS是否会卷土重来，这是一个难以预料的问题。

对于它的来源、入侵、复制、传播以及它引起机体损伤中的许多问题还等待我们进一步去探索认知。

通过揭示其病源学途径，研制出有效的疫苗和特异性药物，并依靠有效的疫病公共防治体系惠及整个社会，疫病才不致于重新危害人类，而且，对SARS冠状病毒的研究必将给我们以后面对新的冠状病毒时带来新的研究和防治的策略。

参考文献：

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