蛋白质测定方法.docx

资源描述

蛋白质测定方法.docx

《蛋白质测定方法.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《蛋白质测定方法.docx（18页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

蛋白质测定方法.docx

蛋白质测定方法

蛋白质的定量测定——微量凯氏定氮法（microKjeldahlmethod）

生物材料的含氮量测定在生物化学研究中具有一定的意义，如蛋白质的含氮量约为16％，测出含氮量则可推知蛋白含量。

生物材料总氮量的测定，通常采用微量凯氏定氮法。

凯氏定氮法由于具有测定准确度高，可测定各种不同形态样品等两大优点，因而被公认为是测定食品、饲料、种子、生物制品、药品中蛋白质含量的标准分析方法.

实验原理

生物材料的含氮量测定在生物化学研究中具有一定的意义，如蛋白质的含氮量约为16％，测出含氮量则可推知蛋白含量。

生物材料总氮量的测定，通常采用微量凯氏定氮法。

凯氏定氮法由于具有测定准确度高，可测定各种不同形态样品等两大优点，因而被公认为是测定食品、饲料、种子、生物制品、药品中蛋白质含量的标准分析方法。

其原理如下：

1.消化：

有机物与浓硫酸供热，使有机氮全部转化为无机氮——硫酸铵。

为加快反应，添加硫酸铜和硫酸钾的混合物；前者为催化剂，后者可提高硫酸沸点。

这一步约需30min至1h，视样品的性质而定。

2.加碱蒸馏：

硫酸铵与NaOH（浓）作用生成（NH4）OH,加热后生成NH3,通过蒸馏导入过量酸中和生成NH4Cl而被吸收。

3.滴定：

用过量标准HCl吸收NH3，剩余的酸可用标准NaOH滴定，由所用HCl摩尔数减去滴定耗去的NaOH摩尔数，即为被吸收的NH3摩尔数。

此法为回滴法，采用甲基红卫指示剂。

HCl＋NaOHNaCl+H2O

本法适用于0.2~2.0mg的氮量测定。

1.热源2.烧瓶3.玻璃管4.橡皮管5．玻璃杯6.棒状玻塞7.反应室8.反应室外壳9.夹子10.反应室中插管11.冷凝管12.锥形瓶13.石棉网

微量凯氏蒸馏装置示意图

试剂和器材

一、试剂

浓硫酸；30％过氧化氢溶液；10M氢氧化钠；0.01M的标准盐酸；标准硫酸铵（0.3mg氮/mL）

催化剂：

硫酸铜：

硫酸钾＝1：

4混合，研细。

指示剂：

0.1％甲基红乙醇溶液。

二、测试样品

牛血清白蛋白。

三、器材

微量凯氏定氮仪；移液管1mL（×3）；2mL（×1）；微量滴定管5mL（×1）;烧杯200mL（×2）；量筒10mL（×1）；三角烧瓶150mL（×4）；凯氏烧瓶50mL（×4），吸耳球（×1）；电炉；分析天平。

操作方法

一、样品处理

称取牛血清白蛋白50mg，加入2个凯氏烧瓶中，另2个凯氏烧瓶为空白对照，不加样品。

分别在每个凯氏烧瓶中加入约500mg硫酸钾－硫酸铜混合物，再加5mL浓硫酸。

二、消化

将以上4个凯氏烧瓶置于通风橱中电炉上加热。

在消化开始时应控制火力，不要使液体冲到瓶颈。

待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分解并放出SO2白烟后，适当加强火力，继续消化,使瓶内液体微微沸腾，大约维持2~3h。

待消化液变成褐色后，为了加速完成消化，可将烧瓶取下，稍冷，将30％过氧化氢溶液1~2滴加到烧瓶底部消化液中，再继续消化，直到消化液由淡黄色变成透明淡蓝绿色，消化即告完成。

