东才生物实验操作手册.docx

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东才生物实验操作手册

细胞培养

试剂及仪器

PBS（4℃保存）、培养基（4℃保存）、0.25%胰蛋白酶（－20℃保存）、胎牛血清（－20℃保存）、封口膜、无菌枪头（白、蓝）、试管（10ml）、EP管盒、培养瓶、口罩、手套、帽子、培养皿（培养细胞和分离组织）、离心管、冻存管、过滤器、注射器、超净工作台、CO2培养箱（5%，维持PH值）、普通冰箱（培养用液、临时用血清、消化液）、-20℃冰箱（血清、酶类、抗体、药品）、离心机（沉淀细胞）、电热鼓风干燥箱（烘干、灭菌）、压力蒸气消毒器、恒温水浴箱（56℃×30min，灭活血清中的抗体）、倒置显微镜（观察细胞状态）、普通显微镜（细胞计数）、电子称、液氮灌。

仪器处理及试剂配制

1、123°C高压灭菌30min（枪头、试管），然后放入电热鼓风干燥箱烘干过夜。

2、培养基内加入10%胎牛血清。

3、培养基中加入1%双抗。

4、瓶口、瓶盖、镊子等使用前、使用后要在酒精灯上过火。

注意事项

1、实验前检查培养箱温度和CO2浓度。

2、检查CO2瓶压力和剩余量。

3、临走时请确认关闭倒置显微镜。

4、血清可中和胰蛋白酶。

5、所有离心操作要用封口膜封口。

操作步骤

组织细胞取材

1、常规处死动物（小白鼠断椎、大鼠吸入乙醚、兔子空气栓塞）。

2、浸泡在75%酒精中。

3、解剖动物，用剪刀剪开皮肤，换一把剪刀取组织（取软骨保持其关节腔完整，周围带有软组织）。

4、组织放入超净工作台。

5、PBS洗涤2~3次。

6、换一把小剪刀，解剖出软骨组织（髋关节软骨帽）。

7、用剪刀剪碎至1mm3左右。

8、加入0.25%胰蛋白酶（5~6倍量）。

9、放入37℃水浴锅内或培养箱中消化（消化过程中间歇摇晃）。

10、待组织块疏松、色变白。

11、100目孔径过滤器过滤。

12、滤液移入离心管。

13、离心管用封口膜封口。

14、离心800~1000rpm×5min。

（平衡、盖离心机盖子）

15、弃去上清液。

16、加入培养液。

17、细胞计数。

18、稀释至50万/ml。

19、移入培养瓶。

20、瓶口喷75%酒精消毒。

21、确认培养瓶盖已拧松。

22、放入CO2培养箱培养。

23、24h后倒置显微镜下观察细胞贴壁情况。

细胞换液与传代

1、查看酒精棉球是否够用。

2、75%酒精擦拭超净工作台。

3、准备封口膜和废液缸放入超净工作台。

4、从－20℃冰箱中取出胰酶，放在培养箱中融化。

5、取出PBS、培养基放在超净工作台。

6、打开超净工作台紫外灯，照射30min~60min。

7、打开细胞房紫外灯，照射30min~60min。

8、关闭细胞房紫外灯。

9、关闭超净工作台紫外灯。

10、打开超净工作台照明灯，打开抽风。

11、点燃酒精灯。

12、75%酒精擦拭倒置显微镜。

13、取出培养瓶，拧开盖后直接倒去培养基。

14、取PBS液1ml洗后倾去。

15、加入胰蛋白酶1ml，放回培养箱中消化10min。

16、加入9ml培养基。

17、用1ml吸力吹打细胞。

18、分装入两个新的培养瓶，拧上盖子。

19、倒置显微镜观察细胞。

20、瓶口75%酒精喷雾消毒。

21、放回培养箱（盖子不要盖紧）。

22、收拾工作台，处理废物。

超超净工作台紫外灯消毒30min。

23、确认倒置显微镜已关闭。

种板与加药、固定

1、300μl每片。

2、培养箱中温育约5min。

3、加5ml培养基。

冻存与解冻

1、取冻存管。

2、DMSO。

组织总RNA提取

准备工作

试剂及仪器

DEPC水、瓶子（100ml）、封口膜、滤纸（一张+N条）、Trizol、氯仿、异丙醇、无水乙醇、无RNA酶枪头（蓝、黄）、无RNA酶EP管（1.5ml）、EP管盒、PCR管、眼科剪、镊子、匀浆机、口罩、手套、帽子。

