流式细胞仪上机培训手册.docx

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流式细胞仪上机培训手册

流式细胞仪上机操作培训手册

一、样本处理

以PBMC表面抗原的流式检测步骤为例

1）取样。

取新鲜提取或冻存后复苏的PBMC；

2）编号。

根据实验设计，标记好流式管，如每份PBMC设两管：

a）1号管：

相应同型对照；

b）2号管：

CD3,CD4,CD8,CD56四标管；

3）加样。

用移液器取100ul细胞/管（约1×106个细胞/管），分别加到已经标记好的流式管底部；

4）洗涤。

加入1mlPBS/管，涡旋1600rpm/min，离心6min；

5）染色。

弃上清，加入100μlPBS/管涡旋混匀细胞，并根据实验设计，向各流式管中加入相应的荧光素标记抗体，混匀，室温避光孵育30min（操作尽量保持在避光条件下进行。

）

6）洗涤。

加入1mlPBS/管，涡旋1600rpm/min，离心6min；

7）重悬。

弃上清，加入0.5mlPBS/管，混匀，上机检测（可选择BDFACSCantoII或BDAccuriC6）。

（注：

若不能及时上机，应加入4%多聚甲醛固定，并于4℃避光保存。

）

8）试验结果分析。

（注：

实验过程中如果进行多色标记，需要调节荧光补偿）。

参考值：

CD3+

60.8-75.4%

CD4+

29.4-45.8%

CD8+

18.2-32.8%

NK（CD3-CD56+）

9.5-23.5%

二、上机检测

BDFACSCantoII简要操作流程

启动流式细胞仪

1打开流式细胞仪电源

2启动计算机，打开软件登录

3确保软件连接到流式细胞仪

必要时，点击Cytometer>connect

检查液体水平

1启动流式细胞仪后，检查液体水平

低液面水平或者废液桶满都用红色指示。

2如果液流车未自动开启，选择Cytometer>FluidicsStartup。

3当液流启动完成后，点击OK关闭对话框。

检查气泡

1在检查完液体水平后，开启流动室门，检查流动室中是否有气泡。

2如果没有看到气泡，进行第5步。

如果看到气泡，点击Cytometer>CleaningModes>De-gasFlowCell.

3当完成信息出现后，点击OK。

4如果还可以看到气泡，重复上述操作。

注意：

如果打开流动室细胞进口门时出现错误信息，通过关闭进口门，并等待30秒关闭该信息。

5当您完成上述操作后，在往下进行之前请先检查激光预热是否已经完成。

创建实验

1按照需要，在工作区工具栏中点击相应的按钮来显示浏览器、细胞仪、检测器、工作表、获取控制板和双指数编辑器窗口。

2创建文件夹：

A在浏览器中选择数据库图标，并点击浏览器工具栏上的NewFolder。

B对该文件夹命名。

3选择该文件夹，点击NewExperriment来创建一个新实验。

4对该实验进行重命名。

5选择实验级别的细胞仪设置，然后点击Inspector（检测器）中的Parameters（参数）选项卡。

6按照需要变更，添加或者删除参数。

运行样本并记录数据

1将样品管安装到流式细胞仪中并点击AquireData（获取数据）。

A把抽吸臂向左侧推。

B把流式管放置到SIT上，确保试管竖直，并用力向上推试管直到试管完个停止并完个就位。

C把抽吸臂放置到试管下的中心位置。

抽吸臂上有3个传感器引脚。

试管底部应定位在

这些引脚的中心位置内。

2调节FSC和SSC电压以正确显示细胞的散射光特征。

3必要时，点击阈值图标并对FSC阈值进行调节。

4调节P1门仅围绕目的细胞群体。

5调节好后，点击RecordData（记录数据）以记录数据。

6获取停止，取出试管。

建立全局工作表

1如果用户参数中启用了Defaultglobalworksheet（默认个局工作表）（默认选项），则全局工作表已经存在。

展开全局工作表文件夹来定位和重命名工作表。

（注：

如果Defaultglobalworksheet被禁用，则通过点击浏览器工具栏中的NewGlobalWorksheet（新个局工作表）按钮创建个局工作表。

）

2使用设计对话框定义参数标记并指定各个试管要记录的细胞颗粒数。

标记会出现在点图轴上和所有的统计结果图中。

A选择Experiment（实验）>ExperimentLayout（实验布局）。

B在Labels（标签）选项卡中，为试管输入适当的标签。

例如，在FITC域中输入CD3。

使用Tab键移动到下一个域。

3在该全局工作表中，创建用预览数据的点图。

例如:

创建PerCP-Cy5.5对SSC,FITC对APC,FITC对PE,FITC对PE-Cy7和FITC对APC-Cy7点图。

设门

通过设门的方法可以定义细胞亚群的区域。

如：

PBMC样本是混合细胞群，如果想单独分析淋巴球细胞，可根据FSC或细胞大小，在FSC，SSC的散点图中设门，其数据结果只反映淋巴细胞亚群的荧光特性。

关机

1选择Cytometer（细胞仪）>FluidicsShutdown（液流关闭），并遵循所有的提示。

2关闭细胞仪电源。

3退出BDFACSDiva软件。

C6简要操作流程

开机

1.打开电脑，上样处放置一管双蒸水

2.打开C6仪器，其自动执行“startup”，时间约5min，期间禁止开盖

3.当软件显示仪器状态为“CytometerConnectedandready”并亮绿灯时，则可以上样

4.（推荐用质控微球上机，FL1-H和FL2-H直方图中必须有八个峰，FL3-H中必须有6-8个峰，即仪器分辨率CV值满足标准）

采集样品

1.样品震荡混匀后置于上样二档处

2.设置流速，采样数目或时间或体积

3.点击“DotPlot”或“Histogram”或“DensityPlot”，选择需要的图形

4.点击坐标轴参数，从下拉菜单中选择需要的参数（如：

“FL1-A”“FSC-A”）

5.点击“PlotSpec”，选择“linear”或者“log”，设置坐标轴显示范围

6.右击坐标轴参数，选择“RenameParameters”，进行坐标轴重命名

7.选择“Display”中的“EventsDisplaySettings”，选择显示的细胞数

8.选择样品位置，点击“run”，进行采样

9.取下样品

10.取新的流式细胞管置于上样针处，点击“backflush”，清洗上样针

11.样品命名

12.点击“ZoomIn”，放大指定区域，设置阈值。

点击“ZoomOut”，返回放大

设门

1.在图像下方点击设门工具，圈定指定区域，设置为门

2.点击相应图像上方的“Gate”，选择该图像需要应用的门

设置补偿

若样本是双荧光或三荧光检测，则实际图像显示中会用到荧光补偿

1.点击“SetColorCompensation”

2.选择需要补偿的荧光参数，输入补偿值，点击“Save&Close”

分析统计

点击“Statistic”

可选择预览选择的样品图形，所有的Plot列表。

所有的Plots，Gates以及统计学的列表，从中选择需要显示的信息

关机清洗

1.放置一管去离子水，运行2min，清洗时＜10Events/sec才算干净

2.放置一管0.5%-1%有效氯的清洗液，运行2min

3.放置一管去离子水，运行2min，运行结束后去离子水保留在上样处

4.退出软件，关闭电脑

5.关闭电源键（按住时间小于5秒钟），仪器自动Shutdown，时间约为13min，完成后仪器电源键自动关闭

三、数据分析

略。