冷却后将瓶中的消化液倒入50mL容量瓶中，并以蒸馏水洗涤烧瓶数次，将洗液并入容量瓶中，定容备用。

三、蒸馏

1.蒸馏器的洗涤

蒸气发生器中盛有加有数滴H2SO4的蒸馏水和数粒沸石。

加热后，产生的蒸汽经贮液管、反应室至冷凝管，冷凝液体流入接受瓶。

每次使用前，需用蒸汽洗涤10分钟左右（此时可用一小烧杯承接冷凝水）。

将一只盛有5mL2％硼酸液和1~2滴指示剂的锥形瓶置于冷凝管下端，使冷凝管管口插入液体中，继续蒸馏1~2分钟，如硼酸液颜色不变，表明仪器已洗净。

2.消化样品及空白的蒸馏

取50mL锥形瓶数个，各加25mL0.01M标准HCl和1~2滴指示剂，用表面皿覆盖备用。

取2mL稀释消化液，由小漏斗加入反应室。

将一个装有0.01M标准HCl和指示剂的锥形瓶放在冷凝管下，使冷凝器管口下端浸没在液体内。

用小量筒量取5mL10MNaOH溶液，倒入小漏斗，让NaOH溶液缓慢流入反应室。

尚未完全尽时，加紧夹子，向小漏斗加入约5mL蒸馏水，同样缓缓放入反应室，并留少量水在漏斗内作水封。

加热水蒸气发生器，沸腾后，关闭收集器活塞。

使蒸汽冲入蒸馏瓶内，反应生成的NH3逸出被吸收。

待氨已蒸馏完全，移动锥形瓶使液面离开冷凝管口约1cm，并用少量蒸馏水冷凝管口。

取下锥形瓶，以0.01MNaOH标准溶液滴定。

记下所耗去的体积。

3.蒸馏后蒸馏器的洗涤

蒸馏完毕后，移取热源，夹紧蒸汽发生器和收集器间的橡皮管，此时由于收集器温度突然下降，即可将反应室残液吸至收集器。

∙标准样品的测定

在蒸馏样品及空白前，为了练习蒸馏和滴定操作，可用标准硫酸铵试做实验2~3次。

标准硫酸铵的含氮量是0.3mg/mL，每次实验取2.0mL。

四、计算

样品的含氮量（mg/mL）=

若测定的蛋白质含氮部分只是蛋白质（如血清），则：

样品中蛋白质含量（mg/mL）＝

式中：

A为滴定空白用去的NaOH平均mL数，B为滴定样品用去的NaOH平均mL数，V为样品的mL数，0.01NaOH的摩尔浓度，14为氮的原子量，6.25为系数（蛋白质的平均含氮量为16％，由凯氏定氮法测出含氮量，再乘以系数6.25即为蛋白质量），N为样品的稀释倍数。

注意事项

（1）必须仔细检查凯氏定氮仪的各个连接处，保证不漏气。

（2）凯氏定氮仪必须事先反复清洗，保证洁净。

（3）小心加样，切勿使样品沾污口部、颈部。

（4）消化时，须斜放凯氏烧瓶（45o左右）。

火力先小后大，避免黑色消化物溅到瓶口、瓶颈壁上。

（5）蒸馏时，小心加入消化液。

加样时最好将火力拧小或撤去。

蒸馏时，切记火力不稳，否则将发生倒吸现象。

（6）蒸馏后应及时清洗定氮仪。

植物体内可溶性蛋白质含量的测定（考马斯亮蓝法）

考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。

考马斯亮蓝G-250在游离态下呈红色，当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465nm，后者在595nm。

在一定蛋白质浓度范围内（0～100μg/ml），蛋白质－色素结合物在595nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比。

植物体内的可溶性蛋白质大多数是参与各种代谢的酶类，测其含量是了解植物体总代谢的一个重要指标。

在研究每一种酶的作用时，常以比活（酶活力单位／mg蛋白）表示酶活力大小及酶制剂纯度。

因此，测定植物体内可溶性蛋白质是研究酶活的一个重要项目。

常用测定方法有Lowry法和考马斯亮蓝G-250染料结合法。

本实验将分别介绍这两种方法。

【原理】

考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。

考马斯亮蓝G-250在游离态下呈红色，当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465nm，后者在595nm。

在一定蛋白质浓度范围内（0～100μg/ml），蛋白质－色素结合物在595nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比。

故可用于蛋白质的定量测定。

蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1h内保持稳定。

该反应非常灵敏，可测微克级蛋白质含量，所以是一种比较好的蛋白质定量法。

【仪器与用具】

分光光度计，10ml量筒1支；研体；10ml容量瓶1支；1ml刻度吸管3支；10ml具塞刻度试管14支。

【试剂】

（1）牛血清白蛋白配成1000μg/ml和100μg/ml；

（2）考马斯亮蓝G-250：

称取100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml90%乙醇中，加入85%（W/V）磷酸100ml，最后用蒸馏水定容至1000ml。