仪器处理及试剂配制

1、180℃烤箱烘烤6小时：

瓶子（100ml）、眼科剪、镊子

2、提前一天进行编号转换并对两套EP管提前编号。

3、剪封口膜。

4、剪滤纸，并在紫外灯下照射。

5、临时配制75%乙醇：

按每个样本1ml×2次=2ml算（1体积DEPC水+3体积无水乙醇）。

注意事项

1、Trizol有毒，注意自我保护。

2、在75%乙醇中，RNA在4℃至少保存1周，－20℃至少保存1年。

3、注意环境要求流动性小，人员少。

4、最后加DEPC水溶解前，可将DEPC水先放在60℃温箱中温育，可加速溶解。

5、匀浆机最多可同时匀24管，离心机最多可离30管。

操作步骤

一、提抽

（一）组织抽提

1、组织从–80℃冰箱中取出待溶解。

2、取组织50mg于EP管（1.5ml）中。

3、加珠子8~10粒。

4、加入Trizol：

200μl。

5、封口膜封闭EP管。

6、置于匀浆机中（速度5，时间4min，4℃）。

7、取出后观察是否充分匀浆，如未充分匀浆，继续置于匀浆机中匀浆。

8、去除封口膜，再加入Trizol：

800μl。

（Trizol：

200μl+800μl=1ml）

9、室温静置10min（15℃~30℃）。

（二）细胞抽提

1、倒掉培养基，PBS洗，直接将1mlTrizol注入培养瓶（5×106~10×106），细胞刮子刮碎细胞。

2、或转入冻存管中冻存或直接进入分相操作（第10步）。

二、分相

10、在装有裂解物的EP管中加入200μl氯仿（为Trizol总体积的1/5）。

11、剧烈振荡30秒。

12、冰上静置＞10min（关键）。

13、离心：

12000rpm×15min，4℃（离心机盖盖子）。

分相为三层上层：

RNA（约为Trizol的60%）；水相层

中间：

DNA；

下层：

蛋白质（酚-氯仿）。

有机相

14、小心吸取上清液，转移至另一EP管中200μl×2次（或150μl~170μl×3次）。

1ml裂解物产生的上清液体积约为400μl（或400μl~600μl）。

有机相和中间层含有DNA和蛋白质，避免触及，宁少勿多。

三、RNA沉淀

15、加入与上清液等体积的异丙醇（约400μl）。

.

