欧蒙抗心磷脂抗体LgG检测试剂盒酶联免疫吸附法说明方案完整版.docx
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欧蒙抗心磷脂抗体LgG检测试剂盒酶联免疫吸附法说明方案完整版
集团标准化办公室：
[VV986T-J682P28-JP266L8-68PNN]
欧蒙抗心磷脂抗体LgG检测试剂盒酶联免疫吸附法说明方案
抗心磷脂抗体LgG检测试剂盒（酶联免疫吸附法）说明书
【产品名称】抗心磷脂抗体LgG检测试剂盒（酶联免疫吸附法）
【通用名称】Anti-CardiolipinELISA（lgG）
【包装规格】
订货号
靶抗原
lg类型
基质
规格
EA1621-9601G
心磷脂
lgG
包被抗原的微孔板
96xx01（96）
【预期用途】用于体外定量或半定量检测人血清或血浆中抗心磷脂抗体lgG。
适应症：
抗磷脂综合症
临床意义：
与抗心磷脂抗体相关的临床并发症统称为抗心磷脂综合症：
静脉和动脉血栓形成、血小板减少症、自发性流产、死胎和早产、中枢神经系统症状（包括头痛到大脑血栓形成等各种症状）、骨坏死的早期体征、肺高压。
抗心磷脂抗体见于50%的系统性红白狼疮患者和约5-40%的其他系统自身免疫异常患者（类风湿性关节炎、硬皮病、干燥综合症、夏普综合症等）。
抗心磷脂抗体阳性的患者有发展为静脉和动脉血栓的危险（高浓度抗心磷脂抗体的患者发病风险约为80%）。
自发性流产、死胎和早期患者经常可检抗心磷脂抗体，与是否存在自身免疫性疾病的征状无关。
但系统性红白狼疮患者更容易出现孕期并发症（达77%），可能的原因包括静脉血栓形成所致子宫内梗死。
心肌或大脑死后检测出高浓度的抗心磷脂抗体预示出现其他血管并发症的危险率增高，也是梗死后病情和预后监测的指标。
抗心磷脂抗体可有lgA、lgG或lgM亚型，诊断价值最高的是高浓度的lgG抗体，但很多患者血清中可检测出lgA和lgM型抗心磷脂抗体。
才外，有证据表明高浓度的抗心磷脂lgG型抗体与血小板减少症高度相关，而高浓度的抗心磷脂lgM型抗体和溶血性贫血高度相关。
【检验原理】试剂盒中每个微孔板条有8个可拆分的包被有心磷脂的微孔。
第一次温育时，稀释后的样本在微孔中反应。
在很多情况下，抗心磷脂抗体识别抗原需要血浆蛋白（β2-糖蛋白1）作为辅助因子，为此，反应体系必含有这一辅助因子，如果样本阳性，特异性lgG（包括lgA和lgM）与抗原相结合，为了检测结合的抗体，可加入发生颜色反应的酶标抗人lgG抗体（酶结合物）进行第二次温育，然后加入酶底物，发生颜色反应。
【主要组成成分】
成分
颜色
规格
标识
1、微孔板：
包被有抗原的微孔板条12条，每条有8个可拆分的微孔，直接使用
----
12x8
Strips
2、标准品1:
120PL-lgG-U/ml（人），直接使用
深红
1x2.0ml
Cal1
3、标准品2:
12PL-lgG-U/ml（人），直接使用
红色
1x2.0ml
Cal2
4、标准品3:
2PL-lgG-U/ml（人），直接使用
浅红
1x2.0ml
Cal3
5、阳性对照：
（lgG,人），直接使用
蓝色
1x2.0ml
Poscontrol
6、阴性对照：
（lgG,人），直接使用
绿色
1x2.0ml
Negcontrol
7、酶结合物：
过氧化物酶标记的（兔）抗人lgG，10倍浓缩
绿色
1x1.5ml
Conjugate
8、样本缓冲液：
含β2-糖蛋白1，直接使用
黄色
1x100ml
Sampllebuffer
9、清洗缓冲液：
10倍浓缩液
无色
1x100ml
Washbuffer10x
10、色原/底物液：
TMB/H2O2，直接使用
无色
1x12ml
Substrate
11、终止液：
0.5M硫酸，直接使用
无色
1x12ml
Stopsolution
12、产品说明书
-----
13、靶值参照表
------
1、不同批号试剂盒内的酶结合物、样本缓冲液、清洗缓冲液、色原/底物液和终止液可互换。
【储存条件及有效期】2-8℃保存，不要冰冻。
未开封前，除非特别说明，试剂盒中各成分自生产之日起可稳定1年。
