细胞与分子生物学技术.docx

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细胞与分子生物学技术

姓名:

翟少峰学号：

1004014心脏外科专业

1、概述细胞培养过程中的无菌操作的基本要领和要求。

答：

细胞培养过程中的无菌操作的基本要领和要求是1.实验进行前，无菌室及无菌操作台（laminarflow）以紫外灯照射30-60分钟灭菌，以70%

ethanol擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10分钟后，才开始实验操作。

每

次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间

污染。

实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70%ethanol擦拭无菌操作抬面。

操作间

隔应让无菌操作台运转10分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。

2.无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可

以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。

实验用品以70%ethanol擦

拭后才带入无菌操作台内。

实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操

作。

3.小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。

勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打

开之容器正上方操作实验。

容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，

尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。

4.工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。

对于来自人类或是病毒

感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台（至少ClassII）。

操作过程

中，应避免引起aerosol之产生，小心毒性药品，例如DMSO及TPA等，并避免尖锐

针头之伤害等。

5.定期检测下列项目：

5.1.CO2钢瓶之CO2压力

5.2.CO2培养箱之CO2浓度、温度、及水盘是否有污染（水盘的水用无菌水，每周更换）。

5.3.无菌操作台内之airflow压力，定期更换紫外线灯管及HEPA过滤膜，预滤网（300

小时/预滤网，3000小时/HEPA）。

6.水槽可添加消毒剂（Zephrin1:

750），定期更换水槽的水。

2、概述培养细胞的冻存、复苏的基本过程及注意事项。

答：

培养细胞的冻存、复苏的基本过程

（一）冻存

1、消化细胞（同实验二），将细胞悬液收集至离心管中。

2、1000rpm离心10分钟，弃上清液。

3、沉淀加含保护液的培养，计数，调整至5×106/ml左右。

4、将悬液分至冻存管中，每管1ml。

5、将冻存管口封严。

如用安瓿瓶则火焰封口，封口一定要严，否则复苏时易出现爆裂。

6、贴上标签，写明细胞种类，冻存日期。

冻存管外拴一金属重物和一细绳。

7、按下列顺序降温：

室温→4℃（20分钟）→冰箱冷冻室（30分钟）→低温冰箱（－30℃1小时）→气态氮（30分钟）→液氮。

注意：

操作时应小心，以免液氮冻伤。

液氮定期检查，随时补充，绝对不能挥发干净，一般30立升的液氮能用1～1.5月。

（二）复苏

1、准备一个茶缸或1000ml的烧坏，内装2/3杯37℃的温水。

2、从液氮中取出冻存管、迅速置于温水中并不断搅动。

使冻存管中的冻存物在1分钟之内融化。

3、打开冻存管，将细胞悬液吸到离心管中。

4、1000rpm离心10分钟，弃去上清液。

5、沉淀加10ml培养液，吹打均匀，再离心10分钟，弃上清液。

6、加适当培养基后将细胞转移至培养瓶中，37℃培养，第二天观察生长情况。

三、试剂和器材

器材：

液氮罐、冻存管（塑料螺口专用冻存管或安瓿瓶）、离心管、吸管、离心机等

试剂：

0.25％胰酶、培养基、含保护剂的培养基（即冻存液）

附：

冻存液配制：

培养基加入甘油或DSMO，使其终浓度达5—20%。

保护剂的种类和用量视不同细胞而不同。

配好后4℃下保存。

细胞系或细胞株的建立

注意事项：

冻存方法
1.细胞：

选对数生长期细胞，收集细胞24小时前换液一次。

2.计数：

按常规方法把细胞制成细胞悬液，计数。

令细胞密度达5×106/ml，离心去上清。

吸入离心管中。

3.冻存液：

先用培养液9分DMSO1分（或甘油）配成10%的DMSO冻存液，按上法一滴滴加入离心管中，然后用吸管轻轻吹打令细胞重悬。

4.分装：

分装入无菌安剖中。

每安剖加1.5毫升细胞悬液。

5.封口：

用塑料安剖时拧紧瓶口即可；如用火焰封闭安剖口后，仔细检查，定要封严，必要时可浸入蓝色液中观察，为安全起见。

;把安剖缝入纱布小袋中，以防液氮浸入后，融解时因受热发生爆炸伤人；纱袋一端系以线绳。

末端扎有小牌，注明：

细胞名称，冻存日期。

以便日后查找。

3、概述细胞培养技术在生物医学研究中的优缺点。

答:

优点

　　1.直接观察活细胞的形态结构和生命活动。

用于细胞学、遗传学、免疫学、实验医学和肿瘤学等多种学科研究.　　2.直接观察细胞的变化可便于摄影。

　　3.研究细胞种类如低等到高等到人类、胚胎到成体、正常组织到肿瘤。

　　4.便于使用各种技术：

相差、荧光、电镜、组化、同位素标记等方法观察和研究细胞状况。

　　5.是分子生物学和基因工程学的研究对象，也是其主要的组成部分。

　　6.易于施用物理、化学生物的实验研究。

　　7.易于提供大量生物性状相似的实验对象,耗资少比较经济。

　　8.成为生物制品单克隆抗体生产和基因工程等的材料来源。

缺点

　　组织和细胞离体后独立生存在人工的培养环境中，虽然模拟体内环境，仍有很大差异。

因而利用培养细胞做实验时，不应视为体内细胞完全相同，把实验结果推测体内，轻易做出与体内等同的结论。

4、何谓细胞化学技术？

涉及哪些专有设备？

各专有设备的基本工作原理如何？

答：

细胞化学技术:

在保持细胞结构完整的条件下，通过细胞化学反应研究细胞内各种成分（主要是生物大分子）的分布情况以及这些成分在细胞活动过程中的动态变化的技术。

化学技术不是单一的技术，而是一整套有关联的技术，包括酶细胞化学技术，免疫细胞化学技术，放射自显影技术，示踪细胞化学技术等

涉及专有设备有，

5、免疫组化的双标技术的要点是什么？

答:

免疫组化的双标技术的要点是：

1、免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其它相同。

2、免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工作浓度确定。

3、二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察。

4、免疫荧光在封片使用专用封片剂或甘油：

0.01MPBS（1：

1）。

5、条件许可可以购买防淬灭的试剂加入封片剂中，标本可以保存更久。

6、荧光抗体的孵育以及后续处理需要闭光。

7、荧光抗体染色假阳性可能会多，需要设定阳性和阴性对照。

二、注重事项

1、荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，会使荧光减弱。

2、每次试验时，需设置以下三种对照：

（1）阳性对照：

阳性血清+荧光标记物

（2）阴性对照：

阴性血清+荧光标记物

（3）荧光标记物对照：

PBS+荧光标记物

三、免疫荧光双标的经验之谈

1、选取primaryantibodies时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于rabbit和rat的抗体，secondaryantibodies则是不同荧光信号标记的，我用的是donkeyanti-rabbit-FITC（绿）和donkeyanti-rat-Tex-Red（红）。

2、我的做法是两种primaryantibodies同时孵育，然后两种secondaryantibodies同时孵育。

抗体浓度、孵育时间要认真摸索，我感觉primaryantibodies4度孵育过夜比较好，背景比较干净。

3、我的阳性对照采用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是rabitt和rat的IgG，荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。