16、颠倒混匀。

17、室温下静置10min（20℃~30℃）。

（开烤箱至60℃，为第30步做准备）

18、离心：

12000rpm×10min，4℃（离心机盖盖子）。

19、小心弃去上清液（直接倒去上清液），避免振动RNA沉淀。

（RNA沉淀在EP管底的侧面形成，乳白色）

四、RNA清洗（清洗两次，去离子/盐）

20、离心管加入1ml预冷的75%乙醇（1mlTrizol至少加1ml乙醇清洗DNA）。

21、弹起RNA，使沉淀振荡起来。

22、室温9500rpm×5min，4℃（离心机盖盖子）。

23、小心弃去上清液（直接倒去上清液），避免振动RNA沉淀。

24、离心管加入1ml预冷的75%乙醇（1mlTrizol至少加1ml乙醇清洗DNA）。

25、弹起RNA，使沉淀振荡起来。

26、室温9500rpm×5min，4℃（离心机盖盖子）。

27、小心弃去上清液（直接倒去上清液），避免振动RNA沉淀。

28、倒置于滤纸上，并用滤纸吸乙醇，放置5min（＜10min，不可过干）。

29、加适量DEPC水50μl（25μl~200μl），保证RNA浓度＞1μg/μl。

30、温箱中60℃温育5min，混匀。

31、拿出后置于冰上。

（或置于–80℃冰箱中）

五、测RNA浓度和纯度

取1μl样本在光度计上测量。

OD260代表RNA的OD值，OD280代表蛋白质的OD值。

OD260/OD280：

＜1.8蛋白质污染

1.8~2.0理想范围

＞2.0RNA降解

六、调整RNA浓度

测得浓度（单位为：

ng/μl），加DEPC水调至相同浓度。

取总RNA量为1000ng（即1μg），逆转录过程中去除基因组DNA时变为总体积10μl。

1000ng/测得的浓度=应取RNA液的体积（保留至小数点后两位）

7μl－RNA液体积=应加水的体积（保留至小数点后两位）

应取RNA液的体积、应加水的体积均加入PCR管中，用于逆转录

RNA逆转录

准备工作

试剂及仪器

逆转录试剂盒、PCR管、无RNA酶枪头。

仪器处理及试剂配制

注意事项

操作步骤

1、基因组DNA的去除反应

逆转录反应体系（20μl）

试剂

使用量（μl）

②5×gDNAEraserbuffer

2μl

①gDNAEraser

1μl

TotalRNA

7μl

Totalvolume

10.0

反应条件

42℃2min（或者室温5min）

4℃

2、反转录反应

逆转录反应体系（20μl）

试剂

使用量（μl）

④5×primescript

buffer2

4.0

③Primescript

RTEnzymeMix1

1.0

⑤RTPimermix

1.0

上一步的反应液

10

⑥RnaseFreedH2O

4.0

Totalvolume

20.0

反应条件

37℃15min

85℃5s

4℃（或-20℃长期保存）

普通PCR

试剂及仪器

与实时定量的试剂可以共用，但不需要ROX，将0.4μl换成水即可。

步骤

配胶：

每一小块胶（1/4方格）需15ml左右，浓度1%~3%均可（每15ml加琼脂粉0.15g~0.45g），浓度越高，跑胶时间越长，相对较好。

LoadingBuffer:

PCR产物=1:

4~6，即每20μl的PCR产物加4μl左右LoadingBuffer。

每孔加样20μl左右上述混合物。

Maker加5μl左右。

胶孔对着负极（黑色）。

设定电压100V，电流不管，时间35分钟左右，胶浓度高时，适当延长时间，40分钟左右。

紫外观察按左起第2个按钮。

胶回收

准备工作

试剂及仪器

Axygenkit（bufferDE-A/B、bufferW1/W2、Eluent），准备60℃水浴，检查DE-B是否有沉淀，W2中加入无水乙醇。

仪器处理及试剂配制

注意事项

1、DNA不可长期暴露于紫外下，防损伤。

操作步骤

1、在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽表面液体并切碎，计算重量，论100mg重量为一个凝胶体积（100mg=100μl体积）

2、加入3个凝胶体积的bufferDE-A液（300μl），混合后68℃水浴，间断混合（2min~3min），至凝胶溶化（6min~8min），变为红色。

3、加入0.5个A体积的B液（150μl），混合均匀，若分享DNA片段＜400bp时，加入一个凝胶体积的异丙醇（100μl），变为黄色。

（混匀）

4、吸取上述步骤3中的混合液，转移至DNA制备管（2ml离心管）中，离心12000rpm×1min（2min）。

充滤液。

5、加入500μlW1，离心12000g×30s（2min），弃滤液。

6、加入700μlW2，离心12000g×30s（2min），弃滤液。

以同样的方法加700μlW2洗涤，离心12000g×30s（2min），弃滤液。

7、空转，离心：

12000g×1min（2min）。

8、将制备管置于1.5ml离心管中，加入25μl~30μlEluent或去离子水，室温静置1min，12000g×1min，洗脱DNA（水加热65℃）。

RT-PCR

准备工作

试剂及仪器

RT-PCR试剂盒（SYBRGREEN、ROX）、DEPC水、引物（ForwardPrimer+ReversePrimer）、目标基因PCR胶回收产物、无RNA酶枪头（蓝、黄、白）、无RNA酶EP管（1.5ml）、PCR管盒、PCR管、八联管、镊子、口罩、PE手套、小离心机（八联管用、EP管用）、旋涡机。

注意事项

1、SYBRGREEN和混MIX用的EP管，都需用锡泊纸避光。

2、所有操作在冰上进行。

3、引物定购回来时是干粉，一般按要求溶解至100μM保存，使用时需稀释至10μM。

但β-actin表达量很高，需稀释至1μM使用。

操作步骤

一、稀释标准曲线

1、取出我的百宝箱。

2、准备冰块。

3、取出（共有大EP管×7）DEPC水、目标基因PCR胶回收产物、RT-PCR试剂盒（SYBRGREEN、ROX）、引物（ForwardPrimer+ReversePrimer）、无RNA酶EP管一个（1.5ml）以及试验样本放于冰上。

4、准备10~12个PCR管，在PCR板上正向排好（从左到右）。

5、将板旋转180°，加DEPC水18μl。

6、再将板旋转180°，2μl胶回收产物于第1管，依次倍比稀释（加样、离心、弹匀、再离心、再弹匀、最后离心、取出2μl至下一管，稀释好的PCR管放在另一排，从右向左排列，最终是从左到右依次低浓度到高浓度排列）。