1、包被有抗原的微孔板：
自第一次开封后，抗原包被的微孔板在干燥的2-8℃的环境中保存至少4个月。
2、酶结合物：
稀释后的酶结合物必须在稀释后的4小时内试用。
3、清洗缓冲液：
稀释后的缓冲液于2-8℃最多可稳定一个月。
【样本要求】
样本：
人血清或EDTA、肝素、柠檬酸盐抗凝的血浆。
稳定性：
待测样本在2-8℃可以保存14天，已稀释的样本必须在当天检测。
样本稀释：
血清和血浆样本用样本缓冲液1:
201稀释，例如，可取5ul血清用1.0ML样本缓冲液稀释并混均（加样枪不适合混均）。
注意：
标准品和对照品已经稀释，请勿在稀释。
【检验方法】
试剂准备和稳定性
注意：
所有试剂在使用前均在室温（18-25度）平衡30分钟。
从第一次使用起，实际在2-8℃保存并无污染的情况下，可稳定至所标示的有效期。
-抗原包被微孔：
直接使用，在外包装密封线咬合部的上段剪开保护袋，为防止板条受潮，只有当微孔板平衡到室温后才可以打开包装。
剩余的孔应立即放回保护袋并封好（保存干燥剂）、从第一次打开保护带起，抗原包被的微孔可在干燥的2-8℃的环境中至少保存4个月。
-标准品和对照血清:
直接使用，使用前应充分的混匀。
-酶结合物：
10倍浓缩，使用前应充分混匀，用干净的吸管吸取需要量的酶结合物用样本缓冲液1:
10稀释，如：
需温育一条微孔板条。
则可取0.1ml浓缩酶结合物用0.9ml样本缓冲液稀释。
已稀释的酶结合物必须在4个月内使用。
-样本缓冲液：
直接使用
-清洗缓冲液：
10倍浓缩。
如果浓缩清洗缓冲液中出现结晶，稀释前应加热到37度并充分混匀溶解。
用干净吸管从瓶中吸取需要量的浓缩清洗缓冲液用蒸馏水1:
10稀释（1份浓缩清洗缓冲液加9份蒸馏水）。
如：
需清洗一条微孔板，则可取5ml浓缩液清洗缓冲液用45m蒸馏水稀释。
稀释后的缓冲液于2-8℃最多可稳定一个月。
-色原/底物液：
直接使用。
因内容物对光明感，试用后应立即盖好瓶盖。
色原/底物液应为无色澄清，如果变蓝，则不要使用。
-终止液：
直接使用。
操作流程
半定量检测时，标准品2与阳性对照，阴性对照及患者样本一起温育，定量检测时，标准品1、2、3与阳性对照，阴性对照及患者血清一起温育。
样本温育：
按加样方案向相应的微孔分别加100ul标准品、阳性对照、阴性对（第一步）照或稀释后的样本，室温（18-25℃）温育30分钟。
清洗：
手工：
倒掉微孔板内的液体，用稀释后的清洗液洗3次，每次300ul。
自动：
用稀释后的清洗缓冲液清洗三次，每次450ul程序设定：
如TECAN洗板机可设置为“OVERFLOWMODUS”
每次清洗时缓冲液在微孔中至少保留30-60秒，然后在倒掉。
清洗后（包括人工和自动）
应将微孔板倒置在吸水纸上拍打，以去除残留的清洗液。
注意：
清洗后遗留在微孔中的残夜（＞10ul）可干扰底物反应而导致吸光度值偏低。
清洗不充分（如少清洗少于3次，清洗液太少或清洗液清洗时间太短）可能导致吸光度值偏高。
微孔反应板条上的空位应添上与测定的微孔反应同规格的空反应微孔。
酶结合物温育：
滴加100ul酶结合物至每一个微孔，室温（18-25℃）温育30分钟。
清洗：
倒掉微孔板内的液体，如上述步骤清洗。
底物温育：
滴加100ul色原/底物液至每一微孔，室温（18-25℃）避光温育15分钟。
终止反应：
以与加色原/底物液相同速度和顺序滴加100UL终止液至每一微孔。
比色：
450nm比色，参考波长620-650nm，加完终止液后30分钟之内比色，比色前，轻轻振动微孔板以使液体扩散均匀。
加样方案
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A
C2
P6
P14
P22
C1
P4
P12
P20
B
POS
P7
P15
P23
C2
P5
P13
P21
C
NEG
P8
P16
P24
C3
P6
P14
P22
D
P1
P9
P17
POS
P7
P15
P23
E
P2
P10
P18
NEG
P8
P16
P24
F
P3
P11
P19
P1
P9
P17
G
P4
P12
P20
P2
P10
P18