此溶液在常温下可放置一个月；

（3）90%乙醇；（4）磷酸（85%，W/V）。

【方法】

1.标准曲线的绘制

（1）0～100μg/ml标准曲线的制作取6支试管，按表28-1数据配制0～100μg/ml血清白蛋白液各1ml。

准确吸取所配各管溶液0.1ml，分别放入10ml具塞试管中，加入5ml考马斯亮蓝G-250试剂，盖塞，反转混合数次，放置2min后，在595nm下比色，绘制标准曲线。

表28-1配制0～100μg/ml血清白蛋白液

管号

100μg/ml牛血清蛋白量（ml）

蒸馏水量（ml）

蛋白质含量（mg）

1.0

0.2

0.8

0.02

0.4

0.6

0.04

0.6

0.4

0.06

0.8

0.2

0.08

1.0

0.10

（2）0～1000μg/ml标准曲线的制作另取6支试管，按表28-2数据配制0～1000μg/ml牛血清白蛋白溶液各1ml。

与步骤

（1）操作相同，绘出0～1000μg/ml的标准曲线。

表28-2配制0～1000μg/ml血清蛋白血液

管号

1000μg/ml牛血清白蛋白（ml）

蒸馏水量（ml）

蛋白质含量（mg）

1.0

0.2

0.8

0.2

0.4

0.6

0.4

0.6

0.4

0.6

0.8

0.2

0.8

1.0

2.样品提取液中蛋白质浓度的测定吸取样品提取液0.1ml（样品提取见各酶活测定），放入具塞刻度试管中（设两个重复管），加入5ml考马斯亮蓝G-250试剂，充分混合，放置2min后在595nm下比色，记录吸光度值，通过标准曲线查得蛋白质含量。

3.结果计算

样品蛋白质含量（mg/g鲜重）=

式中C－查标准曲线所得每管蛋白质含量（mg）；

V－提取液总体积（ml）；

a－测定所取提取液体积（ml）；

W－取样量（g）。

蛋白质含量的测定——考马斯亮蓝（CoomassieBrilliantBlue）染色法

考马斯亮蓝（CoomassieBrilliantBlue）法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。

这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。

这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。

实验原理

考马斯亮蓝（CoomassieBrilliantBlue）法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。

这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。

这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。

考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰（lmax）的位置，由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。

通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。

研究发现，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。

考马斯亮蓝染色法的突出优点是：

（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。

这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。

（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。

完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。

由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。

因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。

（3）干扰物质少。

如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。

此法的缺点是：

（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考马斯亮蓝染色法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。

（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：

去污剂、TritonX-100、十二烷基硫酸钠（SDS）等。

试剂与器材

一、试剂

考马斯亮蓝试剂：

考马斯亮蓝G―250100mg溶于50mL95%乙醇中，加入100mL85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000mL。

二、标准和待测蛋白质溶液

1．标准蛋白质溶液：

结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度用0.15mol/LNaCl配制成1mg/mL蛋白溶液。

2．待测蛋白质溶液：

人血清，使用前用0.15mol/LNaCl稀释200倍。

三、器材

试管1.5×15cm（×6），试管架，移液管管0.5mL（×2）；1mL（×2）；5mL（×1）；恒温水浴；分光光度计。

操作方法

一、制作标准曲线

取7支试管，按下表平行操作。

试管编号

标准蛋白溶液（mL）

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

0.15mol/LNaCl（mL）

0.1

0.09

0.08

0.07

0.06

0.05

0.04

考马斯亮蓝试剂（mL）

5mL

摇匀，1h内以0号管为空白对照，在595nm处比色:

A595nm

绘制标准曲线：

以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。

二、未知样品蛋白质浓度测定

测定方法同上，取合适的未知样品体积，使其测定值在标准曲线的直线范围内。

根据所测定的A595nm值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度（mg/mL）。

注意事项

∙在试剂加入后的5－20min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。

∙测定中，蛋白－染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。

蛋白质的定量测定——紫外（UV）吸收测定法

蛋白质分子中所含酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质在280nm波长处有最大吸收值。

在一定浓度范围内，蛋白质溶液的光吸收值（A280）与其含量成正比关系，可用作定量测定。

紫外线吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速，简便，不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。

因此，广泛应用在柱层析分离中蛋白质洗脱情况的检测。

实验原理

蛋白质分子中所含酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质在280nm波长处有最大吸收值。

在一定浓度范围内，蛋白质溶液的光吸收值（A280）与其含量成正比关系，可用作定量测定。

紫外线吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速，简便，不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。