二、混MIX

7、按下表顺序混MIX。

实时定量PCR反应体系（20μl）

试剂

使用量（μl）

终浓度

H2O

SYBRPremixExTaqTM

6.8

10.0

1×

ROXReferenceDye（50×）

PCRForwardPrimer（10µM）

0.4

0.4

1×

0.2µM

PCRReversePrimer（10µM）

0.4

0.2µM

DNA模板（cDNA溶液）

2.0

Total

20.0

8、旋涡混匀并离心（两次）。

9、准备八联管于槽内，并置于冰上。

10、将槽旋转180°放置，加MIX液18μl。

11、再将槽旋转180°，先加标准曲线，再加空白对照和样本。

12、戴PE手套。

13、取出八联管盖并盖紧。

14、标记。

15、离心。

16、放另一槽内再压紧。

17、上机。

18、打开程序，设置基本参数（2、1、2、1）、plate、RUN、文件名等。

19、按加样顺序设定孔标记。

、

20、按加样顺序在在实验记录本上记录体系、反应条件、样本顺序、文件名等。

反应条件

95℃预变性30sec

95℃变性5sec

退火温度30sec

延伸温度30sec

同步RNA提取蛋白

1、取上清后，加300μl无水乙醇，混匀

2、室温放置3min。

3、离心：

4900rpm×5min，4℃。

4、上清至另一EP管中（编号）。

5、加1.5ml异丙醇，混匀。

6、室温放置10min。

7、离心：

12000rpm×10min，4℃。

8、弃上清。

9、

加2ml含0.3mol盐酸胍的95%乙醇，洗沉淀。

10、室温放20min。

×3

11、离心：

9500rpm×5min，4℃。

12、弃上清重复上步三次

13、弃上清。

14、加2ml盐酸胍（0.3mol）

15、放置20min。

16、离心：

9500rpm×5min，4℃。

17、弃上清。

18、加2ml无水乙醇。

19、放置20min。

20、离心：

9500rpm×5min，4℃。

21、真空抽干蛋白，沉淀5~10min。

22、1%SDS溶解。

23、反复吹打。

24、50℃温溶，使其完全溶解。

25、离心：

1000rpm×10min，4℃。

26、取上清。

27、－20℃保存。

注意事项

1、每30~50mg组织加1mlTrizol，保证体积不超过Trizol的10%。

2、每使用1mlTrizol至少用1ml75%乙醇洗涤。

3、DEPC水：

将纯水加入瓶中，加DEPC，浓度0.1%，放置过夜，高压。

4、75%乙醇，用DEPC水配制。

5、0.3mol盐酸胍的95%乙醇：

盐酸胍0.286g＋95%乙醇10ml.

6、1%SDS：

SDS1g＋双蒸水100ml

蛋白提取

试剂：

Western细胞裂解液（碧云天）、PMSF（蛋白酶抑制剂）、PBS、异丙醇、乙醇。

用品：

离心管、细胞刮、冰盒、EP管、滤纸、离心机（4℃）

操作步骤

1、溶解细胞裂解液，混匀，分装，-20℃保存。

2、配0.1MPMSF：

17.4mg+异丙醇：

1ml分装至EP管，-20℃保存。

3、预冷PBS洗三次，置冰上。

4、裂解液：

1ml+PMSF：

10ml→终浓度1mM

5、加入含PMSF裂解液，匀浆裂解。

6、离心：

12000rpm×10min，4℃。

7、上清移至EP管中，-20℃保存。

蛋白浓度测定

试剂：

BCA蛋白测量试剂盒（普利莱）

用品：

温箱、96孔板、酶标仪、冰盒

操作步骤

1、冰上裂解样本，BCA标准品。

2、配工作液（WR）A+B=50:

1。

3、稀释标准品，做标准曲线

4、样品或标准品：

25ml+WR：

200ml，加入96孔板，混匀。

5、温箱内60℃×30min（或20min）

6、冷却至室温，酶标仪570nm，OD测定（562nm读数）。

WesternBlot配液

WesternBlot配液

1、10%过硫酸铵

AP【0.5g】＋ddH2O【5ml】4℃保存1周。

2、30%丙烯酰胺一甲双丙烯酰胺（△PH＜7.0，温热利溶）毒！

！

！

Acr【29g】＋Bis【1g】＋ddH2O→【100ml】过滤，避光保存1个月

3、10%SDS

SDS【10g】＋ddH2O→【100ml】5℃水溶，溶解充分，室温保存

4、TEMED毒！

！

！

（神经毒性，临用时配制）

5、1.5MTrisHCl（PH=8.8）

Tris【18.15g】＋48ml1mol/HCl＋水→【100ml】4℃过滤

Tris【12.12g】＋ddH2O→混HCl调PH至6.8→【100ml】

6、1×电泳缓冲液（PH=8.3）

25mMTris，0.25M甘氨酸，0.1%SDS

Tris【3.03g】＋甘氨酸【18.77g】＋SDS【1g】→加ddH2O定容至【1000ml】

室温保存，可重复使用2~3次；可配10×贮存液

7、电转印缓冲液（PH=8.3）

甘氨酸39mM，Tris48mM，SDS0.037%，乙醇20%

甘氨酸【2.9g（14.4）】＋Tris【5.8g（3.03）】＋SDS【0.37g（0.5）】+甲醇【200ml（200）】→加ddH2O定容至【1000ml】

