Celecoxib通过抑制Survivin表达增进肺癌A549细胞凋亡.docx

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Celecoxib通过抑制Survivin表达增进肺癌A549细胞凋亡

Celecoxib通过抑制Survivin表达增进肺癌A549细胞凋亡

【摘要】　　［目的］研究Celecoxib对肺癌A549细胞生长和凋亡的阻碍并探讨其作用机制。

［方式］用Westernblot法检测Celecoxib抑制肺癌A549细胞后生存素（Survivin）表达的转变；用酶联免疫吸附法（ELISA）测定培育上清液中前列腺素2（prostaglandin-2，PGE2）含量的转变；用四唑盐（MTT）比色法检测细胞增殖；流式细胞仪测定细胞周期。

［结果］随着Celecoxib剂量的增加和时刻的延长，PGE2的含量减少，survivin表达也相应减少，细胞增殖减少而凋亡增加。

［结论］Celecoxib能够通过PGE2的途径下调A549细胞survivin的表达并增进细胞凋亡。

【关键词】A549细胞　Celecoxib　前列腺素2　环氧合酶2　生存素

　　CelecoxibPromoteApoptosisinHumanLungCancerA549CellsbyInhibitingSurvivin

Abstract：

［Purpose］ToinvestigatetheeffectandmechanismofCelecoxibininducingproliferationinhibitionandapoptosisinhumanlungcancerA549cells.［Methods］TheexpressionofsurvivinthroughCelecoxibblockadingweredetectedbyWesternBlot.ELISAwereusedtodetectthechangeofprostaglandin-2（PGE2）contentinthesupernatantofculturesolution.Theanti-proliferativeeffectwasmeasuredbyusingMethabenzthiazuron（MTT）assay.Cellcycleandapoptosiswereanalyzedbyusingflowcytometry.［Results］WiththeblockadeofCelecoxibincreased,thePGE2contentreducedandtheexpressionofsurvivinweakened,buttheapoptosisrised.［Conclusion］Celecoxibcandown-regulatetheexpressionofsurvivinandthenpromotetheapoptosisofA549cellsviaPGE2pathway.

Keywords:

A549cell;Celecoxib;PGE2;COX-2;survivin

Celecoxib是COX-2的特异性抑制剂，最初用于医治类风湿性关节炎和骨关节炎，近十几年来发觉其具有抗肿瘤作用，作用机制可能与抑制肿瘤细胞增殖并诱导其凋亡，且抑制肿瘤血管生成并对周围组织的粘附侵袭有关。

Survivin是最近几年来发觉的抗凋亡蛋白（inhibitorofapoptosisprotein，IAP）家族的新成员，在人类绝大多数恶性肿瘤中均有表达，通过对抗细胞凋亡而有利于肿瘤的生长。

目前，有关Celecoxib与survivin的关系报导极少。

咱们研究的目的是要观看Celecoxib对肺癌A549细胞survivin表达的阻碍，探讨Celecoxib调剂survivin表达进而增进A549细胞凋亡的分子机制。

1材料与方式

材料

人肺癌A549细胞来自于中南大学湘雅医学院肿瘤研究所；DMEM培育液和胎牛血清购自美国Hyclone公司；survivin一抗及二抗购自北京中杉公司（美国SantaCruz公司产品，入口分装）；Celecoxib购自辉瑞公司；PGE2购自Sigma公司；酶联免疫检测试剂盒购自上海太阳生物技术；紫外分光光度计购自美国BACKMEN公司；酶联免疫检测仪购自芬兰LabsystemsDragon公司。

方法

细胞培育及提取蛋白

A549细胞接种在含10mlDMEM（含10%小牛血清，青霉素和链霉素各100U/ml，下同）的直径10cm的培育皿中，置于37℃、5%CO2无菌培育箱中培育，2~3d换液，%的胰酶消化传代。

为幸免血清对实验的阻碍，待细胞长到70%~80%成熟时换无血清DMEM培育液行Celecoxib干与。

干与分为Celecoxib量—效关系组和时—效关系组，每组4皿。

Celecoxib量—效关系组每皿别离给予Celecoxib0、10、20、40μmol/L，12h后裂解细胞提取蛋白；Celecoxib时—效关系组每皿别离给予20μmol/L的Celecoxib，别离在0、六、1二、24h裂解细胞提取蛋白。

