Celecoxib通过抑制Survivin表达增进肺癌A549细胞凋亡.docx

1、Celecoxib通过抑制Survivin表达增进肺癌A549细胞凋亡Celecoxib通过抑制Survivin表达增进肺癌A549细胞凋亡【摘要】 目的研究 Celecoxib对肺癌A549细胞生长和凋亡的阻碍并探讨其作用机制。方式用Western blot法检测Celecoxib抑制肺癌A549细胞后生存素（Survivin）表达的转变；用酶联免疫吸附法（ELISA）测定培育上清液中前列腺素2（prostaglandin-2，PGE2）含量的转变；用四唑盐（MTT）比色法检测细胞增殖；流式细胞仪测定细胞周期。结果 随着Celecoxib剂量的增加和时刻的延长，PGE2的含量减少，survi

2、vin表达也相应减少，细胞增殖减少而凋亡增加。结论Celecoxib能够通过PGE2的途径下调A549细胞survivin的表达并增进细胞凋亡。 【关键词】 A549细胞Celecoxib前列腺素2环氧合酶2生存素Celecoxib Promote Apoptosis in Human Lung Cancer A549 Cells by Inhibiting Survivin Abstract： Purpose To investigate the effect and mechanism of Celecoxib in inducing proliferation inhibition an

3、d apoptosis in human lung cancer A549 cells.Methods The expression of survivin through Celecoxib blockading were detected by Western Blot. ELISA were used to detect the change of prostaglandin-2 (PGE2) content in the supernatant of culture solution. The anti-proliferative effect was measured by usin

4、g Methabenzthiazuron (MTT) assay. Cell cycle and apoptosis were analyzed by using flow cytometry. Results With the blockade of Celecoxib increased, the PGE2 content reduced and the expression of survivin weakened, but the apoptosis rised. Conclusion Celecoxib can down-regulate the expression of surv

5、ivin and then promote the apoptosis of A549 cells via PGE2 pathway. Key words: A549 cell; Celecoxib; PGE2; COX-2; survivin Celecoxib是COX-2的特异性抑制剂，最初用于医治类风湿性关节炎和骨关节炎，近十几年来发觉其具有抗肿瘤作用，作用机制可能与抑制肿瘤细胞增殖并诱导其凋亡，且抑制肿瘤血管生成并对周围组织的粘附侵袭有关。Survivin是最近几年来发觉的抗凋亡蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP）家族的新成员，在人类绝大多数恶性

6、肿瘤中均有表达，通过对抗细胞凋亡而有利于肿瘤的生长。目前，有关Celecoxib与survivin的关系报导极少。咱们研究的目的是要观看Celecoxib对肺癌A549细胞survivin表达的阻碍，探讨Celecoxib调剂survivin表达进而增进A549细胞凋亡的分子机制。 1 材料与方式 材 料 人肺癌A549细胞来自于中南大学湘雅医学院肿瘤研究所；DMEM培育液和胎牛血清购自美国Hyclone公司；survivin一抗及二抗购自北京中杉公司（美国Santa Cruz公司产品，入口分装）；Celecoxib购自辉瑞公司；PGE2购自Sigma公司；酶联免疫检测试剂盒购自上海太阳生物技

7、术；紫外分光光度计购自美国BACKMEN公司；酶联免疫检测仪购自芬兰Labsystems Dragon公司。 方 法 细胞培育及提取蛋白 A549细胞接种在含10ml DMEM（含10%小牛血清，青霉素和链霉素各100U/ml，下同）的直径10cm的培育皿中，置于37、5%CO2无菌培育箱中培育，23d换液，%的胰酶消化传代。为幸免血清对实验的阻碍，待细胞长到70%80%成熟时换无血清DMEM培育液行 Celecoxib干与。干与分为Celecoxib量效关系组和时效关系组，每组4皿。Celecoxib量效关系组每皿别离给予Celecoxib 0、10、20、40mol/L，12h后裂解细胞提

8、取蛋白；Celecoxib时效关系组每皿别离给予20mol/L的Celecoxib，别离在0、六、1二、24h裂解细胞提取蛋白。每皿在裂解细胞前先留取适量培育上清液，用于做ELISA检测PGE2含量。 ELISA检测培育上清液中PGE2 搜集Celecoxib干与各个不同浓度点和时刻点的细胞培育上清液，取上清液加入1N HCl ，离心10min，搜集上清液再加入 NaOH 以中和酸性化了的样品。把100l的标准品或样品别离加入相应孔中，余下操作步骤按PGE2 ELISA试剂盒要求进行。在酶联免疫检测分析仪上测定OD492nm值，不加样品的孔作为空白对照孔用于调零，每一个标准品和样品均设置复孔，