H
P5
P13
P21
P3
P11
P19
1-4微孔板条加样方案是对24份患者样本（P1-P24）进行半定量检测的示例。
7-10微孔板条加样方案是对24份患者样本（P1-P24）进行定量检测的示例。
标准品（C1-C3）、阳性对照（POS）、阴性对照（NEG）和患者样本（P1-P24）各在孔中温育。
没分样本复孔检测可提高实验性的可靠性。
每一微孔可从板条上取下，这样可根据样本的数量选择试剂的用量，减少试剂的浪费。
阳性和阴性对照为实验可靠性的内部对照，每次试验都必须做。
【参考范围】用本检测系统检测了406份健康献血员工血清中国抗心磷脂lgG抗体水平，以12PL-lgG-U/ml作为临界值，所有献血员工血清抗心磷脂lgG抗体阴性。
临界值
百分百
2.8GPL/ml
95
3.1GPL/ml
98
3.7GPL/ml
99
【检验结果的解释】
半定量：
按照以下公式计算对照血清或者患者样本吸光度值和标准品2吸光度值的比值，通过比值半定量的判断结果：
比值=对照或者患者样本的吸光度值
标准品2的吸光度值
欧蒙建议按照以下原则稀释结果：
比值＜1.0：
阴性
比值≥1.0：
阳性
定量检测：
分别以3份标准血清的浓度（相对单位数）和气吸光度为横纵坐标（线性/线性）以点对点的方式做标准线，并根据标准曲线点对点以求出患者血清中的抗体浓度。
下图仅为一典型标准曲线的示例，不能用于计算患者样本中抗体浓度。
曲线图
如果患者样本的吸光度超出了标准品1的值（120PL-lgG-U/ml），结果为大于120PL-lgG-U/ml，建议将样本1:
800稀释后重新测定，从标准曲线计算出的数据再乘以4即为赝本中的抗体的浓度。
欧蒙推荐的正常范围的上限（CUT-OFF）为12PL-lgG-U/ml。
欧蒙推荐对实验结果做如下解释：
＜12PL-lgG-U/ml：
阴性
≥12PL-lgG-U/ml：
阳性
复孔检测应取两孔检测结果的平均值进行计算。
如果两孔间的值相差过大，应重做试验。
应结合病人的临床症状和血清学检查结果进行诊断。
【产品性能指标】
定标：
标准品采用国际人标准血清（LouisvilleAPLDiagnostics,USA）订标，标准品单位为PL-lgG-U/ml。
1PL-lgG-U/ml定义为经亲和层析从标准血清（Harriset.al1987）纯化得到的1ug/ml抗心磷脂lgG抗体结合心磷脂的活性。
每一组实验，标准品的吸光度和阳性对照、阴性对照的单位和/或比值必须在相应批号试剂的参考范围内，试剂盒附有靶值参照表。
如果实验结果超出额定范围，则说明实验结果不准确，应重做。
所用酶的活性与温度有关，如果不使用恒温器，吸光度值会有所不同。
底物温育时室温（18-25℃）越高，吸光度值越高。
温存时间不同也会引起同样的差异。
但因标准血清会收到同样的影响，这种差异在计算结果时会在很大程度上得到补偿。
抗原：
心磷脂为带负电磷脂，呈高浓度位于线粒体内膜（在九种已经线粒体抗原分型中属M1型），磷脂包含磷酸酯，一侧为甘油衍生物，另一侧为丝氨酸、胆碱、乙醇氨、肌醇或甘油。
甘油衍生物包含二个带有不同数目或长度的双结合键脂肪酸。
甘油衍生物与脂化磷酸共同行程磷脂酸。
心磷脂的两个磷脂酸可与另一个甘油份子连接。
抗心磷脂抗体可能是一类密切相关但亲和力不同的抗带负电磷脂（如心磷脂、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇）抗体的一个亚型。
抗心磷脂抗体的一个亚群（约75%）识别抗原需要一种血浆蛋白（β2-糖蛋白I,GPI）作为辅助因子。
到目前为止还不清楚这类抗体是只识别GPI表位还是心磷脂表位，但已明确GPI只与带负电的磷脂反应，而不与中性的磷脂（如磷脂酰乙醇胺）反应。
线性：
通过检测高抗体浓度样本的稀释系列来研究该试剂的线性，本检测系统的线性范围为2120lgG-PL-U/ml
曲线图
检出限：
检出限的定义为阴性样本检测结果的均值加上3倍标准差，也就是所能检出抗体的最小滴度。
本检测系统的最低检出限为0.8lgG-PL-U/ml。
交叉反应：