每皿在裂解细胞前先留取适量培育上清液，用于做ELISA检测PGE2含量。

ELISA检测培育上清液中PGE2

搜集Celecoxib干与各个不同浓度点和时刻点的细胞培育上清液，取上清液加入1NHCl，离心10min，搜集上清液再加入NaOH以中和酸性化了的样品。

把100μl的标准品或样品别离加入相应孔中，余下操作步骤按PGE2ELISA试剂盒要求进行。

在酶联免疫检测分析仪上测定OD492nm值，不加样品的孔作为空白对照孔用于调零，每一个标准品和样品均设置复孔，实验重复3次。

Westernblot测量survivin表达

提取蛋白后4℃低温超速（13000r/min）离心，留取上清液，用考马斯亮蓝G250法测定每一个样品的总蛋白含量。

分离胶浓度为12%，积层胶浓度为5%；每一个加样孔的蛋白上样量为100μg。

电泳时，积层胶为80V30min，分离胶为120V60min。

电泳后制“三明治”行湿性转膜12h。

5%PBS脱脂奶粉封锁液封锁3h，PBS液清洗3次，每次15min；一抗孵育2h（survivin一抗按1：

200稀释），清洗3次，每次15min；二抗反映50min（二抗按1：

3500稀释），清洗3次，每次15min，ECL显影。

MTT检测细胞凋亡情形

为了确信Celecoxib是不是通过PGE2途径阻碍细胞的凋亡，96孔培育板中除设置Celecoxib量—效关系组和时—效关系组外，还相应设置了Celecoxib+PGE2量—效和时—效关系组。

每一个浓度点和时刻点均种4孔并设置对照，计算其OD值均值。

每孔接种细胞8000个，加入10%DMEM使整体积为200μl，培育24h细胞贴壁后进行干与。

Celecoxib量—效关系组设0、10、20、40μmol/L四个浓度点，别离用A1B1C1D1表示；Celecoxib+PGE2量—效关系组设Celecoxib0、10、20、40μmol/L及PGE2100pg/ml四个浓度点，别离用A2B2C2D2表示；干与12h后每孔加入MTT液20μl（5mg/ml）,震荡器震匀，继续培育4h后液体倒出拍干，每孔给予DMSO150μl震匀10min，送酶联免疫检测分析仪中计算其OD490nm值。

Celecoxib时—效关系组设六、1二、24h3个时刻点，用B3C3D3表示，别离每孔别离给予Celecoxib20μmol/L；Celecoxib+PGE2时-效关系组设六、1二、24h3个时刻点，用B4C4D4表示，每孔别离给予Celecoxib20μmol/L及PGE2100pg/ml；无干与对照时—效关系组用B5C5D5表示；操作方式与量—效关系组相同，别离在干与六、1二、24h后处置细胞进行实验。

流式细胞检测细胞周期及凋亡

搜集不同浓度Celecoxib（0、20、40μmol/L）处置12h后的A549细胞，%胰酶消化及PBS冲洗液，1000r/min离心10min，-20℃预冷的80%乙醇固定，送北京鼎国生物实验室作细胞周期及细胞凋亡分析，实验重复3次。

统计学处置

计量资料均以x±s表示，采纳统计软件包的t查验，P<为有显著性意义。

2结果

ELISA结果

Celecoxib对PGE2释放水平的阻碍：

Celecoxib能够抑制PGE2的释放，这种抑制具有时刻效应和剂量效应：

20μmol/L的Celecoxib处置六、1二、24hPGE2水平别离为（±）pg/ml，（±）pg/ml，（±）pg/ml，与对照组（0h）（±）pg/ml相较较，其不同有统计学意义（P值别离＜，，）；10、20、40μmol/L的Celecoxib处置PGE2水平别离为（±）pg/ml，（±）pg/ml，（±）pg/ml，与对照组（0μmol/L）（±）pg/ml相较较，其不同也有统计学意义（P值别离＜，，。

Westernblot结果

如图1A、B，可见随着Celecoxib作历时刻的延长和剂量的增加，survivin表达的条带慢慢减弱（图1C为β-actine参照），说明Celecoxib能够抑制survivin表达。

MTT结果（OD值）

MTT实验结果显示，随着Celecoxib剂量的增加其OD值如图2A：

A1B1C1D1别离为，，，；A2B2C2D2别离为，，，，不同有显著性（P＜），说明细胞凋亡显著增加，而且PGE2对其有明显的对抗作用；随着时刻的延长，也显现细胞增殖减少而凋亡明显增加，OD值如图2B：