9、实验重复3次。 Western blot测量survivin表达 提取蛋白后4低温超速（13 000r/min）离心，留取上清液，用考马斯亮蓝G250法测定每一个样品的总蛋白含量。分离胶浓度为12%，积层胶浓度为5%；每一个加样孔的蛋白上样量为100g。电泳时，积层胶为80V 30min，分离胶为120V 60min。电泳后制“三明治”行湿性转膜12h。5%PBS脱脂奶粉封锁液封锁3h，PBS液清洗3次，每次15min；一抗孵育2h（survivin一抗按1：200稀释），清洗3次，每次15min；二抗反映50min（二抗按1：3 500稀释），清洗3次，每次15min，ECL显影。 MTT检

10、测细胞凋亡情形 为了确信Celecoxib是不是通过PGE2途径阻碍细胞的凋亡，96孔培育板中除设置Celecoxib量效关系组和时效关系组外，还相应设置了Celecoxib+PGE2量效和时效关系组。每一个浓度点和时刻点均种4孔并设置对照，计算其OD值均值。每孔接种细胞8 000个，加入10%DMEM使整体积为200l，培育24h细胞贴壁后进行干与。Celecoxib量效关系组设0、10、20、40mol/L四个浓度点，别离用A1B1C1D1表示；Celecoxib+PGE2量效关系组设Celecoxib 0、10、20、40mol/L及PGE2 100pg/ml四个浓度点，别离用A2B2C

11、2D2 表示；干与12h后每孔加入MTT液20l(5mg/ml),震荡器震匀，继续培育4h后液体倒出拍干，每孔给予DMSO 150l 震匀10min，送酶联免疫检测分析仪中计算其OD490nm值。Celecoxib时效关系组设六、1二、24h3个时刻点，用B3C3D3表示，别离每孔别离给予Celecoxib 20mol/L； Celecoxib+PGE2时-效关系组设六、1二、24h3个时刻点，用B4C4D4表示，每孔别离给予Celecoxib 20mol/L及PGE2 100pg/ml；无干与对照时效关系组用B5C5D5表示；操作方式与量效关系组相同，别离在干与六、1二、24h后处置细胞进行

12、实验。 流式细胞检测细胞周期及凋亡 搜集不同浓度Celecoxib（0、20、40mol/L）处置12h后的A549细胞，%胰酶消化及PBS冲洗液，1 000r/min离心10min，-20预冷的80%乙醇固定，送北京鼎国生物实验室作细胞周期及细胞凋亡分析，实验重复3次。 统计学处置 计量资料均以xs表示，采纳统计软件包的t查验，P<为有显著性意义。 2 结 果 ELISA结果 Celecoxib对PGE2释放水平的阻碍：Celecoxib能够抑制PGE2的释放，这种抑制具有时刻效应和剂量效应：20mol/L的Celecoxib处置六、1二、24h PGE2水平别离为（）pg/ml，（）

13、pg/ml， （）pg/ml，与对照组（0h）（）pg/ml相较较，其不同有统计学意义（P值别离，）；10、20、40mol/L的Celecoxib处置PGE2水平别离为（）pg/ml，（）pg/ml，（）pg/ml，与对照组（0mol/L）（）pg/ml相较较，其不同也有统计学意义( P值别离，。 Western blot结果 如图1A、B，可见随着Celecoxib作历时刻的延长和剂量的增加，survivin表达的条带慢慢减弱（图1C为-actine参照），说明Celecoxib能够抑制survivin表达。 MTT结果（OD值） MTT实验结果显示，随着Celecoxib剂量的增加其OD

14、值如图2A：A1B1C1D1别离为， ，；A2B2C2D2别离为，不同有显著性（P），说明细胞凋亡显著增加，而且PGE2对其有明显的对抗作用；随着时刻的延长，也显现细胞增殖减少而凋亡明显增加，OD值如图2B：B3C3D3别离为 ，；B4C4D4别离为 ，；B5C5D5别离为 ，不同具有显著性（P），PGE2也显示了明显对抗Celecoxib的作用。说明Celecoxib能够诱导细胞凋亡而且是通过抑制PGE2的释放实现。 流式细胞检测结果 流式检测结果如图3所示，Celecoxib 20mol/L时G1/G0为，而40mol/L时G1/G0为，二者比较不同有显著性（P）；二者与对照组（G1/G0