4、Block用的血清使secondaryantibody来源动物的血清，我的是10%正常donkey血清。

5、其余同一般操作。

6、细胞凋亡的检测法有哪些，各自的原理如何？

答：

细胞凋亡的检测法有苏木素——伊红染色（HE染色法），吖啶橙染色法，吖啶橙/EB双染色法，

伊红染色（HE染色法【原理】

苏木素容易被氧化，其氧化产物苏木红与铝结合形成一种带正电荷的蓝色色精，与带负电荷的脱氧核糖核酸酸根吸附而使细胞核染色。

染色后必须进行分化（differenciation）和蓝化（blueing）处理。

所谓分化，就是用某些试剂，将过度染色的或不需着色的组织成分上的颜色除去。

所谓蓝化是指用明矾苏木素液深染细胞核后，通过盐酸乙醇分化，切片从酸性环境中（此时，切片呈红褐色）转移至流水中使之变蓝的过程。

伊红Y（四嗅荧光素二钠盐）是一种酸性染料，可使细胞的胞浆染成粉红色。

吖啶橙染色法

【原理】

吖啶橙是最经典的灵敏的荧光染料，它可通过与DNA和RNA的连接碱基对和磷酸盐基团结合，使细胞中的DNA和RNA同时染色而显示不同颜色的荧光。

吖啶橙在稀溶液中呈绿色；在浓溶液中，由于出现二聚体和多聚体而呈现橙红色。

由于DNA是高度聚合物，吸收荧光物质的位置较少，故发绿色荧光；而RNA聚合度低，能和荧光物质结合的位置多，故发红色荧光。

吖啶橙/EB双染色法

【原理】

用吖啶橙染色可以检测细胞凋亡，但不能区别活细胞和死细胞。

溴化乙锭（EB）仅着染死细胞，可使DNA染成桔红色，而仅很弱地结合RNA使之呈红色。

因此将吖啶橙和溴化乙锭混合使用，可根据两种染料的吸收情况鉴定死细胞和活细胞

7、基因组DNA提取目前常用的有哪些方法？

提取时应该注意哪些事项？

答：

制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。

在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。

主要是CTAB方法，其他的方法还有1物理方式:

玻璃珠法,超声波法,研磨法,冻融法。

2化学方式：

异硫氰酸胍法,碱裂解法3生物方式:

酶法。

根据核酸分离纯化方式的不同有:

硅质材料、阴离子交换树脂等

提取时应该注意哪些事项：

1、裂解液要预热,以抑制DNase,加速蛋白变性,促进DNA溶解。

2、酚一定要碱平衡。

苯酚具有高度腐蚀性，飞溅到皮肤、粘膜和眼睛会造成损伤，因此应注意防护。

氯仿易燃、易爆、易挥发，具有神经毒作用，操作时应注意防护。

3、各操作步骤要轻柔,尽量减少DNA的人为降解。

4、取各上清时,不应贪多,以防非核酸类成分干扰。

5、异丙醇,乙醇.NaAc,KAc等要预冷,以减少DNA的降解,促进DNA与蛋白等的分相及DNA沉淀。

6、提取DNA过程中所用到的试剂和器材要通过高压烤干等办法进行无核酸酶化处理。

7、所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制。

8、用大口滴管或吸头操作，以尽量减少打断DNA的可能性。

9、要用新鲜样品或液氮冷冻-70度保存的样品。

这样通过降低内切酶的活性DNA的降解。

10、避免剧烈吸打DNA，不能搅动基因组DNA。

11、吸取基因组DNA时，要用专用的粗口吸头，普通吸头可能会切断DNA或造成DNA缺口。

12、基因组应4度保存，如-20度保存可能导致DNA断裂。

13、在准备实验的过程中，应将DNA样品放在碎冰上。

14、用Tris缓冲液溶解DNA。

15、加缓冲液后，为了加速DNA溶解，可以轻轻晃动或轻弹试管。

16、加入缓冲液后，置于4度过夜，也可以溶解DNA

17、将DNA溶液65度温育10分钟，可以灭活DNase。

18、在抽提过程中如果水相和有机层的界面不太清楚，说明其中蛋白质含量较高，可增加酚/氯仿抽提的次数或适当延长离心的时间。

19、酚抽提时如果上清液太粘稠，无法进行水相转移时，可加入适量TES稀释后再抽提。

8、核酸分子杂交的原理是什么？

怎样做Southernblot?

答：

它的基本原理是：

互补的DNA单链能够在一定条件下结合成双链，即能够进行杂交。

这种结合是特异的，即严格按照碱基互补的原则进行，它不仅能在DNA和DNA之间进行，也能在DNA和RNA之间进行。

因此，当用一段已知基因的核酸序列作出探针，与变性后的单链基因组DNA接触时，如果两者的碱基完全配对，它们即互补地结合成双链，从而表明被测基因组DNA中含有已知的基因序列

