培养基无菌灌装工艺验证方案.docx
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培养基无菌灌装工艺验证方案
一、目的
二、范围与条件
三、职责与培训
四、验证项目
五、偏差
六、结论与建议
一、目的：
1.1验证目的：
通过培养基无菌生产工艺验证，证实无菌生产工艺过程的可靠性。
二、验证范围和条件：
2.1验证范围：
本验证方案适用于冻干粉针生产线（激素）培养基无菌灌装。
2.2验证条件：
培养基无菌灌装工艺验证是用与正常的实际生产工艺相同的条件和操作方法，在其他各个系统（诸如公用系统、无菌环境保持系统、设备验证等）验证工作完成的基础上进行的。
本方案必须在动力部门相关验证和冻干车间相关验证完成的条件下进行。
2.3按照《培养基灌装SOP》，在各个系统验证完成后，开始进行培养基灌装工艺验证。
工艺流程图：
30-35℃培养7天
每日进行颠倒振摇
2.4执行的标准操作规程：
严格按照冻干车间工艺SOP、设备SOP、卫生SOP、物料SOP、基础SOP执行操作。
三、职责和培训:
3.1验证小组成员和职责：
姓名
部门
负责项目
验证方案审核、实施、协调、并负责验证方案的培训
组织验证方案的数据检验和报告
验证方案监督、实施和在线监测
提出验证申请、起草验证方案，
组织实施验证、提供工艺支持
验证数据的汇总和分析
实施验证
实施验证
实施验证
实施验证
实施验证
3.2培训内容：
3.2.1培训目的：
为建立并保持良好的质量保证系统，应配备足够数量并具有适当资质的人员完成各项操作，所有人员应明确理解自己的职责，熟悉与之相关的GMP原则，并接受良好的培训。
3.2.2人员培训：
所有负责该验证操作的操作人员。
培训记录：
培训人
左兰义
培训时间
被培训人员
培养基无菌灌装工艺验证相关人员
培训内容
培养基无菌灌装工艺验证方案
培训人签字
被培训人签字
四、验证项目：
4.1批的选择：
冻干生产线的产品规格为，用7ml的西林瓶灌装2ml的培养基。
灌装大豆胰蛋白胨液体培养基（TSB）3批，批号为201406211、201406231、201406251，灌装装量为2ml。
为确保冻干机A、B每台不少于40000支，灌装数量为8万支需16.8万ml大豆胰蛋白胨液体培养基，灌装完毕后，先置23-28℃培养7天，再置30-35℃培养7天，每天观察培养基的微生物生长情况。
培养基灌装与培养基促生长试验同步进行。
4.2抑菌作用的避免:
培养基灌装使用促进微生物生长的培养基来挑战评估污染风险，因此抑菌因素应当在培养基灌装中予以考虑。
将培养基灌装的注射用水冷却至室温20-25℃配制，并在室温下保存培养基液体。
4.3合格标准：
灌装数量为80000支。
允许阳性量（瓶）
≤1（当有1支不符合标准时需调查，确定结果）
4.4控制点：
控制点
要求
培养基
胰酪胨大豆肉汤培养基
培养基浓度
本品30g，加1L注射用水
参加人员
所有冻干人员必须参加培养基灌装试验并且必须经过培训。
无菌区人员
9人
生产环境
模拟配制药液时间为最长时间6小时
模拟灌装药液时间为最长时间18小时
整个生产过程和最差条件下的无菌操作。
生产和取样用具
清洗干净后经干热或湿热灭菌进入无菌区
干热灭菌250℃，60分钟
湿热灭菌121℃，30分钟
灌装速度
25Hz
装量
2ml
灌装机精度
±2%
不良品丢弃处理
在灌装过程中，倒瓶、掉塞，密闭性不完整必须丢弃，予以剔除，将剔除的瓶子在生产结束后一并清出无菌区
接种量
≤100CFU
物料准备、储存过程
将配制培养基的注射用水冷却到室温（20℃～25℃），在室温下配制
培养基在储存容器中常温保存
灌装过程
灌装过程中不使用惰性气体
7ml西林瓶灌装2ml培养基，以保证足够量培养基用于微生物和西林瓶接触和培养
中间过程
对于模拟试验过程中消毒剂的使用，应该注意不能超出正常生产时的使用频率，不能将消毒剂直接接触到培养基上
冻干过程