B3C3D3别离为，，；B4C4D4别离为，，；B5C5D5别离为，，，不同具有显著性（P＜），PGE2也显示了明显对抗Celecoxib的作用。

说明Celecoxib能够诱导细胞凋亡而且是通过抑制PGE2的释放实现。

流式细胞检测结果

流式检测结果如图3所示，Celecoxib20μmol/L时G1/G0为，而40μmol/L时G1/G0为，二者比较不同有显著性（P＜）；二者与对照组（G1/G0）比较，不同有显著性（P＜），说明Celecoxib能够使细胞增殖阻滞于G1/G0期。

3讨论

Survivin基因是IAP家族的一个新成员，在各类人类恶性肿瘤细胞中均有不同程度的表达。

Survivin要紧在细胞周期G2/M期表达,Survivin与活化的Caspase-3和Caspase-7结合，抑制凋亡通路下游的聚集点Caspase-3和Caspase-7,使Caspase超分子聚合体分离，从而抑制其活性，爱惜了关键的细胞周期调剂因子如p21wafl，从而抑制了细胞凋亡[1]。

研究发觉[2]survivin能够和周期素依托蛋白激酶（CdK4）结合，形成survivin/CdK4复合体，使CdK2/CyclinE激活、Rb磷酸化，致使p21蛋白从CdK4解离。

p21蛋白通过结合于G1期和S期的周期素依托蛋白激酶（cyclinD1-CdK4和cyclinE-CdK2）抑制其活性，使细胞增殖停留在G1期。

Survivin使p21解离致使CdK4活化，细胞进入增殖周期，致使大量细胞无穷制生长，有利于肿瘤的发生。

与其他恶性肿瘤一样，肺癌的发生除与致癌物质直接致使细胞恶性转化有关外，与慢性炎症的长期刺激也有必然的关系（在大多数人类的恶性肿瘤中，都发觉了COX-2的高表达）。

作为COX-2的选择性抑制剂，Celecoxib最近几年来被发觉具有抗肿瘤作用。

目前,Celecoxib的作用机制还不是很清楚，可能有以下几种途径：

①抑制PGE2的分泌，Sun等[3]发觉，Celecoxib对COX-2高表达的A549细胞有明显的抑制作用，并能使其分泌的PGE2减少，而对COX-2低表达者无明显抑制。

②激活外源性凋亡途径和凋亡聚集因子Caspase3和7Gargi等[4]研究发觉Celecoxib能激活Caspase3和7并使细胞周期停滞在G0/G1期；Liu等[5]发觉，Celecoxib能够抑制肿瘤细胞存活，激活Caspase8并进而激活Caspase级联反映，从而启动外源性凋亡途径诱导肿瘤细胞凋亡。

尽管研究说明Celecoxib能够激活细胞凋亡途径及凋亡聚集因子Caspase3和7，可是其具体的途径还不是很清楚。

咱们的实验说明，Celecoxib能显著抑制肺癌A549细胞释放PGE2，明显下调survivin的表达，其程度与PGE2释放被抑制的程度呈正相关，而且这种下调具有明显的剂量依托性和时刻依托性。

流式细胞检测结果说明，通过下调survivin的表达，A549细胞的增殖停留在G1/G0期；MTT实验结果说明，Celecoxib能显著增进A549细胞凋亡。

说明Celecoxib能抑制PGE2释放并下调survivin的表达是其抑制肿瘤细胞的途径之一。

【参考文献】

[1]ShinS,SungBJ,ChoYS,etal.AnAneli-apoptoticproteinhumansurvivinisadirectinhibitorofCaspase3and-7[J].Biochemistry,2001,40（4）:

1117-1123.

[2]SuzukiA,ItoT,KawanoH,etal.Survivininitintesprocaspase3/p21complexformationasaresultofinteractionwithCdk4toresistFas-mediatedcelldeath[J].Oncogent,2000,19（10）:

1346-1353.

[3]Shi-YongSun,ClaudiaP,Schroeder,etgrowthinhibitionandapoptosisinductioninNSCLCcellbycombinationofCelecoxiband4HRRatclinicallyrelevantconcentrations[J].CancerBiologyandTherapy,2005,4（4）:

407-413.

[4]GargiDB,LathaBP,TeresaLT,etunderlyingthegrowthinhibitioneffectsofthecycle-oxygease-2inhibitorcelecoxibinhumanbreastcancercells[J].BreastCancerRes,2005,7（4）:

422-435.

[5]XiangguoLiu,PingYue,ZhongmeiZhou,etal.DeathreceptorregulationandCelecoxib-inducedapoptosisinhumanlungcancercells[J].JournaloftheNationalCancerInstitute,2004,96（23）:

1796-1780.