做Southernblot的步骤：

1器材：

台式离心机，恒温水浴锅，电泳仪，水平电泳槽，杂交炉，杂交袋，尼龙膜或硝酸纤维素膜，转印迹装置，滤纸，吸水纸，紫外交联仪或80℃烤箱，摇床，X线胶片。

（二）试剂：

限制性内切酶，DNA加样缓冲液，DNALadderMarker，0.25MHCl，变性液（0.5MNaOH，1.5MNaCl），中和液（0.5MTris-HClPH7.5，3MNaCl）,转印迹液20╳SSC（3MNaCl，0.3M柠檬酸钠，PH7.0），标记探针，2╳SSC，预杂交液和杂交液，2×洗液（2×SSC,0.1%SDS）,0.5×洗液（0.5×SSC,0.1%SDS）,1×缓冲洗液（0.1M马来酸，0.15MNaCl,PH7.5,0.3%Tween20）,1×封阻液[1％（W/V）封阻剂溶于1×马来酸溶液（0.1M马来酸，0.15MNaCl,PH7.5）]，1×检测液（0.1MTris-HCl,0.1MNaCl,PH7.5），抗－地高辛－碱性磷酸酶。

2、消化好的样品点样于0.7％琼脂糖凝胶进行电泳；

3、电泳结束后，将凝胶依次用如下试剂处理进行碱变性，室温下轻轻摇动确保溶液覆盖凝胶0.25MHCl10－15min

蒸馏水摇洗5min

变性液40min

蒸馏水摇洗5min

中和液15min，2次；

4、在凝胶碱变性的同时，制备转印迹装置。

Southernblot转膜技术有三种：

1），毛细管转移法；

2），电转移法；

3），真空转移法。

这里介绍最经典的毛细管转移法（向上转移），在转印迹槽中，倒入20╳SSC溶液，槽中置一固相支持物，在固相支持物上从下向上依次置入：

两张与凝胶等宽的滤纸，将滤纸纵向自固相支持物垂于转印迹槽中（简称“桥”），底面在上的凝胶，滤膜（与凝胶等大），滤纸（与凝胶等大），吸水纸（略小于滤纸，5－8cm高），400－800g重物。

凝胶四周用Parafilm膜包围防止短路。

滤膜事先用2╳SSC浸湿至少5min。

滤纸事先用20╳SSC浸湿。

转膜4－18小时；

5、转膜结束后，取出滤膜，边角剪一小角做标记。

滤膜于2╳SSC摇洗5min，用滤纸吸干；

6、用紫外交联照射（正面朝上）或于80℃烤箱烘烤0.5－2小时；

7、膜可立即进行预杂交和杂交，或保存于4℃待以后应用；

8、预杂交和杂交

1）将杂交膜浸湿于6╳SSC2min，同时预热预杂交液和杂交炉至预杂交温度；

2）杂交膜封于杂交袋，按0.2ml/cm2膜面积加入预杂交液，预杂交至少1小时；

3）用于southernblot的探针可分为DNA探针、RNA探针和寡核苷酸探针。

对探针的标记方法又可以分为放射性标记和非放射性标记。

这里主要介绍非放射性地高辛标记探针的杂交方法。

杂交时各种探针的用量：

DNA探针，5－25ng/ml；RNA探针，100ng/ml；寡核苷酸探针，0.1－10pmol/ml。

双链DNA探针提前100℃变性10min后迅速冰浴，单链探针无需变性。

将处理后的探针加入杂交液温浴至杂交温度。

杂交温度的选择根据杂交液的不同而不同；

注意：

应用寡核苷酸探针时，杂交温度的选择。

Tm＝4╳（GC）2╳（AT）,杂交温度比Tm低约10℃。

4）弃去预杂交液，将含探针的杂交液注入杂交袋，至少3.5ml/10╳1℃m，置入杂交炉滚动；

9、杂交后的洗膜处理过程，顺序如下：

2×洗液2×15min

0.5×洗液2×15min

1×缓冲洗液1×3min

1×封阻液1×60min

抗体液*1×30min

1×缓冲洗液2×15min

1×检测液1×5min

*抗－地高辛－碱性磷酸酶用1×封阻液稀释10，000倍（若用显色法稀释5000倍；若用CDP-Star检测用20，000倍稀释）；

10、将膜浸于CSPD液（CSPD用1×检测液稀释100倍，CDP-Star也用1×检测液稀释100倍）室温避光静置5min；回收剩余的CSPD液或CDP-Star液避光保存于4℃可反复应用3－5次；