15、 ）比较，不同有显著性（P），说明Celecoxib能够使细胞增殖阻滞于G1/G0期。 3 讨 论 Survivin基因是IAP家族的一个新成员，在各类人类恶性肿瘤细胞中均有不同程度的表达。Survivin要紧在细胞周期G2/M期表达,Survivin与活化的Caspase-3和Caspase-7结合，抑制凋亡通路下游的聚集点Caspase-3和Caspase-7,使Caspase超分子聚合体分离，从而抑制其活性，爱惜了关键的细胞周期调剂因子如p21wafl，从而抑制了细胞凋亡1。研究发觉2survivin能够和周期素依托蛋白激酶(CdK4)结合，形成survivin / CdK4复合体，使C

16、dK2/Cyclin E激活、Rb磷酸化，致使p21蛋白从CdK4解离。p21蛋白通过结合于G1期和S期的周期素依托蛋白激酶(cyclin D1-CdK4和cyclin E-CdK2)抑制其活性，使细胞增殖停留在G1期。Survivin使p21解离致使CdK4活化，细胞进入增殖周期，致使大量细胞无穷制生长，有利于肿瘤的发生。 与其他恶性肿瘤一样，肺癌的发生除与致癌物质直接致使细胞恶性转化有关外，与慢性炎症的长期刺激也有必然的关系（在大多数人类的恶性肿瘤中，都发觉了COX-2的高表达）。作为COX-2的选择性抑制剂，Celecoxib最近几年来被发觉具有抗肿瘤作用。目前,Celecoxib的作用

17、机制还不是很清楚，可能有以下几种途径：抑制PGE2的分泌，Sun等3发觉，Celecoxib对COX-2高表达的A549细胞有明显的抑制作用，并能使其分泌的PGE2减少，而对COX-2低表达者无明显抑制。激活外源性凋亡途径和凋亡聚集因子Caspase3和7Gargi 等4研究发觉Celecoxib能激活Caspase3和7并使细胞周期停滞在G0/G1期；Liu等5发觉，Celecoxib能够抑制肿瘤细胞存活，激活Caspase8并进而激活Caspase级联反映，从而启动外源性凋亡途径诱导肿瘤细胞凋亡。 尽管研究说明Celecoxib能够激活细胞凋亡途径及凋亡聚集因子Caspase3和7，可是其

18、具体的途径还不是很清楚。咱们的实验说明，Celecoxib能显著抑制肺癌A549细胞释放PGE2，明显下调survivin的表达，其程度与PGE2释放被抑制的程度呈正相关，而且这种下调具有明显的剂量依托性和时刻依托性。流式细胞检测结果说明，通过下调survivin的表达，A549细胞的增殖停留在G1/G0期；MTT实验结果说明，Celecoxib能显著增进A549细胞凋亡。说明Celecoxib能抑制PGE2释放并下调survivin的表达是其抑制肿瘤细胞的途径之一。【参考文献】 1 Shin S,Sung BJ, Cho YS, et al. An Aneli-apoptotic prote

19、in human survivin is a direct inhibitor of Caspase3 and -7J. Biochemistry, 2001,40(4): 1117-1123.2 Suzuki A,Ito T, Kawano H, et al. Survivin initintes procaspase 3/p21 complex formation as a result of interaction with Cdk4 to resist Fas-mediated cell death J. Oncogent, 2000,19(10): 1346-1353.3 Shi-Y

20、ong Sun, Claudia P, Schroeder, et growth inhibition and apoptosis induction in NSCLC cell by combination of Celecoxib and 4HRR at clinically relevant concentrationsJ. Cancer Biology and Therapy,2005,4(4):407-413.4 Gargi DB,Latha BP, Teresa LT, et underlying the growth inhibition effects of the cycle-oxygease-2 inhibitor celecoxib in human breast cancer cellsJ. Breast Cancer Res,2005,7(4):422-435.5 Xiangguo Liu,Ping Yue,Zhongmei Zhou, et al. Death receptor regulation and Celecoxib-induced apoptosis in human lung cancer cells J. Journal of the National Cancer Institute, 2004,96(23):1796-1780.