灌装好的西林瓶放入冻干机，在模拟冻干过程中需要抽真空（500mbar，2次）引发箱体内空气流动，再通过无菌空气进入到箱体，达到箱体压力平衡，整个过程保证不得小于10小时。
保持温度在18℃
工艺控制点
所有操作过程中不允许出现不符合工艺纪律的行为
4.5培养基选择及检验：
4.5.1培养基选择：
选择适合广谱菌生长的大豆胰蛋白胨液体培养基（TSB）。
4.5.2培养基检验：
需要做培养基适用性检查试验。
培养基适用性试验所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌的生物特性。
菌液制备：
接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基上，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐培养基中，30-35℃培养18-24h，接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基上，20-25℃培养24-28h，上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液。
接种黑曲霉菌的新鲜培养物至改良琼脂斜面培养基，20-25℃培养5天，加入3-5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数小于100cfu的孢子悬液。
培养基接种：
取每管装量8ml大豆胰蛋白胨液体培养基8支，分别接种小于100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2支，另按上述方法接种对照培养基，每种菌各2支，同时培养3天，培养温度30-35℃；另取每管装量4ml的大豆胰蛋白胨液体培养基4支，分别接种小于100cfu白色念珠菌、黑曲霉菌各2支，另按上述方法接种对照培养基，每种菌各2支，同时培养5天，培养温度20-25℃，逐日观察并记录。
养基灵敏性试验记录：
单位（cfu）
品种
金黄色葡萄球菌
铜绿假单胞菌
枯草芽孢杆菌
生孢梭菌
样品检查结果
对照检查结果
对比率
培养温度
30-35℃
品种
白色念珠菌
黑曲霉菌对照
样品检查结果
对照检查结果
对比率
培养温度
20-25℃
统计人：
复核人：
结论：
日期：
4.6无菌灌装工艺验证：
4.6.1培养基的配制、过滤：
按照生产厂商的配制要求，在调配室以每30g大豆胰蛋白胨培养基加入1L注射用水搅拌溶解，并进行记录。
在灌装前配制能够满足8万支灌装的培养基。
培养基的前处理将5040g培养基溶于不锈钢小桶中，加入适量冷却后的注射用水（20-25℃），用不锈钢搅拌棒搅拌，将溶解完全的培养基溶液转移至调配罐中，补加注射用水至168000ml，打开自循环15分钟，从排水口取样200ml用于过滤前微生物检查。
整个调配过程和在稀配罐内存放时间相加不少于6小时。
达到时间后，打开药液泵经过两次终端过滤器，过滤至AB级储药罐内。
培养基过滤至储要罐内，直至全部灌装结束，时间控制为18小时。
所有在这一阶段进行的操作，包括取样、灌装、装量检查及调整等按实际生产模拟。
在运行过程中采用停车、模拟异常情况、换班等进行干扰操作。
4.6.2干扰因素：
4.6.2.1人为将灌装18小时整理为6个阶段，具体操作如下：
阶段
用时
具体操作
第一阶段
（灌装开始0小时-3小时）
1小时
灌装机无菌组装、卸塞、可见异物、
调整装量
40分钟
正常灌装
20分钟
模拟碎瓶过程，本次模拟大盘出瓶口处，对碎瓶进行清理
10分钟
可见异物、装量检查
40分钟
正常灌装
10分钟
模拟夹塞过程
第二阶段
（灌装开始4小时-6小时）
10分钟
可见异物、装量检查
40分钟
正常灌装
10分钟
模拟碎瓶过程，本次模拟灌装出口处，对碎瓶进行清理
1小时
此时停止灌装，B级区人员由B级更衣室出离开无菌区，对应数量的操作人员从B级更衣室进正常消毒、更衣进入无菌区形成人员更换过程