由于磷脂结构的相同性，抗心磷脂抗体可与其他磷脂（磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰胆碱）反应，没有其他交叉反应。
干扰：
血红蛋白浓度为10mg/ml的溶血。
甘油三酯浓度为20mg/ml的脂血、胆红素浓度为0.4mg/ml的黄疸对检测结果没有干扰。
重复性：
通过检测3价不同抗体浓度的血清计算批内和批间的变异系数（CV）以确定该试剂的重复性。
批内检测的CV基于20次检测的结果，而批间的CV则基于不同6天、每天4次检测的结果。
批内重复性，n=20
血清
均值（PL-lgG-U/ml）
CV（%）
1
25
9.6
2
54
5.7
3
78
5.9
批间重复性，n=20
血清
均值（PL-lgG-U/ml）
CV（%）
1
26
10.4
2
54
11.4
3
79
8.5
阳性发生率和特异性：
21份APS患者血清中抗心磷脂抗体lgG的阳性发生率为67%。
对照血清盘（HIV/HBV或者HCV患者血清n=247:
健康献血者血清n=406）检测结果显示：
本检测系统的特异性为100%。
【注意事项】
警示：
（1）本检测试剂仅用于体外诊断。
（2）标准品和对照品的HBsAg、抗HCV、HIV-1和HIV-2抗体均为阴性。
但是，试剂盒中所有的组分都应被视作潜在传染源小心处理。
其中部分试剂含有毒性的叠氮钠，应避免接触皮肤。
废物处理：
样本、标准品、对照品和温育过的微孔板条必须作为潜在传染源处理，试剂盒中所有试剂的处理必须遵循官方规定。
【参考文献】
1、AshersonR.A:
A”primary”
2、AshersonR.A,Khamashta,M,A,Gil,A,et,al:
Cerebrovasculardieaseandantiphospholipidantibodierinsystermiclupuserythematosus,lupus-likediease,andtheprimaryantiphospholipidsyndrome.Am,J,Med,86:
391-299（1989）.
3、:
35:
83-88（1991）.
4、recurrentcardiovascularevents.Lancet:
113-115（1986）.
5、radioimmunoassayandassociationwiththrombosisinsystemiclupuserthematosus.Lancet:
1211-1214（1983）.
6、umatol.2:
47-51（1984）.
7、Peti,M.,Rhenschmidl,M,.
8、hancescardiolipinbindingactivitybutisnottheantigenforantiphosphlipidantibodies.B4.J.Haematol.82:
565-570（1992）.
9、
10、[生产企业]
11、生产企业名称：
欧蒙医学试验诊断股份公司
12、Manufacturer`snamen:
EUROIMMUNMedizinischeLabordiagnostikaAG
13、地址：
德国，吕贝克，D-23560,Seekarnp?
31
14、Address:
D-23560,Lubeck,Seekamp31,Germany
15、电话：
（Tel）：
0451-5855-0?
传真（Fax）：
0451-5855-591
16、E-Mail：
网址：
17、
18、售后服务单位名称：
北京欧蒙生物技术有限公司
19、地址：
北京市朝阳区北辰东路8号院1号楼19层1901-1907?
邮政编号：
100101
20、电话：
传真：
21、E-Mail：
网址：
22、
23、[医疗器械注册证书编号]国食药监械（进）字2011第2401856号
24、
25、【产品标准编号】YZB/GEM?
1095-2011
26、
27、【说明书批准及修改日期】
28、版本号：
EA_1621G_A_CN_C03
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