11、将膜上残液吸净，用保鲜膜封好于37℃反应15min，然后将膜固定于压片夹，进行曝光。

9、如何使一个真核生物基因在原核生物中高效、分泌表达？

简述其操作步骤。

答：

原核表达系统是目前应用最广泛的表达系统，由于待表达的外源基因结构具有多样性，尤其是真核生物基因的结构与原核生物基因结构之间存在较大的差异，因而在构建表达系统时必须具体情况具体分析。

一般来说，高效表达外源基因必须考虑以下事项：

①优化表达载体的设计。

为了提高外源基因的表达效率，在构建表达载体时对决定转录起始的启动子和决定mRNA翻译的SD序列进行优化。

具体方法包括：

组合强启动子和强终止子；增加SD序列中与核糖体16SrRNA互补配对的碱基因序列，使SD序列中6～8个碱基与核糖体16SrRNA的碱基完全配对；根据待表达外源基因的不同情况调整SD序列与起始密码子ATG之间的距离及碱基的种类；防止核糖体结合位点附近序列转录后形成“茎环”二级结构；在克隆基因的末端，加上一个转录终止区，减轻细胞代谢负荷，减少通读机会；加入par区防止质粒丢失，并对无质粒细胞进行反选择，使质粒拷贝数稳定在一个脚适宜的水平。

②提高稀有密码子tRNA的表达作用。

多数密码子具有简并性，而不同基因使用密码子的频率不相同。

原核生物基因对某些密码子的使用表现了较大的偏爱性，在几个同义密码中往往只有一个或两个被频繁地使用。

可通过点突变等方法将外源基因中的稀有密码子转换为在受体细胞中高频出现的同义密码子。

③提高外源基因mRNA的稳定性。

原核生物的核酸酶系统能专一性地识别外源DNA或RNA并对其进行降解。

对于mRNA来说，为了保持其在宿主细胞内的稳定性，可采取两种措施，一是尽可能减少核酸外切酶可能对外源基因mRNA的降解，二是改变外源基因mRNA的结构，使之不易被降解。

④提高外源基因表达产物的稳定性。

原核生物中含有多种蛋白水解酶，在外源基因表达产物的诱导下，蛋白水解酶的活性可能会增加。

因此，须采用多种措施提高外源蛋白在大肠杆菌细胞内的稳定性。

常用的方法包括：

将外源基因的表达产物转运到细胞周质或培养基中；选用某些蛋白水解酶缺陷株作为受体菌；对外源蛋白中水解酶敏感的序列进行修饰或改造；在表达外源蛋白的同时，表达外源蛋白的稳定因子；采用突变菌株，保护表达蛋白不被降解；加入分泌信号，表达分泌蛋白。

⑤优化发酵过程。

由于细菌在100L以上的发酵罐中的生长代谢活动与实验室条件下200mL摇瓶中的生长代谢活动存在很大差异，在进行工业化生产时，工程菌株大规模培养的优化设计和控制对外源基因的高效表达至关重要。

优化发酵过程既包括工艺方面的因素也包括生物学方面的因素。

工艺方面的因素如选择合适的发酵系统或生物反应器，目前应用较多的有罐式搅拌反应器、鼓泡反应器和气升式反应器等。

生物学方面的因素包括多方面，首先是与细菌生长密切相关的条件或因素，如发酵系统中的溶氧、pH值、温度和培养基的成分等，这些条件的改变都会影响细菌的生长及基因表达产物的稳定性。

生物因素的第二方面是对外源基因表达条件的优化。

在发酵罐内工程菌生长到一定的阶段后，开始诱导外源基因的表达，诱导的方式包括添加特异性诱导物和改变培养温度等。

使外源基因在特异的时空进行表达不仅有利于细胞的生长代谢，而且能提高表达产物的产率。

生物因素的第三方面是提高外源基因表达产物的总量。

外源基因表达产物的总量取决于外源基因表达水平和菌体浓度。

在保持单个细胞基因表达水平不变的前提下，提高菌体密度可望提高外源蛋白质合成的总量

10、核酸分子杂交的原理是什么？

怎样做Southernblot?