10分钟
可见异物、装量检查
40分钟
正常灌装
10分钟
模拟正常维修，维修后操作人员进行相应消毒
第三阶段
（灌装开始7小时-9小时）
10分钟
可见异物、装量检查
40分钟
正常灌装
10分钟
模拟接瓶盒满瓶过程，对接瓶盒进行清理
1小时
此时停止灌装，B级区人员由B级更衣室出离开无菌区，对应数量的操作人员从B级更衣室进正常消毒、更衣进入无菌区形成人员更换过程
10分钟
可见异物、装量检查
40分钟
正常灌装
10分钟
模拟正常维修，维修后操作人员进行相应消毒
第四阶段
（灌装开始10小时-12小时）
10分钟
可见异物、装量检查
40分钟
正常灌装
10分钟
模拟夹塞过程
1小时
停止灌装，模拟正常维修，维修后操作人员进行相应消毒
10分钟
可见异物、装量检查
40分钟
正常灌装
10分钟
模拟碎瓶过程，本次模拟压塞出口处，对碎瓶进行清理
第五阶段
（灌装开始13小时-15小时）
10分钟
可见异物、装量检查
40分钟
正常灌装
10分钟
模拟接瓶盒满瓶过程，对接瓶盒进行清理
1小时
此时停止灌装，B级区人员由B级更衣室出离开无菌区，对应数量的操作人员从B级更衣室进正常消毒、更衣进入无菌区形成人员更换过程
10分钟
可见异物、装量检查
40分钟
正常灌装
10分钟
模拟夹塞过程
第六阶段
（灌装开始15小时-18小时）
10分钟
可见异物、装量检查
40分钟
正常灌装
10分钟
模拟碎瓶过程，本次模拟大盘出瓶口处，对碎瓶进行清理
1小时
此时停止灌装，B级区人员由B级更衣室出离开无菌区，对应数量的操作人员从B级更衣室进正常消毒、更衣进入无菌区形成人员更换过程
10分钟
可见异物、装量检查
10分钟
模拟接瓶盒满瓶过程，对接瓶盒进行清理
40分钟
正常灌装至结束
4.6.3灌封期间实时数据监控：
4.6.3.1对进入B级灌封间的所有人员进行卫生及着装规范评估，评估合格才允许进入灌封间进行操作，进行评估的人员是所有进入灌封间的人员，包括灌封操作人员、QA人员和保全人员。
进入B级灌封间的操作人员卫生及着装规范评估表
恰当的着装和行为
评价结果
1.在进入外围洁净区时未化妆及佩戴饰物（如手表、戒指、耳环等）
2.不得将食物和饮料带入或存放在外围洁净区或更高级别洁净区
3.换洁净鞋，更换后应处于分隔线相对洁净一侧
4.佩戴护目镜和口罩，护目镜必须遮住双眼，口罩必须遮住鼻梁至下巴的部分
5.根据规程清洁双手
6.穿戴合适尺寸的无菌手套，确保穿戴后紧实，在手指处无空隙
7.检查头发是否全部被覆盖住，没有任何部分暴露
4.6.3.2培养基无菌灌装工艺验证的过程中沉降菌、浮游菌、人员卫生、表面微生物的检测：
在培养基无菌灌装工艺验证的过程中，进行沉降菌、浮游菌、人员卫生、灌装设备表面微生物的检测，与正常生产检测相同。
检测结果见报告。
标准：
项目
洁净级别
沉降菌
（cfu/小时）
浮游菌
（cfu/m³）
人员卫生
（cfu/点）
表面微生物
（cfu/点）
A级
<1
<1
<1
<1
B级
≤5
≤10
≤5
≤5
4.6.3.3灌封环境尘埃粒子监测：
按《环境监测SMP》操作。
4.6.3.4灌封间动态沉降菌检测：
按《环境监测SMP》操作。
4.6.3.5灌封间动态浮游菌检测：
按《环境监测SMP》操作。
4.6.3.6灌装时将配制好的培养基经2级0.22µm终端除菌过滤系统（终端过滤系统验证请详见其验证相关资料）后进行无菌灌装试验。
4.6.3.7全部样品装入冻干机18℃，冻干10小时后进行轧盖。
4.6.4试验样品培养
4.6.4.1将培养基无菌灌装工艺验证生产的全部样品颠倒振摇，先在20-25℃下培养7天（每天检查时对全部样品颠倒振摇），然后在30-35℃下培养7天（每天检查时对全部样品颠倒振摇），共培养14天。
规定培养期间内每天观察培养基的微生物生长情况，如果发现污染则明确记录样品号及数量，对于微生物污染的样品进行鉴别试验，鉴别的内容包括菌落、细胞学形态。
4.6.5培养基促生长实验：
灌装时间应包括整个生产过程和在最差条件下的无菌操作。