8、TBS（Tris25mM，NaCl0.15M）PH=7.64℃，N个月

Tris【3.0285g】＋NaCl【8.766g】→加ddH2O定容至【1000ml】

9、TBST（含0.05%Tween20的TBS）

TBS【500ml】＋Tween20【0.25ml】混匀

10、封闭液（含5%脱脂奶粉TBST）

奶粉【5g】＋TBST【100ml】4℃保存，使用时恢复至室温，一次性使用

11、丽春红染液

丽春红【0.5g】＋冰乙酸【1ml】＋H2O→【100ml】可重复使用

12、20%Tween20

Tween20【10ml】＋H2O→【50ml】混匀，4℃保存

13、10%甲醇

甲醇【3ml】＋H2O→【30ml】

WesternBlot步骤

1、清洗

玻板：

洗衣粉→自来水→10%PBS→自来水→无水乙醇（擦）→自来水→双蒸水→晾干

2、玻板：

检漏，滤纸吸干。

3、配12%分离胶。

7.5ml胶块：

水

2.45ml

1.6

30%Acr-Bis

3.0ml

2.0

1.5Tris（PH8.8）

1.9ml

1.3

10%SDS

0.075ml

0.05

10%AP

0.075ml

0.05

TEMED

0.004ml

0.002

注：

TEMED最后加，充分混匀，立即灌胶。

4、用枪吸胶，沿玻板放入。

胶升到红上缘即可。

然后在胶上小心注入水（慢），赶走气泡。

5、30min后水和胶之间有折线时，再等30min使胶充分凝固，倒过上层水，并用滤纸吸干。

6、配25%分离胶（3ml/胶）

水

2.1ml

30%Acr-Bis

0.5ml

1.0Tris（PH6.8）

0.38ml

10%SDS

0.03ml

10%AP

0.03ml

TEMED

0.03ml

7、加胶后，赶快插上1.5mm梳子，在浓缩胶凝固过程中要经常在两边补胶，30min后，竖直向上拔出梳子，取出胶条，吸干孔中的水。

8、将胶放入电泳槽（小玻板向内，大的向外，另一边加塑料板）。

9、加入电泳缓冲液，过内侧小玻板。

10、加样：

10~15μl，＜60μg。

11、电泳：

恒压60V×1h（打开电泳仪，先将电压调0，电流调到最大，然后启动电泳仪，调电压至60V）

12、待样本进入二胶分界线时，调120V×2h。

13、溴酚兰跑至2/3分离胶时，停止电泳。

14、转膜：

6张滤纸，2块海绵，1张NC膜（先在冰上泡30min，作记号），泡入转印缓冲液中泡30min（PVSF膜→先泡甲醇10min，无光膜之分）

15、“三明治”黑板（－）红板（＋）

黑板（－）

海绵

注：

上下滤纸不得接触

胶面滤纸＜胶大小

膜面滤纸＜膜大小

逐层赶走气泡

滤纸

胶

NC膜（光面对着胶）

滤纸

红板（＋）

海绵

16、切胶。

17、夹子放入转印槽中，4℃，恒流250mA，转印2小时。

18、NC膜蛋白朝上，剪去左下角，ddH2O中洗，10%甲醇浸泡1min。

于脱色摇床上，将膜用1×丽春红染5min。

ddH2O洗数次。

19、NC膜蛋白朝上，至封闭液中，2.5h，吸干（37℃），120rpm。

20、一抗以（脱脂奶粉）封闭液稀释，膜面朝下，37℃振2h，80~100rpm，4℃过夜。

21、回收一抗，4℃保存（一周），以TBST洗膜2次×10min，

TBS洗膜1次×10min。

22、二抗以封闭液稀释，蛋白面朝下，37℃振1.5h，80~100rpm。

23、洗膜同21。

24、DAB显色：

2ml蒸馏水＋2滴A混匀，再加2滴B和C，再次混匀，将此液体滴加到膜表面，避光显色