因此，广泛应用在柱层析分离中蛋白质洗脱情况的检测。

此法的缺点是：

（1）对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差；

（2）若样品中核酸等吸收紫外线的物质，会出现较大的干扰。

不同的蛋白质和核酸的紫外线吸收是不同的，即使经过校正，测定结果也还存在一定的误差。

但是可作为初步定量的依据。

该法可测定蛋白范围应在0.1~1.0mg/mL。

试剂和器材

一、标准和待测蛋白质溶液

1.标准蛋白溶液

结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度配制成1mg/mL蛋白溶液。

2.待测蛋白质溶液：

人血清，使用前稀释100倍。

二、器材

试管1.5×15cm（×9），试管架，移液管1mL（×3）；2mL（×2）；5mL（×2）；分光光度计。

操作方法

一、制作标准曲线

取8支试管编号，按下表分别向每支试管加入各种试剂，摇匀。

选用光程为1cm的石英比色杯，在280nm波长处分别测定各管溶液的A280值。

以A280值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。

标准蛋白质溶液（mL）

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

4.0

蒸馏水（mL）

4.0

3.5

3.0

2.5

2.0

1.5

1.0

蛋白质浓度（mg/mL）

0.125

0.250

0.375

0.500

0.625

0.750

1.00

A280

二、样品测定

取待测蛋白质溶液1mL，加入蒸馏水3mL，摇匀，按上述方法在280nm波长处测定光吸收值，并从标准曲线上查出待测蛋白质的浓度。

注意事项

由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，显色的深浅往往随不同的蛋白质而变化。

因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度（相对于标准蛋白质）。

此外蛋白溶液中存在核酸或核苷酸时也会影响紫外吸收法测定蛋白质含量的准确性。

蛋白质的定量测定——福林酚法（Folin—酚试剂法）

Folin—酚试剂法最早是由Lowry确定的测定蛋白质浓度的基本方法。

以后在生物化学领域得到广泛的应用。

此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin—酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。

Folin—酚试剂由甲试剂和乙试剂组成。

甲试剂由碳酸钠，氢氧化钠，硫酸铜及酒石酸钾钠组成。

实验原理

Folin—酚试剂法最早是由Lowry确定的测定蛋白质浓度的基本方法。

以后在生物化学领域得到广泛的应用。

此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin—酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。

这个方法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时较长，要严格控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。

凡干扰双缩脲反应的基团，如CO-NH2,-CH2-NH2,CS-NH2以及Tris缓冲液、蔗糖、硫酸铵、巯基化合物均可干扰Folin—酚反应，而且对后者的影响还要大得多。

此外，酚类、柠檬酸对此反应也有干扰作用。

Folin—酚试剂由甲试剂和乙试剂组成。

甲试剂由碳酸钠，氢氧化钠，硫酸铜及酒石酸钾钠组成。

蛋白质中的肽键在碱性条件下，与酒石酸钾钠铜盐溶液起作用，生成紫红色络合物。

乙试剂是由磷钼酸和磷钨酸、硫酸、溴等组成。

此试剂在碱性条件下，易被蛋白质中酪氨酸的酚基还原呈蓝色反应，其色泽深浅与蛋白质含量成正比。

此法也适用于测定酪氨酸和色氨酸的含量。

本法可测定范围是25—250μg蛋白质。

试剂和器材

一、试剂

Folin—酚试剂:

试剂甲：

4%碳酸钠溶液；0.2mol/L氢氧化钠溶液；1%硫酸铜溶液；2%酒石酸钾钠溶液。

临用前将

（1）与

（2）等体积配制碳酸钠—氢氧化钠溶液。

（3）与（4）等体积配制成硫酸铜—酒石酸钾钠溶液。

然后这两种试剂按50:

1的比例配合，即成Folin—酚试剂甲。

此试剂临用前配制，一天内有效。

试剂乙：

称钨酸钠（Na2WO2?

2H2O）100g，钼酸钠（Na2MoO4?