答：

它的基本原理是：

互补的DNA单链能够在一定条件下结合成双链，即能够进行杂交。

这种结合是特异的，即严格按照碱基互补的原则进行，它不仅能在DNA和DNA之间进行，也能在DNA和RNA之间进行。

因此，当用一段已知基因的核酸序列作出探针，与变性后的单链基因组DNA接触时，如果两者的碱基完全配对，它们即互补地结合成双链，从而表明被测基因组DNA中含有已知的基因序列

做Southernblot的步骤：

1器材：

台式离心机，恒温水浴锅，电泳仪，水平电泳槽，杂交炉，杂交袋，尼龙膜或硝酸纤维素膜，转印迹装置，滤纸，吸水纸，紫外交联仪或80℃烤箱，摇床，X线胶片。

（二）试剂：

限制性内切酶，DNA加样缓冲液，DNALadderMarker，0.25MHCl，变性液（0.5MNaOH，1.5MNaCl），中和液（0.5MTris-HClPH7.5，3MNaCl）,转印迹液20╳SSC（3MNaCl，0.3M柠檬酸钠，PH7.0），标记探针，2╳SSC，预杂交液和杂交液，2×洗液（2×SSC,0.1%SDS）,0.5×洗液（0.5×SSC,0.1%SDS）,1×缓冲洗液（0.1M马来酸，0.15MNaCl,PH7.5,0.3%Tween20）,1×封阻液[1％（W/V）封阻剂溶于1×马来酸溶液（0.1M马来酸，0.15MNaCl,PH7.5）]，1×检测液（0.1MTris-HCl,0.1MNaCl,PH7.5），抗－地高辛－碱性磷酸酶。

2、消化好的样品点样于0.7％琼脂糖凝胶进行电泳；

3、电泳结束后，将凝胶依次用如下试剂处理进行碱变性，室温下轻轻摇动确保溶液覆盖凝胶0.25MHCl10－15min

蒸馏水摇洗5min

变性液40min

蒸馏水摇洗5min

中和液15min，2次；

4、在凝胶碱变性的同时，制备转印迹装置。

Southernblot转膜技术有三种：

1），毛细管转移法；

2），电转移法；

3），真空转移法。

这里介绍最经典的毛细管转移法（向上转移），在转印迹槽中，倒入20╳SSC溶液，槽中置一固相支持物，在固相支持物上从下向上依次置入：

两张与凝胶等宽的滤纸，将滤纸纵向自固相支持物垂于转印迹槽中（简称“桥”），底面在上的凝胶，滤膜（与凝胶等大），滤纸（与凝胶等大），吸水纸（略小于滤纸，5－8cm高），400－800g重物。

凝胶四周用Parafilm膜包围防止短路。

滤膜事先用2╳SSC浸湿至少5min。

滤纸事先用20╳SSC浸湿。

转膜4－18小时；

5、转膜结束后，取出滤膜，边角剪一小角做标记。

滤膜于2╳SSC摇洗5min，用滤纸吸干；

6、用紫外交联照射（正面朝上）或于80℃烤箱烘烤0.5－2小时；

7、膜可立即进行预杂交和杂交，或保存于4℃待以后应用；

8、预杂交和杂交

1）将杂交膜浸湿于6╳SSC2min，同时预热预杂交液和杂交炉至预杂交温度；

2）杂交膜封于杂交袋，按0.2ml/cm2膜面积加入预杂交液，预杂交至少1小时；

3）用于southernblot的探针可分为DNA探针、RNA探针和寡核苷酸探针。

对探针的标记方法又可以分为放射性标记和非放射性标记。

这里主要介绍非放射性地高辛标记探针的杂交方法。

杂交时各种探针的用量：

DNA探针，5－25ng/ml；RNA探针，100ng/ml；寡核苷酸探针，0.1－10pmol/ml。

双链DNA探针提前100℃变性10min后迅速冰浴，单链探针无需变性。

将处理后的探针加入杂交液温浴至杂交温度。

杂交温