取灌装起始的12支接种枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌、黑曲霉菌作阳性对照。
每种菌株接种2瓶，每瓶接种量在100个活细胞以内，接种枯草芽孢杆菌的培养基在30—35℃下培养七天，接种白色念珠菌的培养基在23—28℃下培养七天，每种菌株在7天内应生长良好，否则实验失败。
如果失败，要进行调查并重新进行培养基灌装工艺验证。
各菌株接种温度如下：
试验菌株
培养温度（℃）
1
金黄色葡萄球菌
30～35
2
铜绿假单胞菌
3
枯草芽孢杆菌
4
生孢梭菌
5
白色念珠菌
23～28
6
黑曲霉菌
自培养之日起，分别在轧盖结束后14天内逐日对灌装瓶子进行翻转，以保证瓶子内部、胶塞，全部接触培养基，检查方式采用目测。
透明、澄清、无浑浊的培养基为无微生物生长，培养基浑浊或有悬浮的菌丝或菌落，则需作进一步的微生物生长检查以确定培养基是否真正染菌。
如确认染菌，应对污染菌进行鉴别试验。
4.6.5轧盖严密性检查方法
按照正常的培养基灌装程序进行灌装，目视检查后挑选一定数量的未污染瓶作为挑战瓶。
经剔除、轧盖后，在挑战瓶中挑选12瓶，接种10～100CFU的菌悬液，每种菌悬液1瓶正置1瓶倒置培养作为阳性对照。
将挑战菌株接种在不少于1000ml的大豆胰蛋白胨液体培养基中培养以制备试验菌悬液，要求加盖密封。
使用前菌悬液中挑战菌浓度不低于每毫升106CFU。
将其余挑战瓶24瓶倒置于试验菌悬液中（每种菌悬液中放4支），并应确保瓶身、瓶颈和瓶盖外表面浸没于菌悬液中并盖好容器盖子。
将浸没4小时的样品放入培养箱中培养7天，待到达培养时间后将样品、对照品及培养基菌悬液一同放入灭菌柜灭菌，灭菌完毕后，观察培养基状况浑浊或澄清，若澄清表明无菌，轧盖严密性测试通过。
检查结束后对以灭过菌的样品、对照品及培养基菌悬液进行处理。
4.7培养基无菌灌装验证数据汇总：
4.7.1培养基促生长试验数据汇总：
批号
201406211
201406231
201406251
培养
温度
支数
1
2
1
2
1
2
金黄色葡萄球菌
30～35℃
铜绿假单胞菌
枯草芽孢杆菌
生孢梭菌
白色念珠菌
23～28℃
黑曲霉菌
统计人：
复核人：
结论：
日期：
备注：
阳性（+）阴性（—）
4.7.2进入B级洁净区人员卫生和着装规范评估汇总：
批号
201406211
进入洁净区人员时间、姓名和卫生、着装是否符合规定
人员姓名
着装和行为评价结果
批号
201406231
进入洁净区人员时间、姓名和卫生、着装是否符合规定
人员姓名
着装和行为评价结果
批号
201406251
进入洁净区人员时间、姓名和卫生、着装是否符合规定
人员姓名
着装和行为评价结果
统计人：
复核人：
结论：
日期：
年月日
4.7.3无菌灌装培养情况汇总：
批号
201406211
201406231
201406251
培养支数
培养温度
20～25℃
第1天
第2天
第3天
第4天
第5天
第6天
第7天
培养温度
30～35℃
第8天
第9天
第10天
第11天
第12天
第13天
第14天
结论
统计人：
复核人：
结论：
日期：
4.7.4严密性检查试验数据汇总：
批号
201406211
201406231
201406251
培养温度
金黄色葡萄球菌
30～35℃
铜绿假单胞菌
枯草芽孢杆菌
生孢梭菌
金黄色葡萄球菌对照
铜绿假单胞菌对照
枯草芽孢杆菌对照
生孢梭菌对照
白色念珠菌
23～28℃
黑曲霉菌
白色念珠菌对照
黑曲霉菌对照
统计人：
复核人：
结论：
日期：
备注：
阳性（+）阴性（—）
五、偏差：
如在验证过程中出现偏差，应按照《偏差管理SMP》（编号：
SMP-QAJC005）调查偏差原因。
如是人员操作问题应重新培训再重新验证。
如是验证方案问题，应修订方案再重新验证。
六、结论与建议：
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