2H2O）25g置2000mL磨口回流装置内，加蒸馏水700mL，85%磷酸50mL和浓硫酸100mL。

充分混匀，使其溶解。

小火加热，回流10h（烧瓶内加小玻璃珠数颗，以防溶液溢出），再加入硫酸锂（LiSO4）150g，蒸馏水50mL及液溴数滴。

在通风橱中开口煮沸15min，以除去多余的溴。

冷却后定容至1000mL，过滤即成Folin—酚试剂乙贮存液，此液应为鲜黄色，不带任何绿色。

置棕瓶中，可在冰箱长期保存。

若此贮存液使用过久，颜色由黄变绿，可加几滴液溴，煮沸几分钟，恢复原色仍可继续使用。

试剂乙贮存液在使用前应确定其酸度。

以之滴定标准氢氧化钠溶液（1mol/L左右），以酚酞为指示剂，当溶液颜色由红→紫红→紫灰→墨绿时即为滴定终点。

该试剂的酸度应为2mol/L左右，将之稀释至相当于1mol/L酸度应用。

二、标准和待测蛋白质溶液

1.标准蛋白质溶液

结晶牛血清白蛋白或酪蛋白，预先经微量克氏定氮法测定蛋白质含量，根据其纯度配制成150μg/mL蛋白溶液

2.待测蛋白质溶液

人血清，使用前稀释150倍。

三、器材

试管1.5×15cm（×6），试管架，移液管0.5mL（×2）；1mL（×2）；5mL（×1）；恒温水

浴；分光光度计。

操作方法

一、制作标准曲线

取7支试管，按下表平行操作：

试管编号

试剂处理

标准蛋白质溶液（mL）

0.1

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

蒸馏水（mL）

1.0

0.9

0.8

0.6

0.4

0.2

Folin-酚甲试剂（mL）

5.0

摇匀，于20—25℃放置10min

Folin-酚乙试剂（mL）

0.5

迅速摇匀，30℃（或室温20—25℃）水浴保温30min，以蒸馏水为空白，

在640nm处比色

A640

绘制标准曲线：

以A640值为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。

二、未知样品蛋白质浓度测定

取2支试管，按下表平行操作：

试管编号

试剂处理

空白管

×2

样品管

×2

血清稀释液（mL）

0.2

蒸馏水（mL）

1.0

0.8

Folin－酚甲试剂（mL）

5.0

摇匀，于20—25℃放置10min

Folin－酚乙试剂（mL）

0.5

迅速摇匀，30℃（或室温20—25℃）水浴保温30min，以蒸馏水为空白，在640nm处比色

A640

三、计算

注意事项

（1）Folin-酚乙试剂在酸性条件下较稳定，而Folin－酚甲试剂是在碱性条件下与蛋白质作用生成碱性的铜－蛋白质溶液。

当Folin－酚乙试剂加入后，应迅速摇匀（加一管摇一管），使还原反应产生在磷钼酸－磷钨酸试剂被破坏之前。

（2）血清稀释的倍数应使蛋白质含量在标准曲线范围之内，若超过此范围则需将血清酌情稀释。

蛋白质含量的定量测定——双缩脲法（Biuret法）

具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应。

在碱性溶液中双缩脲与铜离子结合形成复杂的紫好色复合物。

而蛋白质及多肽的肽键与双缩脲的结构类似，也能与Cu2+形成紫红色络合物，其最大光吸收在540nm处。

其颜色深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸的组成无关，该法测定蛋白质的浓度范围适于1~10mg/mL。

双缩脲法常用于蛋白质的快速测定。

实验原理

具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应。

在碱性溶液中双缩脲与铜离子结合形成复杂的紫好色复合物。

而蛋白质及多肽的肽键与双缩脲的结构类似，也能与Cu2+形成紫红色络合物，其最大光吸收在540nm处。

其颜色深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸的组成无关，该法测定蛋白质的浓度范围适于1~10mg/mL。

双缩脲法常用于蛋白质的快速测定。

紫红色铜双缩脲复合物分子结构为：

试剂和器材

一、试剂

双缩脲试剂：

取1.5g硫酸铜（CuSO4?

5H2O）和6.0g的酒石酸钾钠（NaKC4H4O6·4H2O）溶于500mL蒸馏水中，在搅拌下加入300mL10%NaOH溶液，用水稀释至1000mL。

此试剂可长期保存、备用。

二、标准和待测蛋白质溶液

标准蛋白溶液：

10mg/mL结晶牛血清白蛋白溶液或相同浓度的酪蛋白溶液（用0.05mol/L氢氧化钠溶液配制）。

作为标准用的蛋白质要预先用微量克氏定氮法测定蛋白质含量，根据其纯度称量，配制成标准溶液。

待测蛋白质溶液：

人血清（稀释10倍）。

测试其他蛋白质样品应稀释适当倍数，使其浓度在标准曲线测试范围内。

三、器材

试管1.5×15cm（×16），试管架，移液管1mL（×3）；5mL（×1）；恒温水浴；分光光度计。

操作方法

一、制作标准曲线

取12支试管分成两组，按下表平行操作：

展开阅读全文